Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen der neuronalen Zellmigration. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Sie die individuelle und kollektive Zellmigration langfristig erkennen können. Nach der Isolierung von 200 Millilitern Bakterienkultur durch die alkalische Lyse-Methode, mischen Sie die beiden Plasmide, so dass die endgültige Konzentration von jedem beträgt vier Mikrogramm pro Mikroliter.
Die fruchtbaren Hühnereier horizontal bei 38 Grad Celsius bei 70% relativer Luftfeuchtigkeit bebrüten. Verwenden Sie nach zweieinhalb Tagen eine 20-Milliliter-Spritze mit einer 18-Meter-Nadel, um fünf Milliliter Albumin von der spitzen Seite des Eis zu entfernen. Versiegeln Sie das Loch mit Klebeband.
Als nächstes verwenden Sie gekrümmte Schere, um die Oberseite der Eierschale zu schneiden und ein Loch mit zwei Zentimetern Durchmesser zu öffnen. Überprüfen Sie unter einem Stereomikroskop das Entwicklungsstadium des Embryos. Versiegeln Sie dieses größere Loch mit Klebeband.
Setzen Sie die Inkubation bei 38 Grad Celsius und 70 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit bis E5.5 fort. Bereiten Sie vor der Elektroporation 10 Mikroliter der genannten Plasmid-DNA vor, die mit 0,5 Mikrolitern schnellem Grün gefärbt sind. Bereiten Sie außerdem 10 Milliliter autoklavierter PBS mit 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Streptomycin vor.
Verwenden Sie einen Mikropipettenprozessor, um Mikropipetten aus Glaskapillarrohren vorzubereiten. Schneiden Sie die distale Spitze der Mikropipette auf eine geeignete Porengröße für die Menge der zu injizierenden DNA. Verwenden Sie eine Schere, um die versiegelte obere Schale zu schneiden, um ein Loch mit einem Durchmesser von zweieinhalb Zentimetern wieder zu öffnen, und stellen Sie das Ei stabil unter das Stereomikroskop.
Legen Sie ein paar Tropfen der vorbereiteten PBS-Lösung in das Ei. Mit zwei feinen Zangen, schälen Sie die allantoische Membran, die den Embryo bedeckt, wobei Sie darauf achten, keine Blutungen zu verursachen. Dann entfernen Sie das Amnion aus dem Kopf des Embryos.
Verwenden Sie beim Drehen des Kopfes mit einem Mikrospatzen eine Mikropipette, die mit einem Saugrohr verbunden ist, um zwischen 0,1 und einem Mikroliter der farbigen DNA in die ventrikuläre Höhle des linken optischen Tektums zu injizieren. Legen Sie ein Paar Zangen-Elektroden um den Zielbereich des optischen Tectums. Verwenden Sie den Impulsgenerator, um einen Vorimpuls von 30 Volt für eine Millisekunde mit einem Intervall von fünf Millisekunden und für nachfolgende Impulse von sechs Volt für fünf Millisekunden mit einem Intervall von 10 Millisekunden aufzuladen.
Nach all dem, versiegeln Sie das Loch mit Klebeband, und weiterhin inkubieren bei 38 Grad Celsius und 70 Prozent relative Luftfeuchtigkeit. Die Elektroden in einer mit PBS gefüllten Kunststoffschale einweichen und mit einer Interdentalbürste das Albumen entfernen. Wiederholen Sie den Prozess vom ersten Schalenschnitt bis zur Elektroporation für jedes Ei.
Einen Tag vor der Flat-Mount-Kultur begann die Vorbereitung der codierten Zellkultur Insert durch Hinzufügen von Autoklav endestilliertem Wasser zu einem 10 Zentimeter zellkulturfreien Gericht. Schwimmen Sie einige Zellkultur Einsätze auf dem Wasser. Bei einer Lösung, die acht Mikrogramm pro Milliliter Laminin und 80 Mikrogramm pro Milliliter Polly L enthält, stellen Sie sicher, dass die Einsätze abgedeckt sind.
Über Nacht bei 37 Grad Celsius in der Zellkultur Kohlendioxid-Inkubator inkubieren. Am Tag der Kultur bei E7.0 entfernte die Laminin- und Poly-L-Lysin-Lösung aus dem Insert. Dann übertragen Sie den Insert auf eine Glasbodenschale, gefüllt mit 1,1 Milliliter Kulturmedium.
Übertragen Sie die Schale auf die Zellkultur Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie eine feuchte Kammereinheit auf ein invertiertes konfokales Mikroskop mit einem Gasstrom von 40% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid und einer Temperatur von 38 Grad Celsius. Um mit der Vorbereitung einer Gewebeprobe auf dem Insert zu beginnen, verwenden Sie Zangen, um den Embryokopf in eine sechs Zentimeter große Zellkulturschale zu kneifen, die eiskalte HBSS enthält.
Verwenden Sie zwei feine Zangen, um das elektroporated optic tectum zu isolieren. Und dann verwenden Sie einen Plastiktropfen, um es in eine konkave Glasschale mit schwarzem Silizium zu übertragen und mit eiskaltem HBSS gefüllt. Überprüfen Sie die Position der Beschriftung unter fluoreszierendem stereoskopischem Mikroskop.
Schneiden Sie mit einem Mikro-Opusmesser das tektale Gewebe aus, das die Etikettierung umgibt, während Sie die Richtung des Gewebes im Tectum notieren. Danach verwenden Sie einen Plastiktropfen, um das beschriftete Gewebe auf den Insert zu übertragen, sodass die Stiftseite an der Insert-Seite befestigt ist. Legen Sie das tektale Gewebe in die gewünschte Richtung und entfernen Sie überschüssige HBSS.
Wiederholen Sie den Gewebevorbereitungsprozess für alle anderen Gewebeproben, die für denselben Einsatz bestimmt sind. Legen Sie die Schale dann in die vorgeformte Kammer des invertierten konfokalen Mikroskops. Überprüfen Sie mit dem invertierten konfokalen Mikroskop die fluoreszierende Kennzeichnung und fokussieren Sie das mikroskopische Feld.
Starten Sie die konfokale Lasereinheit. Probieren Sie den konfokalen Scan, um die Richtung und Position des Gewebes entlang der x- und y-Achse im Feld anzupassen. Wählen Sie als Nächstes die Scangröße aus.
Bestimmen Sie das Intervall und den Gesamtbereich des konfokalen Scans entlang der Z-Achse. Nehmen Sie ein Intervall von fünf oder 10 Mikrometern für den Bereich von 100 Mikrometern. Wählen Sie das Zeitintervall der konfokalen Bildgebung und die Gesamtbilddauer aus.
Nachdem Sie die Parameter des konfokalen Laufenden programms gesetzt haben, beginnen Sie mit der Bildgebung. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, kombinierten Sie die konfokalen Bilder an einer anderen C-Achse, um Z-Stack-Bilder mit endgültiger Fokuseinstellung zu jedem Zeitpunkt zu erzeugen. Fügen Sie dann die Z-Stack-Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten an, um einen Zeitrafferfilm zu erstellen.
In dieser Studie wird die Zellmigration in oberflächlichen Schichten durch Elektroporation in Ovo, flache Zellkultur und zeitraffer-konfokale Bildgebung nachgewiesen. Die tangential wandernden Zellen und die Kerne in den oberflächlichen Schichten des optischen Tectums sind hier null Stunden, neun Stunden, 18 Stunden und 27 Stunden nach Beginn der Aufnahme zu sehen. Ein Zeitrafferfilm mit 10-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von 28 Stunden und 50 Minuten zeigt die Massenbewegung wandernder Zellen und ihrer Kerne.
Der zusammengeführte Film zeigt deutlich die Massenbewegung der wandernden Zellen. Die Richtung der Zellmigration kann untersucht werden, indem man sich auf die dispergierenden Zellen vom beschrifteten Zentrum in alle Richtungen konzentriert. Die klaren Bilder der nuklearen Bewegung, ermöglicht die automatische Verfolgung der nuklearen Migration mit einem Partikel-Tracking-Plugin.
Zeitliche Veränderungen der Bahnen der tangentialen Migration können visualisiert werden und beweisen, dass die dispergierende Migration omnidirektional ist. Höhere Vergrößerungsbilder können in Fünf-Minuten-Intervallen aufgenommen werden. Untersuchung des individuellen Zellverhaltens mit der sequenziellen morphologischen Veränderung des führenden Prozesses, des Trailing-Prozesses und der Kerne.
Nach diesem Verfahren kann die Beschriftung von Beleuchtungsaktionen durchgeführt werden. Um zusätzliche Fragen wie die Mechanismen der Aksum-Führung zu beantworten.
