Die PDX hat die krebsexperimentellen präklinischen Studien revolutioniert. Wir können jetzt im Labor nachahmen, was bei den Patienten vor sich geht. Und jetzt können wir daran arbeiten, wie wir den Widerstand überwinden können und wie wir langfristig das Überleben der Patienten erhöhen können.
Demonstrierend wird das Verfahren Min Xiao sein. Um zu beginnen, übertragen Sie zuvor gesammeltes Melanomgewebe auf eine sterile Petrischale. Arbeiten mit chirurgischer Schere, Skalpellklinge und Zange, entfernen Sie zuerst normales Gewebe aus dem normalen Gewebe so weit wie möglich.
Und dann entfernen Sie das nekrotische Gewebe, das durch blasses weiß-ish Gewebe identifiziert wird, das sich zentral im Tumor befindet. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen anfänglichen Tumorbrocken in etwa gleiche Stücke für die chirurgische Mausimplantation zu unterteilen. Wenn das Tumorgewebe zu hart für die mechanische Dissoziation ist, verwenden Sie ein Skalpell, um die Tumorbrocken so fein wie möglich zu zerkleinern, um eine Gülle zu bilden.
Die Gülle in ein 50-Milliliter-Rohr mit kalter Hank es Balanced Salt Solution ohne Calcium- und Magnesiumionen geben. Zentrifuge bei 220 mal g für vier Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstandes, setzen Sie die Gülle in 10 Milliliter erwärmten, frischen Verdauungsmedien pro Gramm Tumorgewebe wieder auf.
Das Rohr 20 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad geben und alle fünf Minuten mit einer Einwegpipette kräftig vermischen. Waschen Sie die Gülle mit bis zu 50 MilliliterHBSS, Zentrifuge bei 220 mal g für vier Minuten bei vier Grad Celsius, und entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie fünf Milliliter vorgewärmten TEG-Puffer pro Gramm Tumorgewebe hinzu, schütteln Sie, um sanft wieder aufzuhängen, und legen Sie das Rohr zwei Minuten lang bei 37 Grad Celsius, ohne zu mischen.
Um das Trypsin zu löschen, fügen Sie mindestens ein gleiches Volumen von kalten Färbemedien und Zentrifuge bei 220 mal g für vier Minuten bei vier Grad Celsius hinzu. Nach dem Entfernen des Überstandes 10 Milliliter Färbemittel pro Gramm Tumorgewebe hinzufügen und das Pellet durch Pipetieren nach oben und unten wieder aufhängen. Filtern Sie es durch ein 40 Mikrometer-Zellsieb, um eine Einzelzellsuspension für die Mausinjektion zu erhalten.
Um chirurgische Exzision oder chirurgisches Biopsiegewebe zu implantieren, rasieren Sie zuerst Haare aus dem unteren Rücken von NSG sechs bis acht Wochen alte anästhesierte Mäuse, so dass eine etwa 1,5 Zentimeter bis drei Zentimeter Bereich ohne Haare. Bereiten Sie Tumorbrocken vor und teilen Sie Tumorschlämme in einem Petri in einzelne Hügel für die chirurgische Implantation auf. Mit einem Skalpellblatt, machen Sie einen etwa fünf Millimeter langen Schnitt auf der Mitte der Rückseite der Maus.
Mit einem Paar Zange, Leben bis die Haut auf der Seite des Schnittes gegenüber dem Bediener. Mit der Schere in der anderen Hand, trennen Sie die Haut von der Muskelschicht, indem Sie sanft schneiden Sie die Faszienmembran mit kleinen Scherenschnitten, wodurch eine Tasche für das Tumorgewebe. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um ein Tumorfutter sowie einen einzelnen Hügel aus Tumorschlämmgewebe aufzunehmen und das Gewebe vorsichtig in die erstellte Tasche zu legen.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter künstliche extrazelluläre Matrix auf dem Tumorgewebehügel in der Tasche. Ziehen Sie mit zwei Zangenpaaren den Schnitt an beiden Enden hoch, so dass die Wundkanten näher zusammenrücken. Wenden Sie dann ein oder zwei Wundclips an, um die Wunde zu schließen.
Subkutan injizieren ein bis fünf Milligramm pro Kilogramm Schmerzmittel. Wenn die Heilung vollständig ist, entfernen Sie nach etwa sieben Tagen die Wundclips. Überwachen Sie Mäuse einmal wöchentlich, um auf spürbare Tumore zu überprüfen.
Sobald Tumore ein gewünschtes Volumen erreichen, verwenden Sie chirurgische Zangen, um die Haut neben dem Tumor der eingeschläferten Maus zu heben und einen horizontalen Schnitt mit einer gekrümmten Schere zu machen. Verwenden Sie eine stumpfe Trenntechnik, um die Haut auf beiden Seiten des Tumors und über den Tumor zu mobilisieren und den Tumor freizulegen. Verwenden Sie eine Schere und eine Skalpellklinge, um den Tumor von der Faszie zu trennen.
Schneiden Sie den Tumor aus und übertragen Sie ihn in eine sterile Petrischale. Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke und entfernen Sie nekrotisches Gewebe aus dem Tumor. Um Tumorgewebe für die zukünftige Implantation zu überführen, nehmen Sie zwei bis drei kleine Tumorstücke und zerkleinern Sie sie in Stücke kleiner als eins mal ein Millimeter.
Übertragen Sie das gesamte gehackte Gewebe auf eine zwei Milliliter kryogene Abscheuliche. Fügen Sie einen Milliliter gefrierenden Mediums hinzu und mischen Sie gut. Legen Sie die Fläschchen in einen vorgekühlten Isopropanol-basierten Zellgefrierbehälter auf Trockeneis, lagern Sie den Behälter über Nacht in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius und übertragen Sie die Durchstechflaschen dann in die Flüssigkeitsstickstofflagerung.
Um Gefriergewebe für nachgeschaltete Tests zu schnappen, legen Sie die Tumorgewebestücke in eine kryogene Durchstechflasche, legen Sie den kryogenen Übelinfall sofort in flüssigen Stickstoff und lagern Sie die Fläschchen in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Wenn drei verschiedene Methoden des Wachsenden von Tumorgewebe verglichen wurden, war die einzellige Suspension von Tumorzellen mit der Anwendung der enzymatischen Verdauung am erfolgreichsten. Neben der Möglichkeit eines schnelleren Tumorwachstums reichte es auch aus, einen Anfangstumor auf 10 bis 20 Mäuse auszudehnt zu haben, während die Tumorfutter- und Güllemethode nur auf fünf bis zehn Mäuse erweitert werden kann.
Melanom-Patienten-abgeleitete Xenograft-Modelle spiegeln oft die Arzneimittelempfindlichkeit wider, die der Patient während der Therapie anzeigt. Ein Xenograft, das von Melanompatienten abgeleitet wurde, die zunächst auf einen BRAF-Hemmer angingen, aber letztlich zurückfielen, zeigte ebenfalls eine anfängliche Empfindlichkeit gegenüber BRAF-Proteinhemmung sowie MEK-Kinase-Inhibitor, aber die Tumore fielen schließlich zurück. Bei der Vorbereitung von PDX-Gewebe für das Bankwesen ist Vorsicht zu beachten, da dies den Erfolg zukünftiger PDX-Erweiterungen, Therapiestudien sowie Der Charakterisierung sicherstellen wird.
Mit PDX-Material gehören einzellige RNA-Sequenzierung, gesamte Exome-Sequenzierung und proteomische Charakterisierung zu den vielen Methoden, die unser Labor nutzt, um Therapieresistenzen zu sezieren. Die PDX-Technik ermöglicht es Forschern, Therapieresistenzen mit Tumorzellen zu untersuchen, die die Tumorbiologie bei einem menschlichen Patienten besser rekapitulieren, verglichen mit traditionellen Krebsmodellen, die auf Kunststoff angebaut werden. Dieser Vorteil ermöglicht vorausschauende Einblicke.
Forscher sollten immer vorsichtig sein und Biosicherheitsstufe zwei Vorsichtsmaßnahmen verwenden, wenn tumorgewebe von einem menschlichen Patienten abgeleitet behandelt wird.
