Das von Zebrafischpatienten abgeleitete Xenotransplantat ist ein leistungsfähiges präklinisches Modell zur Vorhersage des Chemosensitivitätsprofils von Krebspatienten in vivo. Das Protokoll beschreibt die Generierung des Modells ausgehend von einer chirurgischen Probe des Patienten. Durch die Xenotransplantation eines kleinen Gewebefragments, anstatt Zellen in Zebrafischembryonen zu isolieren, ist es möglich, die Tumormikroumgebung aufrechtzuerhalten, was der entscheidende Schritt für das Fortschreiten des Tumors und das Ansprechen auf die Chemotherapie ist.
Der große Vorteil des Modells liegt darin, dass es die Prognose des Patienten in einem klinisch relevanten Zeitrahmen von nur einer Woche vorhersagen kann und als Werkzeug für die personalisierte Medizin dient. Beginnen Sie die Probenbearbeitung, indem Sie das gesamte Tumorgewebe des Patienten mit fünf Millilitern frischem Tumormedium waschen. Pipettieren Sie es 10 Mal mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff auf und ab.
Saugen Sie das Waschmedium vorsichtig ab und entsorgen Sie es, bevor Sie den Waschvorgang dreimal wiederholen. Tauchen Sie die Probe in ein bis zwei Milliliter frisches Tumormedium. Schneiden Sie die Tumorprobe mit einer Skalpellklinge in ein bis zwei Millimeter große Würfelstücke und legen Sie sie dann in ein steriles Fünf-Milliliter-Kunststoffröhrchen mit Tumormedium.
Nachdem Sie den McIlwain Tissue Chopper auf eine Dicke von 100 Mikrometern eingestellt haben, legen Sie die Tumorstücke auf den runden Kunststofftisch des Häckslers und hacken Sie sie. Drehen Sie den Tisch um 90 Grad und wiederholen Sie das Hacken. Sammeln Sie die zerkleinerten Tumorfragmente in einem 15-Milliliter-Plastikröhrchen, das das Tumormedium enthält.
Zentrifugieren Sie die gehackten Tumorfragmente drei Minuten lang bei 300 G, bevor Sie sie absaugen und den Überstand verwerfen. Inkubieren Sie die Fragmente mit der Zellspurenlösung oder mit einem alternativen fluoreszierenden Zelltracker wie CM-DiI oder Deep Red für 30 Minuten in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Während der Inkubation resuspendieren Sie die Fragmente vorsichtig alle 10 Minuten.
Entfernen Sie am Ende der Färbung den freien Farbstoff, indem Sie ein Tumormedium hinzufügen, das mit mindestens 1 % Protein angereichert ist. Das Volumen beträgt das Fünffache des Färbevolumens. Zentrifugieren Sie die Fragmente bei 300 G drei Minuten lang und entsorgen Sie den Überstand.
Fügen Sie einen Milliliter der phosphatgepufferten Kochsalzlösung oder DPBS von Dulbecco hinzu und wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Wenn Sie fertig sind, hängen Sie die Fragmente in fünf Millilitern DPBS in einer 60-Millimeter-Petrischale. Um die auf Zebrafischen basierenden patientenabgeleiteten Xenotransplantate oder zPDX zu etablieren, werden die Embryonen zwei Tage nach der Befruchtung anästhesiert.
In einer Petrischale mit drei Agarosezylindern wird ein Zebrafischembryo auf einen Zylinder gelegt, der eine Seite freilegt. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, um den Embryo in einem dünnen Film zu halten. Übertragen Sie das Stück gefärbter Tumorgewebefragmente mit einer sterilen Pinzette aus einer 60-Millimeter-Petrischale auf den 1%-Agaroseträger, auf den der Embryo gelegt wird.
Nehmen Sie dann das Gewebe auf und legen Sie es auf das Eigelb des Embryos, bevor Sie es mit der wärmegezogenen Glasmikronadel in den perivitellinen Raum schieben. Geben Sie einige Tropfen E3 1%Penicillin Streptomycin in den Embryo, um ihn wieder in die Flüssigkeit zu bringen. Nachdem Sie die Implantation von Tumorgewebe in allen Embryonen wiederholt haben, entfernen Sie die Agaroseträger aus der Petrischale und inkubieren Sie die Embryonen bei 35 Grad Celsius.
Zwei Stunden nach der Implantation werden die Embryonen mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop auf die richtigen Xenotransplantate mit positiver Färbung überprüft. Verwerfen Sie tote Embryonen und die Embryonen ohne Tumorfragmente vollständig im perivitellinen Raum. Wenn Sie fertig sind, verteilen Sie die Embryonen nach dem Zufallsprinzip auf sechs Multi-Well-Platten, die gemäß dem Versuchsplan gleichmäßig in Gruppen aufgeteilt sind.
Verdünnen Sie die Medikamente, indem Sie sie in E3 1%Pen-Streptokokken mischen, um den FOLFOXIRI-Cocktail zuzubereiten. Entfernen Sie nach zwei Stunden der Implantation das Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie den Medikamentencocktail hinzu. Legen Sie die Embryonen drei Tage lang bei 35 Grad Celsius in den Inkubator, wobei das Medium täglich gewechselt wird, um die Medikamente zu erneuern.
Für die Bildgebung werden Bilder unter einem 40-fachen Objektiv des konfokalen Mikroskops aufgenommen. Verwenden Sie die Auflösung von 1024 x 512 Pixeln mit einem Z-Abstand von fünf Mikrometern. Die Gesamtbilder der zPDXs, die zur Analyse der in Cyano detektierten Apoptose aufgenommen wurden, zeigten, dass die kombinierte Therapie die Zellapoptose im Vergleich zur Kontrollgruppe erhöhte.
Die Fallstudie berichtete, dass für die mit FOLFOXIRI behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe ein statistisch signifikanter Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen in implantierten Xenotransplantaten festgestellt wurde. Das Protokoll zeigt ein Beispiel mit Bauchspeicheldrüsenkrebsgewebe, aber aus Zebrafischpatienten gewonnene Xenotransplantate können aus verschiedenen Krebsarten hergestellt werden. Da das Modell einen geringen ethischen Einfluss hat, ist es außerdem leicht für das In-vivo-Screening neuer Medikamente nutzbar.
Die Methode ist technisch anspruchsvoll und erfordert einen fachkundigen Bediener. Vorkenntnisse in der Manipulation von Zebrafischembryonen und der Mikroinjektion werden das Training der Technik beschleunigen.
