Name: using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development at JoVE.com

We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

Die Veröffentlichung dieses Video-Artikel wird von Zeiss unterstützt.

Morphogenese ist der Prozess, den Embryo und zusammen mit Wachstums- und Differenzierungsformen treibt die Ontogenese aus einer befruchteten Eizelle zu einem reifen vielzelligen Organismus. Die morphogenetischen Prozesse während der Entwicklung der Tiere können durch die Abbildung von intakten lebenden Proben 1-3 analysiert am besten. Dies ist, weil eine solche ganze embryo Abbildungs ​​bewahrt alle Komponenten, die Entwicklung, einschließlich Gradienten von Signalmolekülen, extrazelluläre Matrix, Gefßsystem, Innervation sowie mechanischen Eigenschaften des umgebenden Gewebes treiben und zu regeln. Um die Skalen überbrücken, an der Morphogenese auftritt, haben die schnellen subzelluläre Ereignisse auf eine Minute Zeitskala im Zusammenhang mit der Entwicklung des gesamten Gewebes über Stunden oder Tage erfasst werden. Um all diese Anforderungen zu erfüllen, eine moderne Umsetzung 4 der orthogonalen Ebene Beleuchtung Mikroskop 5 wurde entwickelt. Ursprünglich war es das Selective Plane Illumination Microscopy (SPI benanntM) 4; nun eine allumfassende Begriff Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) wird in der Regel eingesetzt. LSFM ermöglicht Bildgebung mit hoher Zeitauflösung, während Induktion weniger als Phototoxizität Laser - Scanning oder Drehscheiben - konfokale Mikroskope 6,7. Heutzutage gibt es bereits viele Implementierungen der Grundlichtbogen Beleuchtungsprinzip , und es hat 8-11 eine Vielzahl von Proben und Verfahren zur Bild bisher unzugänglichen Forscher verwendet. Wir würden zunächst einige wesentliche Vorteile von LSFM gegenüber herkömmlichen konfokalen Mikroskopie Ansätze hervorheben: Um aussagekräftige Ergebnisse aus Live-Bildgebung mikroskopische Experimente zu erwerben, ist es wichtig, dass die Beobachtung nur minimal die Probe beeinflusst. Allerdings sind viele Organismen Zebrabärbling einschließlich sehr anfällig für Laserlicht ausgesetzt werden, ist es schwierig zu Bild machen sie in einem konfokalen Mikroskop mit hoher Zeitauflösung ohne Phototoxizität effekte wie ins Stocken geraten oder Entwicklung 6,7 verzögert. LSFM ist derzeit der Fluoreszenz - Imaging - Technik mit den am wenigsten störenden Auswirkungen auf die Probe 7. Da das dünne Blech Laserlicht nur den Teil der Probe beleuchtet, die zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet wird, ist das Lichtblatt-Mikroskop Photonen sehr effizient zu nutzen. Folglich ermöglicht die geringe Lichtbelastung für längere Zeitraffer Beobachtungen von gesünderen Proben, zB 17.12. Darüber hinaus dank der minimalen Invasivität LSFM, die Anzahl der erfassten Bilder wird nicht mehr durch diktiert, wie viel Licht die Probe tolerieren kann, sondern durch, wie viele Daten verarbeitet und gespeichert werden. In die gleiche Richtung von der Probe in der Nähe von physiologischen Bedingungen zu halten, kommt LSFM mit alternativen Probenmontagestrategien gut geeignet für Live-Embryonen. In LSFM Techniken werden die Embryonen typischerweise innerhalb einer dünnen Säule von niedrigen Prozentsatz Agarose eingebettet. Die mounting in Agarose Zylindern ermöglicht die vollständige Rotationsfreiheit, so kann die Probe aus dem perfekten Winkel beobachtet werden (in LSFM als Ansicht bezeichnet) und aus mehreren Ansichten gleichzeitig. Die Multi-View-Bildgebung und die anschließende Multi-View-Fusion ist von Vorteil, besonders für große, Verstreuen Proben und ermöglicht es ihnen, mit hohen, isotropen Auflösung zu erfassen. Eine Zusammenfassung der anderen möglichen LSFM Montagestrategien können im offiziellen Mikroskop Betriebsanleitung zu finden, in dem Kapitel über die Vorbereitung durch das Labor von E. Reynaud geschrieben Probe. Es ist eine Lese empfohlen, insbesondere wenn das Ziel zur Bild verschiedenen Proben als hier beschrieben. Die Bilderfassung in LSFM ist weites Feld, kamerabasierte, als konfokales Mikroskop zu Laser-Scanning-Gegensatz. Dies führt zu einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis (SNR) für die erfassten Bilder und können sehr schnell (zehn bis hundert Bilder pro Sekunde) betragen. Die hohe Empfindlichkeit von LSFM ermöglicht eine weitere Abbildung von schwach fluoreszierenden samples, wie Transkriptionsfaktoren an die endogenen Spiegel 18 zum Ausdruck gebracht oder in naher Zukunft, endogenen Proteinen unter Verwendung von CRISPR / Cas9 markiert. Die hohe SNR ist auch wichtig für eine erfolgreiche nachgeschalteter Bildanalyse. Die hohe Geschwindigkeit ist nicht erforderlich, nur eine schnelle intrazelluläre Vorgänge zu erfassen, sondern auch auf Bild, um das gesamte Embryo aus mehreren Ansichten schnell genug. Eine nahtlose Verschmelzung der mehreren Ansichten kann nur erreicht werden, wenn das beobachtete Phänomen während der Erfassung dieser verschiedenen z-Stacks nicht aus getrennten Ansichten kommenden ändern. Die Vorteile der LSFM typischerweise nicht auf Kosten der Bildqualität kommen. Die laterale Auflösung von LSFM ist etwas schlechter als die Auflösung eines konfokalen Mikroskops. Dies liegt daran, die Erkennungsziele in LSFM niedrigeren numerischen Apertur verwendet (in der Regel 1,0 oder weniger) im Vergleich zu 1,2-1,3 Wasser oder Silizium Tauchziele auf Standard-konfokalen Setups. Zusätzlich aufgrund der breiten Felderkennung in LSFM (Absence eines Pinholes), gibt es mehr out-of-focus Licht im Vergleich zu einem konfokalen Mikroskop. Die Menge an out-of-focus Licht wird durch die Lichtbogendicke bestimmt. Dennoch werden diese Nachteile durch die höhere SNR in LSFM kompensiert. In der Praxis führt dies in ähnlicher Qualität Bilder im Vergleich zu beispielsweise sich drehende Scheibe konfokalen Nahme 15. Folglich ermöglicht diese zuverlässige Extraktion von Merkmalen wie Zellmembranen oder Zellkerne, beispielsweise für die Zelllinie 15,19 Tracing. Die axiale Auflösung von LSFM bestimmt wird, zusätzlich zu dem Erfassungsziel, durch die Lichtbogendicke. Die axiale Auflösung von LSFM kann in einigen Fällen übertreffen die Auflösung der konfokalen Mikroskope. Zuerst kommt die Verbesserung der Auflösung, wenn die Lichtbogen dünner als die axiale Auflösung des Detektionsziel ist, die typischerweise für große Proben mit geringer Vergrößerung Ziel abgebildet auftritt. Der zweite Weg, wie die LSFM ach kannIEVE bessere axiale Auflösung ist die Multi-View-Fusion, bei der die hohe xy Auflösung von Informationen aus verschiedenen Ansichten in einem Bildstapel kombiniert wird. Die sich ergebende zusammen Stapel weist eine isotrope Auflösung 20,21 die Werte der Auflösung in der seitlichen Richtung nähern. Die Strategie zur Registrierung der mehrere Ansichten auf einander in diesem Artikel beschrieben wird , basiert auf der Verwendung fluoreszierenden Polystyrol - Kügelchen als Treuhänder in der Agarose eingebettete Marker um die Probe 20,21. Als Ergebnis der LSFM Kommerzialisierung Diese Technik ist jetzt zu einer breiten Gemeinschaft von Wissenschaftlern 22 zur Verfügung. Daher ist die Motivation, dieses Protokoll zu schreiben diese Technologie zugänglich Entwicklungsbiologen praktische Erfahrung in LSFM fehlt zu machen und diese Wissenschaftler zu erhalten begonnen mit dieser Technologie mit ihren Proben. Unser Protokoll verwendet das kommerzielle Lichtblatt-Mikroskop, das eine vom Konzept her einfach Mikroskop t darstelltHut ist leicht zu bedienen. Wir möchten zusätzlich andere neue Protokolle zu erwähnen , für die Abbildung Zebrabärbling mit selbstgebauten LSFM Setups, die geeignet sein könnten , insbesondere Fragen 23-25 ​​zu beantworten. Ein weiterer Eintrag Option LSFM sind die offenen Plattformen 26,27, die die Open - Access - Prinzipien verwenden Lichtblatt - Mikroskopie zu einer breiteren Gemeinschaft zu bringen. Die Dokumentation sowohl der Hardware als auch die Software-Aspekte können bei http://openspim.org und https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ finden. In diesem Protokoll verwenden wir das Teleostier Zebrabärbling als Modellsystem Entwicklungsprozesse mit LSFM zu studieren. Morphogenese des Zebrabärbling Auge ist ein Beispiel, das viele der Vorteile von LSFM unterstreicht. LSFM hat bereits in der Vergangenheit verwendet worden 29,30 Augenentwicklung in Medaka 28 und in Zebrabärbling zu untersuchen. In einem frühen Stadium der Entwicklung des Auges ist es kompliziert, den Embryo richtig für konventionelle Mikroskopie zu orientieren,wird als sperrig yolk nicht der Embryo erlauben, auf der Seite mit dem Auge, das Ziel zu liegen gegenüber. Jedoch mit LSFM in eine Agarose-Säule Befestigungs kann die Probe reproduzierbar positioniert werden. Zusätzlich wird während des Übergangs von Augenblase zur Exkavation Stufe erfährt das Auge Haupt morphogenetic durch Wachstum begleitet Umlagerungen, die eine große z-Stack und einen großen Sichtfeld erfordert die Erfassung. Auch für diese Herausforderungen ist LSFM überlegen gegenüber herkömmlichen konfokalen Bildgebung. Der Prozess der Exkavation Bildung ist dreidimensional, daher ist es schwer, durch Abbilden von einer Ansicht allein zu erfassen und zu visualisieren. Dies macht Multi-View-Bildgebung mit isotropen Auflösung von Vorteil. Nach Augenbecher Bildung, wird die Netzhaut-Laserbelichtung zunehmend empfindlich. Somit ist die geringe Phototoxizität assoziiert mit LSFM ein großer Vorteil für die Langzeitbildgebung. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll für die Bildgebung von ein bis drei Tage alten Zebrafischembryonen einnd Larven mit Schwerpunkt auf der Entwicklung des Auges. Unsere Methode ermöglicht die Aufnahme von Zeitraffer-Filme auf 12-14 h mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu verdecken. Wichtig ist, zeigen wir auch eine Pipeline für die Datenverarbeitung, die ein wesentlicher Schritt in LSFM ist, da diese Technik immer große Datensätze erzeugt, die oft im Terabyte-Bereich.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A4018 or A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;mm inner diameter, marked black) capilllaries</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip plungers for 20&amp;nbsp;&amp;mu;l capillaries</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings for chamber windows 17&amp;times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Links&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstruction application</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFM ist eine ideale Methode zur Abbildung von Entwicklungsprozessen über Skalen. Mehrere Anwendungen sind hier zusammengestellt sowohl kurz- als auch langfristige Darstellung von intrazellulären Strukturen, sowie Zellen und ganze Gewebe zeigt. Diese Beispiele zeigen auch , dass LSFM ist ein nützliches Werkzeug in verschiedenen Stadien der Entwicklung des Auges von Exkavation Bildung Neurogenese in der Netzhaut. Film 1 dient als Illustration der allgemeinen LSFM Ansatz, zuerst eine herausgezoomt , um die Ansicht , die eines intakten Embryo in der Agarose Zylinder in Hellfeld- Einbetten und später eine detaillierte Ansicht der Netzhaut im Fluoreszenzkanal zeigt. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. LSFM der Zebrabärbling Retina des LSFM Ansatz Zur Veranschaulichung dieser Film zeigt zunächst in der Hell- , dass der Embryo in der ein intaktes abgebildet wirdgarose Zylinder vor dem Fluoreszenz wechseln. Später wird gezeigt, daß das große Sichtfeld Beobachtung der gesamten Netzhaut ermöglicht. Als nächstes zeigt der Film einen vergrößerten kleinen Bereich der Netzhaut, die gute subzellulärer Auflösung zu markieren. Ein Ath5: gap-GFP 37 transgenen Zebrafischembryo wurde für die Bildgebung verwendet. Dieses Transgen-Etiketten verschiedene Neuronen in der Netzhaut (hauptsächlich Ganglionzellen und Photoempfänger Grundstoffe). Die Fluoreszenz-Teil des Films wurde als Single-Ansicht mit doppelseitiger Beleuchtung des 40X / 1.0 W-Objektiv mit 5-Minuten-Intervallen mit der Aufnahme erfasst. Die maximale Intensität Projektion eines 30 &amp; mgr; m dicken Band dargestellt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Movie 2 zeigt, wie sehr schnelle intrazelluläre Ereignisse mit hoher Auflösung erfasst werden; in diesem Fall wird das Wachstum der Mikrotubuli anihre Plus endet in den retinalen neuronalen Vorläuferzellen. Die Informationen in dem Film enthalten kann für das Tracking und Quantifizierung von Mikrotubuli Plus-Ende Wachstum. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Film 2:. Dynamik der Mikrotubuli in einer einzigen Zelle Dieser Film einfängt wachsenden Plus Spitzen durch das Plus - Spitze Markerprotein EB3-GFP 38 markierte Mikrotubuli. Das Protein wird in einer einzelnen Netzhautvorläuferzelle exprimiert. Die Mikrotubuli wachsen vorwiegend in Richtung von apikal nach basal (von oben nach unten). Die Durchschnittsgeschwindigkeit der EB3 Kometen als 0,28 ± 0,05 &amp; mgr; m / sec gemessen. Der helle Fleck an der apikalen Seite der Zelle hoch Mikrotubuli Nukleation Aktivität zeigt die Zentrosom. EB3-GFP-Plasmid-DNA: Das Wildtyp-Embryo wurde mit Hsp70 injiziert. Der Film wurde 4 h nach Hitzeschock erworben (15 min bei 37 ° C) bei etwa 28 hrpost-Düngeration (HPF) als einer einzigen Ansicht mit einseitiger Beleuchtung Aufzeichnung der Intervalle 63X / 1.0 W objektiv und 1 sec Mal verwenden. Die einzelne Zelle wurde aus einem Sichtfeld für die Mehrheit der Netzhaut abgeschnitten. Die maximale Intensitätsprojektion von zwei Scheiben dargestellt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a> Abbildung 3 zeigt, wie die intrazelluläre Strukturen können über viele Stunden folgen. Hier wird das Zentrosom retinalen Ganglionzellen in Translokationseinheiten (RGC) erfasst. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Abbildung 3:. Zentrosom Lokalisation während der retinaler Ganglionzellen Translokation Diese Montage eines Zeitraffer-Experiment zeigt die Position des Zentrosom in der gesamten retinaler Ganglionzellen (RGC) Reifung.In den neuronalen Vorläufern wird der Zentrosomen in der Spitze des apikalen Verfahren (01.00) lokalisiert. Während der Zellteilung dienen die beiden Zentrosomen als Pole für die mitotische Spindel (02.25). Diese Aufteilung führt zu einer Tochterzelle, die in ein RGC und eine zweite Tochterzelle unterscheidet, die eine Sehzellen Vorläufer wird. Nach der Teilung transloziert die Zellkörper der RGC auf die basale Seite der Netzhaut, während die apikale Prozess an der apikalen Seite befestigt bleibt. Sobald die RGC die basale Seite erreicht, löst seine apikal Prozess und das Zentrosom reist mit ihm (6,15). Das Zentrosom kann gefolgt werden, während nach und nach mit dem apikal Prozess (06.50, 07.20, 08.10) Einfahren zusammen. Im letzten Rahmen (8.55) die Ganglionzellen ein Axon von seinem basalen Seite wächst, während der Zentrosomen noch apikal lokalisiert ist. Das Mosaik-Expression wurde durch Plasmid-DNA-Injektion in Wildtyp-Embryo in einem Zell-Stadium erreicht. GFP-CAAX (grün) const: Die Zellen werden durch die Ath5 visualisiertein- em, die RGCs und anderen Neuronen Etiketten. Die Zentrosomen (Pfeilspitzen) sind je nach Centrin-tdTomato 29 Ausdruck (magenta) markiert. Der apikalen Seite der Netzhaut ist an der Oberseite des Bildes und der basalen Seite an der Unterseite. Die maximale Intensität Projektion eines 30 &amp; mgr; m dicken Band gezeigt. Die Bilder wurden aus einem Film zugeschnitten, um die gesamte Netzhaut bedeckt. Der Film beginnt bei rund 34 Stunden nach der Befruchtung (HPF). Ein z Stapel wurde alle 5 min mit dem 40X / 1.0 W Ziel erworben. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Leicht verfolgt und seine apikalen und basalen Prozess werden kann In 4 es angezeigt wird, wie einzelne Zellverhalten von Daten extrahiert werden kann , das ganze Gewebe wie in Movie 1. Translokation eines RGC Erfassunges folgte. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Translokation eines einzelnen retinaler Ganglionzellen Die RGC Translokation von apikal basalen Seite der Retina tritt nach dem Anschluss der Mitose wie in Abbildung 3 beschrieben Die RGC durch die Expression des Ath5 markiert ist. Spalt-GFP 37 Transgen. Die maximale Intensität Projektion eines 30 &amp; mgr; m dicken Band gezeigt. Die Bilder wurden aus einem Film zugeschnitten, um die gesamte Netzhaut bedeckt. Der Film beginnt bei rund 34 HPF. Ein z Stapel wurde alle 5 min mit dem 40X / 1.0 W Ziel erworben. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 5 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 5 zeigt die Fähigkeit von Multi - View - LSFM zu erfassen Gewebe scAle morphogenetischen Prozesse mit zellulärer Auflösung am Beispiel der Augenbecher Morphogenese, bei der Augenblase in eine Exkavation verwandelt. Die Bildqualität kann erheblich durch Multi-View-Bildgebung verbessert werden, wenn das endgültige Bild von den Informationen aus 5 verschiedenen Ansichten (in diesem Fall) in einem z-Stack mit isotropen Auflösung kombiniert wird. Diese Abbildung zeigt die Verbesserung der Bildqualität nach dem gewichteten Durchschnitt der Fusion und weitere Verstärkung in den Bildkontrast und die Auflösung nach dem Multi-View-Entfaltungs. Die Abbildung zeigt zwei optische Scheiben in unterschiedlichen Orientierungen durch den Datensatz. Zusätzlich ist eine Montage aus dem entfalteten-Datensatz zeigt die Exkavation Morphogenese im Laufe der Zeit. Alle Zeitpunkte werden dann in Movie 3 gezeigt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Abbildung 5: Vergleich der Bildqualität zwischen den einzelnen Ansicht und zwei Methoden der multiview Fusion. (A) Eine optische Scheibe einzigen Ansicht Daten gezeigt von Seitenansicht und (B) dorsale Ansicht. Streifenartefakten und Verschlechterung des Signals tiefer in der Probe sind offensichtlich. Auch ein Teil des Bildes sichtbar in den verschmolzenen Daten (CF) wurde in diesem besonderen Ansicht nicht erfasst. (C) Das gleiche optische Scheibe, die nun als Multi - View - fusionierten Daten aus Seitenansicht gezeigt und (D) dorsale Ansicht. Beachten Sie, dass Streifen Artefakte unterdrückt und Strukturen tief in der Probe vorhanden sind besser gelöst. (E) die gleiche optische Scheibe nun als Multi - View - entfalteten Daten aus Seitenansicht gezeigt und (F) dorsale Ansicht. Beachten Sie die erhöhten Kontrast und Auflösung, so dass die einzelnen Zellmembranen und Kerne können gut unterschieden werden. Die Auflösung verschlechtert sich nicht deutlich tiefer in die Probe. Der Datensatz wurde mit doppelseitiger Beleuchtung von 5 Ansichten erworben auseinander etwa 20 Grad. Die z-Stapel abaus 100 &amp; mgr; m mit 1,5 &amp; mgr; m Schrittgrße wurden mit dem 20X / 1.0 W Ziel 10 Stunden bei jeder Ansicht in 10 min Intervallen erfasst. Eingabebilder für die Multi-View-Fusion und Entfaltungs wurden um 2 × abgetastet, um die Bildverarbeitung zu beschleunigen. 15 Iterationen des Multi-View-Entfaltungs wurden durchgeführt. (G) Die Montage zeigt einen beschnittenen Bereich der dorsalen Ansicht von den entfalteten Daten die morphogenetischen Ereignisse während der frühen Entwicklung des Auges aus der Augenblase in die Augenbecher Bühne zu markieren. Die beiden Schichten des optischen Vesikel, die zunächst ähnliche säulen Epithelien sind, differenzieren sich in verschiedenen Zellpopulationen. Die distale Schicht nahe der Epidermis wird die retinale neuroepithelium (RN) und der proximalen Schicht nahe dem Neuralrohr wird die retinalen Pigmentepithel (RP). Die Zellen in der RN länglichen und invaginate der Augenbecher (1.40 bis 5.00) zu bilden; zugleich flachen die RP-Zellen. Die Oberfläche Ektoderm induziert eine Linse (01.40) zu bilden, which stülpt später (05.00). Der Film beginnt bei 17 HPF. mm: Die Zeit wird im hh. Alle Zellmembranen werden durch den β-Actin-markiertem: ras-GFP-Transgen und alle Kerne gekennzeichnet sind durch die hsp70: H2B-RFP-Transgen. Maßstabsbalken entspricht 30 &amp; mgr; m. FB Vorderhirns, LE - Objektiv, OP olfaktorischen Plakode, RN retinalen neuroepithelium, RP retinalen Pigmentepithel. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Augenbecher Morphogenese mit Einzelansicht und zwei Methoden der Multi - View - Fusion gezeigt Die Zeitraffer-Film zeigt den kompletten Prozess der Augenbecher Morphogenese von der Augenblase in die Augenbecher Bühne.. Es zeigt eine einzige optische Scheibe aus der Seitenansicht (oben) und eine einzige optische Scheibe von der dorsalen Ansicht (unten). Die Zellen des sich entwickelnden Augenblase unterziehen komplexe Umlagerungen schließlich mit der inneren retinalen neuroepithelium und äußeren retinalen Pigmentepithel der hemisphärischen Exkavation bilden. Eine Linse wird von der Oberfläche Ektoderm gebildet. Es stülpt mit dem neuroepithelium entlang und sitzt in der Augenbecher. ras-GFP (grün) Transgen und die Kerne sind beschriftet mit hsp70: H2B-RFP (magenta) alle Zellmembranen werden durch die Expression des β-Actin-markiert. Der Film beginnt bei rund 17 HPF. Der Datensatz wurde mit doppelseitiger Beleuchtung von 5 Ansichten erworben etwa 20 Grad auseinander und az Stapel von etwa 100 &amp; mgr; m alle 10 Minuten mit dem 20X / 1.0 W Ziel erworben wurden. mm: Die Zeit wird im hh. Maßstabsbalken entspricht 50 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development at JoVE.com

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K Aufrufe.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Serie: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologie

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Biotechnik

<meta charset="utf8"></head><body>Verfeinertes Multiview-Lichtblattmikroskopie-Protokoll für Zebrafischembryonen

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Strategien für die Montage von Zebrafischembryonen für die hochauflösende Multiview-Lichtblattmikroskopie — Techniken zur Bildgebung und Bild

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Analyse der Herzkontraktion von Zebrafischen mit Virtual-Reality-Interaktion

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Autor im Rampenlicht: Hochauflösende 4D-Lichtblatt-Bildgebung und Virtual Reality im Zebrafisch zur Einzelzellanalyse der Herzfunktion

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

Lichtblattmikroskopie: Bildgebung und Montagestrategien für frühe Zebrafischembryonen

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen

4D-Lichtblatt-Bildgebung der Herzkontraktion von Zebrafischen