Derzeit wird die Immunhistochemie immer häufiger eingesetzt, um das Vorhandensein spezifischer molekularer Marker und deren Veränderungen im Falle von Pathologien zu identifizieren, was der Möglichkeit, quantitative Analysen durchzuführen, die Wurzel gibt. Die Immunhistochemie, hauptsächlich die Immunfluoreszenztechnik, wird im Larven- und Erwachsenen-Zebrafisch-Tiermodell verwendet, aber über ein gutes Standard-Immunhistochemieprotokoll für Zebrafische ist wenig bekannt. Hier beschreiben und veranschaulichen wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um die evolutionäre Konservierung wichtiger Proteine bei erwachsenen Zebrafischen zu untersuchen.
Ein gutes Protokoll für die Immunhistochemie bei erwachsenen Zebrafischen kann dazu beitragen, die Nützlichkeit dieses Tiermodells zu unterlegen, um die morphologische Expression und Verteilung hochkonservierter Biomoleküle zu untersuchen. Diese Methode kann auch helfen, mögliche Veränderungen dieser Biomoleküle aufgrund pathologischer Bedingungen zu analysieren, die mit der menschlichen Physiopathologie korreliert sind. Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Lea Tunisi, einer Doktorandin aus meinem Labor.
Um dieses Verfahren zu beginnen, übertragen Sie die vorbereiteten gefrorenen Gewebeblöcke auf einen Kryostat bei minus 20 Grad Celsius. Schneiden Sie den Block in koronare oder sagittale Abschnitte von 10 Mikrometern. Dann sammeln Sie die Gewebe in alternativen seriellen Abschnitten auf Klebeglasrutschen geeignet für die Immunhistochemie, und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, bis sie bereit sind, fortzufahren.
Verwenden Sie zunächst einen lösungsmittelbeständigen Stift, um den Gewebebereich auf dem Dia abzugrenzen. Spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molar-Phosphatpuffer. Als nächstes lösen Sie 0,3 Milliliter Triton X-100 in 100 Milliliter 0,1-Molarphosphatpuffer auf, um Triton X-100 0,3%Auflösen von 0,1% normalem Eselsserum in einem Phosphatpuffer mit 0,3% Triton X-100 vorzubereiten, um die Blocklösung vorzubereiten.
Inkubieren Sie die Abschnitte mit der Lösung des normalen Eselsserums, das im Permeabilisationspuffer PB-Triton X-100 0,3% für 30 Minuten bei Raumtemperatur gelöst wird, um die Zellmembran zu permeabilisieren und die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren. Erstens spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molar-Phosphatpuffer. Fügen Sie die Mischung der primären Antikörper in PB-T verdünnt, und inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht in einer feuchten Box bei Raumtemperatur.
Am Tag danach spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molarphosphatpuffer aus. Inkubieren Sie Abschnitte bei Raumtemperatur für zwei Stunden in einer geeigneten Mischung von sekundären Antikörpern in PB-T verdünnt. Zu Beginn spülen Sie die Abschnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,1-Molar-Phosphatpuffer aus.
Lösen Sie 1,5 Mikroliter DAPI in drei Milliliter Phosphatpuffer, um den Kernfarbstoff DAPI vorzubereiten. Gegenstain die Abschnitte im Farbstoff. Verwenden Sie dann Montagemedium, um die Rutschen zu bedecken, um das Gewebe und den Fleck für den langfristigen Gebrauch zu stabilisieren.
Fluoreszierende Proben können im Dunkeln bei vier Grad Celsius gelagert werden. Wiederholen Sie das Immunfluoreszenzprotokoll, und lassen Sie entweder den primären oder sekundären Antikörper aus, oder ersetzen Sie das primäre oder sekundäre Antiserum durch einen Phosphatpuffer, um die negative Kontrolle vorzubereiten. Als Nächstes wiederholen Sie das Immunfluoreszenzprotokoll und absorbieren Sie jeden primären Antikörper mit einem Überschuss des relativen Peptids.
Wiederholen Sie das Immunfluoreszenzprotokoll auf Scheiben des Maushirns, um die positiv efegene Kontrolle vorzubereiten. Mit einem konfokalen Mikroskop, das mit einer motorisierten X-Y-Z-Bühne, einer Digitalkamera sowie einer Erfassungs- und Analysesoftware ausgestattet ist, beobachten und analysieren Sie die immunbefleckten Abschnitte. Erfassen Sie digitale Bilder mit den 5x- und 20x- und 40x-Objektiven.
Nehmen Sie Bilder von jedem Abschnitt mit geringer Vergrößerung in jedem der verfügbaren Kanäle auf, um eine Montage mit geringer Vergrößerung zu komponieren. Normalisieren Sie die Fluoreszenzbilder auf maximalen Kontrast und Überlagerung. Sammeln Sie im gesamten Interessengebiet serielle Z-Stacks von Bildern durch sechs Brennebenen mit Brennschritten von einem bis 1,8 Mikrometern.
Führen Sie diese Auflistung für jeden Kanal separat aus. Verwenden Sie anschließend die Bildverarbeitungssoftware, um Bilder durch Anwendung von 10 Iterationen zu dekonvolvenieren und die seriellen Z-Ebenenbilder in ein einziges maximales Projektionsbild zu reduzieren. Verwenden Sie eine geeignete Bildbearbeitungssoftware, um die Mikrographen auf Licht und Kontrast einzustellen.
Die immunhistochemische Analyse der OX-A- und OX-2R-Verteilung im Darm erwachsener Zebrafische zeigt verschiedene Lokalisationsstellen von OX-A und OX-2R und deren Expressioninitiierung in den Darmzellen von DIO-Zebrafischen. Eine intensive braune Färbung für OX-A wird in den Zellen des medialen und vorderen Darms beobachtet. Die Immunexpression von OX-A gibt klare Signale in den verschiedenen Darmfächern, die vom vorderen in Richtung des medialen Darms abnehmen.
Ähnliche Ergebnisse werden für ox-2R Immunexpression im Darm von DIO und Kontrolle Diät Zebrafische beobachtet. Ein erhöhtes OX-A-Signal bei DI erwachsenen Zebrafischen wird von der Überexpression von OX-2R in anderen Darmfächern begleitet. Die genaue Analyse von immunfluoreszierenden Bildern zeigt die Zunahme der OX-2R/CB1R-Kolokalisierung im Darm von DIO-Erwachsenenzebrafischen im Vergleich zur Kontrolldiät zebrafish.
Eine ähnliche Situation ist in verschiedenen Hirnregionen beobachtet, wie dem dorsalen Telencephalon, Hypothalamus, optischem Tectum, Torus lateralis und diffusem Kern des unteren Lappens. Durch doppelte Immunfärbung mit Orexin-A und CB1R Kolokalisierung, Es wird beobachtet, dass es eine Zunahme der Kolokalisierung in den orexinergen Neuronen des Hypothalamus, begleitet von einer Erhöhung der Orexin-A fluoreszierenden Signal. Diese Ergebnisse zeigen, wie eine doppelte Immunfluoreszenz dazu beitragen kann, die physiologisch konservierte Proteinexpression, die Kolokalisierung von Zielproteinen und deren Verteilungs- und/oder Expressionsänderungen in verschiedenen pathologischen Bedingungen zu identifizieren.
Mit Hilfe der Immunfluoreszenz können wir die Kodistribution und Koexpression von Biomolekülen, ihre möglichen Wechselwirkungen besser verstehen, und wir können auch ein sichtbares Bild ihrer Veränderungen bei verschiedenen Pathologien haben. Darüber hinaus kann die neuroanatomische Verteilung der metabolischen Enzymexpression oder Rezeptoren die Rolle der Proteinsignalisierung im Gewebe weiter offenbaren. Die vorliegende technische Arbeit führte den Immunfluoreszenzansatz ein, um zwei hochkonservierte System, Orexin und Endocannabinoide, bei der Verwendung eines erwachsenen Zebrafischmodells zu untersuchen.
Mit diesem hier beschriebenen Protokoll wurde zum ersten Mal im Gehirn erwachsener Zebrafische die anatomische Verteilung und Koexpression von Orexin-2-Rezeptoren und den Endocannabinoid-CB1-Rezeptoren nicht bestimmt. Wir empfehlen die hier beschriebenen Protokolle für immunhistochemische Experimente und zum Nachweis der räumlichen Verteilung und Organisation von Rezeptoren in Peptiden bei erwachsenen Zebrafischen, um deren Funktionen besser zu verstehen.
