Das funktionierte wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health und Medical Research Council (GNT1125033 und GNT1140187) und Australian Research Council (DP170103790), I.K.H.P.

1. Induktion der Apoptose
<ol><li>Zentrifuge Zellprobe bei 300 X g für 5 min und verwerfen überstand, alle bereits bestehenden Zelle Ablagerungen zu entfernen. Hinweis: Bei der Verwendung von adhärenten Zellen Zellen im Voraus Samen und Waschen mit 1 x Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) vor der Apoptose-Induktion.</li>
	<li>Bestimmen Sie Anzahl von Zellen und sammeln Sie Zellen zu. Hinweis: Je nach Test Post-Isolierung empfehlen wir eine Zelle Anfangszahl von mindestens 1 x 107 Zellen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie in komplette Medien (jeweils 10 % (Vol/Vol) fetalen Kälberserum, 50 IU/mL Penicillin, 50 µg/mL Streptomycin Mischung-haltigem Medium) für eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/mL.</li>
	<li>Aliquoten ~ 2 x 106 Zellen pro Bohrloch eine 6-well-Platte.</li>
	<li>Um Apoptose induzieren, die Platte Deckel abnehmen und Zellen bei 150 mJ/cm2 mit einem UV-Strahler zu bestrahlen. Dies dauert ca. 30-60 s. Hinweis: Vor der Bestrahlung, sicherzustellen Sie, dass ~0.5 X 106 Zellen für die "Unbehandelt" zellkontrolle aufbewahrt werden. Hinweis: Apoptose kann auch über andere Methoden wie Anti-Fas oder Serum Hunger6induziert werden.</li>
	<li>Inkubation bei 37° C, 5 % CO2 für 2 bis 8 Stunden, abhängig von der Zell-Linie.</li>
	<li>Mit einem Bench Top Lichtmikroskop, visualisieren Sie Zellen, um das Vorhandensein des apoptotischen Morphologien, z. B. Blebbing Apoptopodia Bildung und ApoBD Bildung zu bestätigen. Hinweis: 40 X Vergrößerung ist ausreichend</li>
	<li>Mit einer Pipette P1000, pipette und Apoptotic Proben sammeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte mit 1 X PBS und kombinieren Sie mit restlichen Probe um maximalen Ertrag zu gewährleisten.</li>
	<li>Sammle ~1/10th für die "gesamte Apoptotic Probe" (WAS) steuern.</li>
	<li>Die "Unbehandelte" Probe zu sammeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die WS und unbehandelt Proben bei 3.000 x g für 6 min.</li>
	<li>In 1 mL 1 X PBS aufschwemmen und beiseite auf Eis.</li>
	<li>ApoBD Isolierung weiterhin entweder Schritt 2 oder 3 mit der restlichen Apoptotic Probe.</li>
</ol>2. ApoBD Isolation über FACS
<ol><li>Zentrifugieren Sie die gesamte Probe bei 3.000 x g für 6 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Großteil der Überstand ohne Unterbrechung das Pellet.</li>
	<li>In einer Färbelösung enthält 1 mL 1 x A5 Bindung Puffer, 75 µL A5-FITC und 2 µL des TO-PRO-3 pro 1 x 107 Zellen aufzuwirbeln.</li>
	<li>Inkubieren Sie Probe im Dunkeln bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>Fügen Sie 1-2 mL 1 x A5 Bindung Puffer und Zentrifugieren Sie Probe bei 3.000 x g für 6 min um überschüssige Fleck zu entfernen. Hinweis: Für gemischte Zellpopulationen oder Gewebeproben, führen Sie einen Antikörper Färbung Schritt mit einer Kombination aus Zelle Typ-spezifische Marker in 1 x A5 Bindung Puffer und inkubieren Sie auf Eis für 20 min (oder entsprechend des Herstellers Protokoll) vor Zentrifugation bei 3.000 x g für 6 Min.</li>
	<li>Aufschwemmen Probe Pellet in 3 mL FACS-Puffer (1 X PBS, 1 x A5 Bindung Puffer, 10 % FSC, 2 mM EDTA) pro 1 x 107 Zellen.</li>
	<li>In einem Rundboden, Polypropylen (Durchflusszytometrie) Rohr durch ein 70 µm Zelle Sieb Filtern und Proben auf Eis und im Dunkeln halten.</li>
	<li>FACS Maschine schalten Sie ein und durchführen Sie Standardsatz mit einer Düse 100 µm, führen Sie die Drop-Verzögerung und gewährleisten Sie einen stabilen Strom.</li>
	<li>Laden Sie die Probe und Geschwindigkeit auf ~ 1000 Ereignisse/s festgelegt.</li>
	<li>Einstellen Sie FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) und FITC (A5) Spannungen und positionieren Sie Ereignisse innerhalb der FACS Plots, um sicherzustellen, dass Populationen klar getrennt werden können.</li>
	<li>20.000 Ereignisse aufzeichnen.</li>
	<li>Richten Sie eine gating Strategie wie in Teil 4.</li>
	<li>Fügen Sie in der Art-Layout das letzte ApoBD Tor als die gewünschte Sortierung Bevölkerung hinzu.</li>
	<li>Beginnen Sie Erwerb der Probenmaterials und führen Sie eine Test-Art durch das Sammeln von 5.000-10.000 ApoBDs in einen neuen Schlauch, ~ 250 µL FACS Puffer enthält.</li>
	<li>Führen Sie ein System wieder bündig und laden Sie sortierte ApoBDs zu.</li>
	<li>Erwerben Sie und notieren Sie Test-Art ApoBDs.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob die ApoBD Reinheit ~ 99 % ist durch Vergleich FSC (y-Achse) Vs A5 (x-Achse Veranstaltungen). Hinweis: A5 Färbung kann leicht reduzieren bei der Analyse der Proben durch Laser-bleaching wieder.</li>
	<li>Hoher Reinheit erreicht, Originalmuster zu laden und weiter sortieren, bis die gewünschte Anzahl an ApoBDs gewonnen wurde. Hinweis: Falls erforderlich, kann doppelte Sortierung durchgeführt werden um ApoCells und ApoBDs gleichzeitig zu isolieren. Hinweis: Beim Sortieren über einen langen Zeitraum hinweg empfehlen wir dem Sammelrohr bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, sammeln Sie einen kleinen Teil des Post-Art ApoBDs, Post-sortieren Sie ApoCells, unbehandelt und WAS Apoptose zu überprüfen und bestätigen nach Art Reinheit. Hinweis: Obwohl die Test-Sortierung und Post-Art Reinheit nicht erheblich abweichen sollte, basiert diese auf die Stream-Einstellungen und Stabilität.</li>
</ol>3. ApoBD Isolation über Differentielle Zentrifugation
<ol><li>Zentrifugieren Sie die restlichen Apoptotic Probe bei 300 X g für 10 min.</li>
	<li>Erfassen des Überstands, ~ 500 µL um nicht zu stören das Pellet Zelle zu verlassen und in ein neues 15 mL konische Röhrchen hinzufügen.</li>
	<li>Entfernen Sie die restlichen 500 µL und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL 1 X PBS (Dies entspricht die ApoCell angereicherte Fraktion.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die gesammelten überstand für 20 min bei 3.000 g.</li>
	<li>Überprüfen Sie, ob ein Pellet und entfernen Sie vorsichtig den überstand (Überstand kann kleine extrazelluläre Vesikel einschließlich Microvesicles und exosomen enthalten).</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL 1 X PBS (Dies entspricht den 'ApoBD-angereichert' Bruch)</li>
	<li>Sammeln Sie 100 µL der einzelnen lebensfähig, WS, ApoCell bereichert, und ApoBD angereicherte Proben in einer neuen Rundboden, Polystyrol (Durchflusszytometrie) Rohr.</li>
	<li>Hinzufügen von 100 µL der Fleck mit 2 x A5-Bindung Puffer, 1: 100 A5-FITC und 1:1,000 TO-PRO-3</li>
	<li>Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min in der Dunkelheit.</li>
	<li>Analysieren Sie Proben von Durchflusszytometrie, mit der gating-Strategie wie oben beschrieben, um die erfolgreiche Induktion der Apoptose und Reinheit der ApoBD angereicherte Fraktion zu validieren.</li>
</ol>4. die Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie
<ol><li>Plot-TO-PRO-3 (y-Achse) gegen FSC (x-Achse), nekrotische Zellen (TO-PRO-3hoch) von allen anderen nicht-permeabilized Veranstaltungen (TO-PRO-3Low/Mittelstufe) zu trennen.</li>
	<li>Wählen Sie alle nicht-permeabilized Ereignisse und plot-SSC gegen A5. Tor, zwei Populationen einschließlich Bevölkerung 1 (P1), SSCmittleren/hohen,niedrigen/mittleren Zellen A5 und 2 (P2), alle anderen Ereignisse.</li>
	<li>P2 plot TO-PRO-3 gegen A5 und wählen Sie A5mittleren/hohen Veranstaltungen alle zellenrückstand auszuschließen.</li>
	<li>Wählen Sie alle A5 positive Ereignisse und Plotten Sie FSC gegen A5. ApoCells (FSCMittelstufe/hohe) ApoBDs (FSCniedrig) trennen. Hinweis: Bei ApoBDs für ApoBD Isolierung über der FACS basierenden Ansatz gating, empfehlen wir einen endgültigen Schritt durch ApoBDs und TO-PRO-3 bis A5 vergleichen und auswählen alle Ereignisse. Dies sorgt dafür, dass die endgültige sortierschleuse Fluoreszenz anstelle von FSC/SSC-Parameter verwendet.</li>
	<li>Wählen Sie P1 für tragfähige Zellanalyse und führen Sie einen der beiden gating Strategien. Plotten Sie für allgemeine tragfähige Zellanalyse FSC gegen A5 und markieren Sie alle FSCmittleren/hohen Zellen, daher entfernen verbleibenden zellenrückstand. Alternativ für eingehende Analyse, lebensfähige Zellen trennbar von A5– frühen ApoCells von TO-PRO-3 gegen FSC Plotten. Wählen Sie TO-PRO-3niedrige, FSCmittleren/hohen lebensfähige Zellen und TO-PRO-3intermediate, FSCmittleren/hohen A5– frühe ApoCells.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+clearance:+basic+biology+and+therapeutic+potential.">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).</li><li>Atkin-Smith, G. K., Poon, I. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+blebbing+during+apoptosis+results+from+caspase-mediated+activation+of+ROCK+I.">Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I.</a> Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).</li><li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+generating+extracellular+vesicles+during+apoptosis+via+a+beads-on-a-string+membrane+structure.">A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure.</a> Nature Communications. 6, 7439 (2015).</li><li>Poon, I. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Curcumin+inhibits+the+Sonic+Hedgehog+signaling+pathway+and+triggers+apoptosis+in+medulloblastoma+cells.">Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells.</a> Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).</li><li>Sagulenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIM2+and+NLRP3+inflammasomes+activate+both+apoptotic+and+pyroptotic+death+pathways+via+ASC.">AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).</li><li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+RNA+profiles+in+subpopulations+of+extracellular+vesicles:+apoptotic+bodies,+microvesicles+and+exosomes.">Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Turiak, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+characterization+of+thymocyte-derived+microvesicles+and+apoptotic+bodies+in+BALB/c+mice.">Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice.</a> Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labelled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V.</a> Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+progression+of+cell+death+and+the+disassembly+of+dying+cells+by+flow+cytometry.">Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry.</a> Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).</li><li>Berda-Haddad, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation+of+endothelial+cell-derived+apoptotic+bodies+is+mediated+by+interleukin-1alpha.">Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).</li><li>Lleo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+identification+of+unique+protein+profiles+of+apoptotic+bodies+from+biliary+epithelial+cells.">Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells.</a> Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).</li><li>Atkin-Smith, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cell+type-specific+apoptotic+bodies+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting.</a> Scientific Reports. 7, 39846 (2017).</li><li>Jiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+contents+and+cell+origins+of+apoptotic+bodies+by+flow+cytometry.">Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry.</a> Scientific Reports. 7, 14444 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Seit seiner frühen Beschreibung in den 1950er Jahren avancierte das Feld der Apoptose deutlich, immer ein prominenter Forschungsgebiet. Trotz der breiten Interesse und umfangreiche Bemühungen sind bestimmte Aspekte der Apoptose, insbesondere die Bildung von ApoBDs, aufgrund des Fehlens geeigneter Methoden nicht gut untersucht worden. Dazu gehören vor allem die Einschränkung bei der Verfolgung von Apoptose Progression und ApoBD Bildung gleichzeitig mit der traditionellen Durchflusszytometrie A5/PI-Analyse und die Verunreinigungen der ApoBD Isolation. Vor kurzem haben wir Ansätze, um diese methodische Mängel zu beheben.
Unsere neue Flow Cytometry-basierte analytische Ansatz ermöglicht ApoBDs, die werden oft ignoriert, mit traditionellen analytischen Methoden, um erkannt zu werden und20quantifiziert. Darüber hinaus verändert das Flow Cytometry Methode, mit der Verwendung des Flecks TO-PRO-3, zeigt eine zusätzliche A5– Apoptotic früh Rendern daher bessere Abgrenzung der Apoptose Fortschreiten20. Konventionell, ApoBD Erkennung haben setzte stark auf Image-basierte Techniken wie konfokale Mikroskopie und Histologie, während unser Flow-zytometrie-Methode bietet einen Hochdurchsatz-Ansatz zur quantitate ApoBD Bildung. Obwohl scheinbar komplexe, das Verfahren ist relativ einfach und erfordert nur im Handel erhältlichen Reagenzien und eine grundlegende Durchflusszytometer. Die logische Erkennung und präzise Quantifizierung von ApoBDs weiter würde die Kenntnis der apoptotischen Zelle Mikroumgebung, dass Handy-Diktat-Clearance und Immunreaktionen. Durch die Kopplung von hier beschriebenen Flow-zytometrie-Methode mit Organell-spezifische Flecken, in der Tat haben wir vor kurzem die heterogene Verteilung der zellulären Inhalt in ApoBDs24berichtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ApoBDs in verschiedene Untergruppen eingeteilt können und jede Teilmenge ApoBD kann unterschiedliche Funktionen aufweisen.
Unsere neu entwickelten ApoBD ISOLIERUNGSTECHNIKEN würde auch zu Fortschritten im Bereich der extrazellulären Bläschen beitragen. Traditionell gehören Differentielle Zentrifugation Methoden zur Isolierung der ApoBD eine erhebliche Menge an kleineren Zellen, die nachgeschalteten funktionelle Assays beeinträchtigen können. Allerdings kann unsere modifizierte Differentielle Zentrifugation Ansatz verwendet werden, ApoBDs, 97 % Reinheit zu isolieren. Obwohl hoher Reinheit durch Differentielle Zentrifugation erreicht werden kann, kann diese Methode zur Isolierung von ApoBDs von komplexen Proben nicht geeignet. Im Gegensatz dazu unsere FACS-basierte Methode kann ApoBDs zu 99 % Reinheit bereichern, und basiert auf die biologischen Besonderheiten der ApoBDs einschließlich der Partikelgröße, Granularität und PtdSer Exposition, anstatt allein auf Teilchendichte. Dieser Ansatz hat auch die Möglichkeit, gleichzeitig identifizieren und isolieren, ApoBDs andere Zelle Herkunft mit Zelle Typ-spezifische Marker24. Trotz ein langwieriges FACS-Verfahren bringt 1-8 h abhängig von der Menge des ApoBDs benötigt, würde genau ApoBD Isolierung und anschließende nachgelagerte Analyse direkte Zurechnung von der molekularen Eigenschaften und Funktionen des ApoBDs ermöglichen. Für solche Methoden ist es wichtig, dass ApoBD Isolierung Ansätze mit Techniken wie Durchflusszytometrie gekoppelt sind (wie hier beschrieben) um sowohl die Induktion der Apoptose und Reinheit der ApoBD angereicherten Probe zu überprüfen. Darüber hinaus unbedingt richtige FACS einrichten ApoBD Isolierung über der FACS basierenden Ansatz, da geringe Reinheit einen instabilen Stream oder nicht falsch ausgeführte Drop Verzögerung führen kann.
Gemeinsam haben wir modernste Methoden zur Quantifizierung der Apoptose-Induktion, ApoBD Nachweis und Isolierung von hochreinen ApoBDs skizziert. Unser Ansatz kann ein neues Instrument zur Untersuchung des apoptotischen Zelle Demontage Prozess und verdeutlichen die Rolle dieses Prozesses in Krankheit Einstellungen bereitstellen.

Apoptose, eine gut untersuchte Form des programmierten Zelltods, ist erforderlich, um die physiologischen Homöostase aufrechtzuerhalten und potenziell schädliche Zellen im menschlichen Körper1zu entfernen. Nach der Induktion der Apoptose können apoptotische Zellen (ApoCells) durchlaufen eine Reihe von morphologischen Veränderungen und Zerlegen in kleinen Membrane-springen Vesikel bezeichnet ApoBDs. Insgesamt ist dieser Prozess ist bekannt als apoptotische Zelle Demontage und kann in 3 verschiedene Schritte anhand der Morphologie2,3geteilt werden. Schritt 1 (Plasmamembran Blebbing) zeichnet sich durch die Bildung von Ballon-ähnliche Strukturen auf der Zelloberfläche, bekannt als Blebs4,5. Schritt 2 (Apoptotic Vorsprung Bildung) umfasst die Bildung von langen Membran Vorsprünge z. B. Apoptopodia, Perlen-Apoptopodia und Mikrotubuli Spitzen6,7,8. Schritt 3 (ApoBD Bildung) umfasst schließlich die Fragmentierung des apoptotischen Vorsprünge und/oder ApoCells ApoBDs6,9erzeugen. Bisherigen Erkenntnisse haben eine Rolle von ApoBDs in Beihilfe apoptotische Zelle Abstand und Vermittlung interzelluläre Kommunikation vorgeschlagen. Zum Beispiel wird vorgeschlagen, dass die Zersplitterung der ein ApoCell in ApoBDs kleine "mundgerechte" Stücke generieren kann, die durch Phagozyten2,10,11Umgebung leicht entfernt werden konnte. Darüber hinaus können ApoBDs beherbergen eine Reihe von Biomoleküle wie DNA, RNA und Proteine, die zu den umliegenden Zellen Zellezelle Kommunikation12,13,14zu erleichtern gehandelt werden können. Um diese Prozesse funktional zu untersuchen, ist es wichtig, die drei wichtigsten Parameter einschließlich (i) Validierung der Apoptose-Induktion und ApoBD Bildung, (Ii) Isolierung von ApoBDs und (Iii) die Bestätigung der ApoBD Reinheit zu bestätigen.
Bisher wurden eine Reihe von Methoden, einschließlich der Durchflusszytometrie und Elektronenmikroskopie zur Apoptose und ApoBDs15,16,17,18zu studieren. Allerdings sind ApoBD Erkennung und Quantifizierung oft schwierig oder übersehen. Zum Beispiel routinemäßig verwendet Flow Cytometry-basierte Apoptose assay beschäftigt annexin V (A5, ein Protein, das die externalisierte bindet "Essen-mich" Signal Phosphatidylserin (PtdSer)) und Nukleinsäure Flecken Propidium Jodid (PI)19. Jedoch mithilfe dieses universelle Fleck Kombination Analyse setzt voraus, dass es nur drei Arten der Zelle Teilmengen (lebensfähige Zellen, ApoCells und nekrotische Zellen) in der Probe gibt. Darüber hinaus obwohl von vielen Forschern für die Apoptose als "Goldstandard" betrachtet, Durchflusszytometrie assays und anschließende Datenanalyse schließt oft ApoBDs durch gating zunächst FSC/SSCZwischenprodukt hoher Ereignisse auswählen. Also, vor kurzem haben wir einen neuartige Flow Cytometry Assay mit A5 und TO-PRO-3, ein weiteres Nuclein-Fleck, der selektiv durch Caspase 3/7-aktivierte Pannexin 1 (PANX1) aufgenommen werden kann Kanäle7,20. Wie Caspase 3-induzierte PANX1 Aktivierung PtdSer Exposition in der Frühphase der Apoptose vorausgeht, Flecken TO-PRO-3 differentiell apoptotische und nekrotischen Zellen. Darüber hinaus enthält dieser Ansatz kombiniert mit unserem Roman Anspritzung Strategie alle erworbenen Ereignisse während der Datenanalyse und infolgedessen sechs Zelle/Partikel Teilmengen werden identifiziert, einschließlich: (i) lebensfähige Zellen (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5niedrig , TO-PRO-3niedrige), (Ii) A5– frühe ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5niedrig, TO-PRO-3Mittelstufe), (Iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5hoch , TO-PRO-3Mittelstufe), (iv) nekrotische Zellen oder späten ApoCells (FSC/SSCMittelstufe/hohe, A5hoch, TO-PRO-3hohe), (V) ApoBDs (FSC/SSCniedrig, A5zwischen-, TO-PRO-3niedrig / Fortgeschrittene), und (vi) Schutt (FSC/SSCniedrig, A5niedrig, TO-PRO-3niedrige)20. Unser Ansatz betont die Bedeutung der Analyse alle Zellen/Partikel Teilmengen und noch wichtiger ist, die Trennung der ApoBDs von Zellen und Schutt20. So zeigt dieser Ansatz eine effiziente Technik um die Induktion der Apoptose und ApoBD Bildung gleichzeitig zu überprüfen.
ApoBDs traditionell durch eine Vielzahl von Ansätzen Differentielle Zentrifugation isoliert wobei ApoBDs von Zellen oder anderen extrazellulären Vesikel anhand der Dichte getrennt werden können. Allerdings sind solche Zentrifugation Methoden oft durch niedrige ApoBD Reinheit, Mangel an eine Quantifizierung Schritt zur Probe Reinheit und/oder Unfähigkeit, Zelle typspezifischen ApoBDs17,21,22trennen bestätigen begrenzt. Daher entwickelten wir vor kurzem zwei Ansätze, ein FACS-basierten und einen neuen Differentielle Zentrifugation basierenden Ansatz, welche mit unserer vorher festgelegten Flow-zytometrie-Methode, die Induktion der Apoptose und Probe Reinheit23validieren gekoppelt werden kann. ApoBD Isolierung über unsere FACS basierenden Ansatz kann ApoBDs bis zu 99 % Reinheit bereichern und koppelbar mit einer Vielzahl von Zelle-spezifischen Antikörper gegen ApoBDs von gemischten Zellpopulationen, Gewebeproben und Körperflüssigkeiten23zu isolieren. Darüber hinaus zeigt unsere überarbeitete Differentielle Zentrifugation Ansatz eine effiziente Methode, um ApoBDs zu isolieren > 90 % Reinheit23.
In diesem Papier beschreiben wir ausführlich unsere Versuchsanordnung um Apoptose-Induktion, zu validieren und zu erkennen und ApoBD Bildung zu quantifizieren. Auch die ApoBD Isolierung Workflows mit FACS-basierte und Differentielle Zentrifugation basierenden Methoden ausgearbeitet und im Vergleich. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die beschriebene Methodik ein effektives modernstes Werkzeug für zukünftige ApoBD Studien bietet.

<table><tbody><tr><td>Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202)</td><td>ATCC</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin mixture</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FSC</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 iodide</td><td>Life Technologies</td><td>T3605</td><td>TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.</td></tr><tr><td>10x Annexin V binding buffer</td><td>BD Bioscience</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001710526</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tube (15 mL)</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube (1.5 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture incubator (37 &amp;deg;C, 5% CO2)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva 6.1.1 software</td><td>BD Bioscience</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 8.8.6 software</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of apoptotic bodies to high purity

Apoptotic Bodies (ApoBDs), Microvesicles und exosomen gehören die extrazelluläre Vesikel-Familie, mit ApoBDs als eines der größten Art aus. Es wurde vorgeschlagen, dass ApoBDs Zelle sowie interzellulären Kommunikation durch Menschenhandel Biomolekülen unterstützen kann. Herkömmliche Ansätze zur Identifizierung und Isolierung von ApoBDs sind häufig durch das Fehlen der genaue Quantifizierung und niedrigen Probe Reinheit beschränkt. Hier beschreiben wir einen Workflow zur bestätigen die Induktion der Apoptose, ApoBD Bildung zu überprüfen und ApoBDs zu hoher Reinheit zu isolieren. Wir werden auch zu skizzieren und vergleichen Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) und Differentielle Zentrifugation basierte Ansätze, ApoBDs zu isolieren. Darüber hinaus wird die Reinheit der isolierten ApoBDs bestätigt werden, mit einer zuvor Flow Cytometry-basierte Färbung und analytische Methode zu etablieren. Zusammengenommen mit dem beschriebenen Ansatz wurde THP-1 Monocyte Apoptose und apoptotische Zelle Demontage induzierte validiert und ApoBD generiert aus Monozyten THP-1 wurden isoliert zu einer Reinheit von 97-99 %.

Hier beschriebene Verfahren verwenden, THP-1 Monocyte Apoptose induziert wurde und ApoBDs wurden erkannt und isoliert entweder über eine FACS-basierte oder eine Differentielle Zentrifugation Ansatz (Abbildung 1). Erstens Apoptose induziert wurde durch UV-Bestrahlung und Proben wurden nach 2-3 h Inkubation gesammelt, wenn Zellen Apoptose Morphologien, einschließlich Blebbing, apoptotischen Membran Vorsprung Bildung und die Generation der ApoBDs6ausgestellt. Eine TO-PRO-3 und A5-basierte Flow-zytometrie-Methode wurde verwendet, um die Induktion der Apoptose Monocyte und ApoBD Bildung zu bestätigen durch die Trennung von entwicklungsfähigen Zellen, nekrotische Zellen, frühe ApoCells, ApoCells, ApoBDs und Schutt (Abbildung 2). Zusammengenommen, Flow Cytometry Analyse darauf hingewiesen, dass UV-Behandlung in ~ 20 % führt zu einer ApoCells (Abbildung 3).
THP-1 Monocyte ApoBDs wurden dann isoliert von dem WAS über zwei Ansätze. Erstens wurden Proben für eine hohe Reinheit FACS basierenden Ansatz, wo nur ein einziges Zentrifugationsschritt erforderlich ist, um die gesamte Apoptotic Probe vor dem Beflecken Pellet, vorbereitet und FACS. Diese Methode eignet sich für funktionelle Assays, wenn deutlich hoher Abtastrate Reinheit benötigt (z.B. für qPCR-Analyse) wird, wenn eine bestimmte Anzahl von ApoBDs erforderlich ist oder wenn Erwerb von Handy-Typ-spezifischen ApoBDs aus einer komplexen Stichprobe. Mit dieser Methodik, wurden ApoBDs ~ 99 % Reinheit (Abbildung 4) isoliert.
Als nächstes wurden THP-1 Monocyte ApoBDs auch über einen zweistufigen Ansatz Differentielle Zentrifugation isoliert. Der erste Schritt beinhaltet die Isolierung der lebensfähigen Zellen, ApoCells und nekrotische Zellen. Der zweite Schritt umfasst die Trennung der größeren ApoBDs von kleinen extrazelluläre Vesikel wie Microvesicles und exosomen, die nicht in der Lage, bei 3.000 x g. Durchflusszytometrie pelleted erfolgte dann um Apoptose-Induktion und ApoBD Probe Reinheit zu bestätigen und zeigte eine ApoBD angereicherten Probe mit ~ 97 % ApoBDs (Abbildung 4). Dies stellt eine schnelle und effektive Technik, um ApoBD zu relativ hohen Reinheit zu isolieren und ist geeignet, wenn ApoBDs von Proben, die eine einzelne Zelle Art zu reinigen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig1.jpg"> Abbildung 1 . Schematische Darstellung der ApoBD Isolation über entweder einen FACS-basierte oder Differentielle Zentrifugation Ansatz. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58317/58317fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig2.jpg"> Abbildung 2 . Flow Cytometry Strategie gating. Sechs Zellen/Partikel Teilmengen (einschließlich der lebensfähige Zellen, A5– frühe ApoCells, A5+ ApoCells, nekrotische Zellen, ApoBDs und Schutt) wurden identifiziert und verwendet, um ApoBD für FACS-basierte Isolation auszuwählen. (a) Membran Permeabilised nekrotische Zellen sind von nicht-Permeabilised Ereignisse getrennt. (b) A5Low-Intermediate, SSC-tief-hoch -Zellen sind von A5Aufsteigend Ereignisse getrennt. (b.i) für eingehende Analyse, TO-POR-3niedrige lebensfähige Zellen von TO-PRO-3mittlere A5 trennbar– frühe ApoCells. (b.ii) Alternativ Berechnung einfach ApoBD Reinheit, lebensfähige Zellen können getrennt werden vom FSCniedrigen Veranstaltungen. (c) A5geringe Trümmer sind ausgeschlossen. (d) FSCmittleren/hohen ApoCells sind getrennt von FSCniedrige ApoBDs. (e) alle A5-TO-PRO-3mittleren/hohen ApoBDs werden ausgewählt, für die Sortierung. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58317/58317fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig3.jpg"> Abbildung 3 . Validierung der THP-1 Monocyte Apoptose. Flow-zytometrie-Analyse von unbehandelten oder UV-Bestrahlung THP-1 Monozyten wurde durchgeführt, um festzustellen, das Niveau der lebensfähigen Zellen, A5– frühe ApoCells, A5+ ApoCells, und nekrotischen Zellen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58317/58317fig4.jpg"> Abbildung 4 . Reinigung des THP-1 Monocyte-abgeleitete ApoBDs. Flow-zytometrie-Analyse wurde an isolierten THP-1 Monocyte abgeleitet ApoBDs über entweder einen FACS-basierte oder Differentielle Zentrifugation basierten Ansatz zeigt die Bereicherung des ApoBDs von entwicklungsfähigen Zellen, ApoCells und nekrotische Zellen durchgeführt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58317/58317fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Nachweis und Isolierung von apoptotischen stellen hohe Reinheit

Apoptotic bodies (ApoBDs), microvesicles and exosomes are the key members of the extracellular vesicle family, with ApoBDs being one of the largest type. ...

detection-and-isolation-of-apoptotic-bodies-to-high-purity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Aufrufe.  La Trobe University. Ein Workflow mit Flow Cytometry oder Differential Zentrifugation wurde entwickelt, um erkennen, zu quantifizieren und isolieren Apoptotic Körper aus einem Apoptotic Probe zu hoher Reinheit.

Serie: Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon named apoptosis reversal leads to increased tumorigenicity in various cell models under different stimuli. Previous studies have been focused on tracking this process in vitro and in vivo; however, the isolation of real reversed cells has yet to be achieved, which limits our understanding on the consequences of apoptosis reversal. Here, we take advantage of a Caspase-3/7 Green Detection dye to label cells with activated caspases after apoptotic induction. Cells with positive signals are further sorted out by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for recovery. Morphological examination under confocal microscopy helps confirm the apoptotic status before FACS. An increase in tumorigenicity can often be attributed to the elevation in the percentage of cancer stem cell (CSC)-like cells. Also, given the heterogeneity of breast cancer, identifying the origin of these CSC-like cells would be critical to cancer treatment. Thus, we prepare breast non-stem cancer cells before triggering apoptosis, isolating caspase-activated cells and performing the apoptosis reversal procedure. Flow cytometry analysis reveals that breast CSC-like cells re-appear in the reversed group, indicating breast CSC-like cells are transited from breast non-stem cancer cells during apoptosis reversal. In summary, this protocol includes the isolation of apoptotic breast cancer cells and detection of changes in CSC percentage in reversed cells by flow cytometry.

Here, we present a protocol to isolate apoptotic breast cancer cells by fluorescence-activated cell sorting and further detect the transition of breast non-stem cancer cells to breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal by flow cytometry.

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Forschung

Krebsforschung

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a reduction in neuronal population and function. Damaged axons can release excitatory molecules including potassium or glutamate into the extracellular matrix, which in turn, can produce further insult and injury to the supporting glial cells including astrocytes and oligodendrocytes 8, 16. If the insult persists, cells will undergo programmed cell death (apoptosis), which is regulated and activated by a number of well-established signal transduction cascades 14. Apoptosis and tissue necrosis can occur after traumatic brain injury, cerebral ischemia, and seizures. A classical example of apoptotic regulation is the family of cysteine-dependent aspartate-directed proteases, or caspases. Activated proteases including caspases have also been implicated in cell death in response to chronic neurodegenerative diseases including Alzheimer's, Huntington's, and Multiple Sclerosis 4, 14, 3, 11, 7.
In this protocol we describe the use of the NucView 488 caspase-3 substrate to measure the rate of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte (OLG) cell cultures 15, 5, following exposure to different extracellular stresses such as high concentrations of potassium or glutamate. The conditionally-immortalized N19-OLG cell line (representing the O2A progenitor) was obtained from Dr. Anthony Campagnoni (UCLA Semel Institute for Neuroscience) 15, 5, and has been previously used to study molecular mechanisms of myelin gene expression and signal transduction leading to OLG differentiation (e.g.6, 10). We have found this cell line to be robust with respect to transfection with exogenous myelin basic protein (MBP) constructs fused to either RFP or GFP (red or green fluorescent protein) 13, 12. Here, the N19-OLG cell cultures were treated with either 80 mM potassium chloride or 100 mM sodium glutamate to mimic axonal leakage into the extracellular matrix to induce apoptosis 9. We used a bi-functional caspase-3 substrate containing a DEVD (Asp-Glu-Val-Asp) caspase-3 recognition subunit and a DNA-binding dye 2. The substrate quickly enters the cytoplasm where it is cleaved by intracellular caspase-3. The dye, NucView 488 is released and enters the cell nucleus where it binds DNA and fluoresces green at 488 nm, signaling apoptosis. Use of the NucView 488 caspase-3 substrate allows for live-cell imaging in real-time 1, 10. In this video, we also describe the culturing and transfection of immortalized N19-OLG cells, as well as live-cell imaging techniques.

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depola

Live-cell imaging of caspase-3 mediated apoptosis in immortalized N19-oligodendrocyte cell cultures using the NucView 488 caspase-3 substrate. This technique is applicable for programmed cell death assays in real-time in a variety of cell types and tissues.

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

The central nervous system can experience a number of stresses and neurological insults, which can have numerous adverse effects that ultimately lead to a ...

Neurowissenschaften

Flow Cytometric Analysis of Apoptotic Biomarkers in Actinomycin D-Treated SiHa Cervical Cancer Cells

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V and mitochondrial membrane potential) and late biomarkers (caspases 3 and 7, and DNA damage) of apoptosis were measured in experimental and control cultures. Cultures were incubated for 24 hours in a humidified incubator at 37 &#176;C with 5% CO2. The cells were then detached using trypsin and enumerated using a flow cytometric cell count assay. Cells were further analyzed for apoptosis using an Annexin V assay, a mitochondrial electrochemical transmembrane potential assay, a caspase 3/7 assay, and a DNA damage assay. This article provides an overview of apoptosis and traditional flow cytometry, and elaborates flow cytometric protocols for processing and analyzing SiHa cells. The results describe positive, negative, and sub-optimal experimental data. Also discussed are interpretation and caveats in performing flow cytometric analysis of apoptosis using this analytical platform. Flow cytometric analysis provides an accurate measurement of early and late biomarkers for apoptosis.

Apoptosis can be characterized by flow cytometric analysis of early and late apoptotic biomarkers. The cervical cancer cell line, SiHa, was analyzed for apoptosis biomarkers after treatment with Actinomycin D using a benchtop flow cytometer.

Durchflusszytometrische Analyse von apoptotischen Biomarkern in Actinomycin-D-behandelten SiHa-Gebärmutterhalskrebszellen

Apoptosis biomarkers were investigated in actinomycin D-treated SiHa cervical cancer cells using a benchtop flow cytometer. Early biomarkers (Annexin V ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators and executioners of apoptosis, the most studied form of programmed cell death. Apoptosis occurs during developmental processes and is a necessary event in tissue homeostasis. Pyroptosis is another form of cell death that utilizes caspases and is a critical process in activating the immune system through the activation of the inflammasome, which results in the release of members of the interleukin-1 (IL-1) family. To assess caspase activity, target substrates can be assessed. However, sensitivity can be an issue when examining single cells or low-level activity. We demonstrate how a fluorogenic substrate can be used with a population-based assay or single-cell assay by flow cytometry. With proper controls, different amino acid sequences can be used to identify which caspases are active. Using these assays, the simultaneous loss of the inhibitors of apoptosis proteins upon tumor necrosis factor (TNF) stimulation has been identified, which primarily induces apoptosis in macrophages rather than other forms of cell death.

The present protocol describes two methods to measure caspase activity through a fluorogenic substrate using flow cytometry or a spectrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Biochemie

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely used in conjunction with Annexin V to determine if cells are viable, apoptotic, or necrotic through differences in plasma membrane integrity and permeability1,2. The Annexin V/ PI protocol is a commonly used approach for studying apoptotic cells3. PI is used more often than other nuclear stains because it is economical, stable and a good indicator of cell viability, based on its capacity to exclude dye in living cells 4,5. The ability of PI to enter a cell is dependent upon the permeability of the membrane; PI does not stain live or early apoptotic cells due to the presence of an intact plasma membrane 1,2,6. In late apoptotic and necrotic cells, the integrity of the plasma and nuclear membranes decreases7,8, allowing PI to pass through the membranes, intercalate into nucleic acids, and display red fluorescence 1,2,9. Unfortunately, we find that conventional Annexin V/ PI protocols lead to a significant number of false positive events (up to 40%), which are associated with PI staining of RNA within the cytoplasmic compartment10. Primary cells and cell lines in a broad range of animal models are affected, with large cells (nuclear: cytoplasmic ratios &lt;0.5) showing the highest occurrence10. Herein, we demonstrate a modified Annexin V/ PI method that provides a significant improvement for assessment of cell death compared to conventional methods. This protocol takes advantage of changes in cellular permeability during cell fixing to promote entry of RNase A into cells following staining. Both the timing and concentration of RNase A have been optimized for removal of cytoplasmic RNA. The result is a significant improvement over conventional Annexin V/ PI protocols (&lt; 5% events with cytoplasmic PI staining).

An accurate method for the assessment of cell death is described. The protocol improves upon conventional Annexin V/ propidium iodide (PI) protocols, which display up to 40% false- positive events in cell lines and primary cells from a broad range of animal models.

Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Biologie

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Immunologie und Infektion

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...