P19-Zelllinie ist dafür bekannt, sich in Neuronen zu differenzieren. Jedoch, Protokoll für Neuron Differenzierung der P19-Zelllinie sind manchmal kompliziert. Diese Methode ermöglicht es uns, das neurogene Experiment benutzerfreundlich durchzuführen und die Möglichkeit der Verwendung von P19-Zelllinie für die Zukunft zu erweitern.
Zu Beginn, halten P19-Zellen in Wartungsmedium, bestehend aus DMEM, mit 4,5 Gramm pro Liter Glukose, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin, und 100 Einheiten pro Milliliter Streptomycin. Inkubieren Sie die Zellkultur in einer 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Umgebung, bis die Zellen etwa 80% konfluent sind. Entfernen Sie das verbrauchte Medium aus dem Zellkulturkolben und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern Calcium und Magnesium-freiem PBS.
Fügen Sie einen Milliliter 0,25%trypsin-EDTA hinzu, um die Monoschicht der Zellen vollständig abzudecken und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Minuten zu brüten. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob alle Zellen getrennt sind. Setzen Sie die Zellen in neun Milliliter Wartungsmedium aus, um das Trypsin zu neutralisieren.
Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und Zentrifuge bei 200 mal G und Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet. Dann aspirieren Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter frischem Pflegemedium wieder auf und verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellnummer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
Samen 20.000 Zellen pro Quadratzentimeter in einem neuen T-25-Kolben und addieren bis zu 10 Milliliter Wartungsmedium. Bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Tage inkubieren. Um mit der Trypsinverdauung zu beginnen, saugen Sie zunächst langsam den Überstand an und waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern Kalzium und Magnesium-freiem PBS.
Dann fügen Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin EDTA zu den Zellen hinzu und inkubieren sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei bis drei Minuten. Nach der Inkubation, um das Trypsin zu neutralisieren, setzen Sie die Zellen in neun Milliliter Differenzierungsmedium, bestehend aus DMEM mit hohem Glukosespiegel und ergänzt mit 5%fetalem Rinderserum, 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und 100 Einheiten pro Milliliter Streptomycin. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Rohr und Zentrifuge bei 200 mal G und Raumtemperatur für fünf Minuten, um die Zellen zu pellet.
Dann, langsam den Überstand ansaugen und das Pellet in einem Milliliter frischem Differenzierungsmedium ohne RA wieder aufhängen. Verwenden Sie einen Zellzähler, um die Zellennummer gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Für die Aggregaterzeugung beginnen Sie mit der Zugabe von 10 Millilitern Differenzierungsmedium, ergänzt durch fünf Mikroliter RA zu einem 100-Milliliter- und nicht behandelten Kulturgericht. Samen eine Million Zellen in der Kulturschale und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Tage, um die Aggregatbildung zu fördern.
Nach der Inkubation, mit einer 10-Milliliter-Pipette, das Medium, das die Aggregate enthält, ansaugen und bei Raumtemperatur in ein 15-Milliliter-Rohr übertragen. Warten Sie 1,5 Minuten, bis sich die Aggregate am boden begleichen und dann den Überstand verwerfen. Fügen Sie 10 Milliliter frisches Differenzierungsmedium hinzu, ergänzt mit 0,5 Mikromolaren RA. Säen Sie die Aggregate in einer neuen 100-Millimeter-Kulturschale und brüten zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Verwenden Sie zunächst eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellaggregate in ein 15-Milliliter-Rohr zu übertragen. Warten Sie 1,5 Minuten bei Raumtemperatur, bis sich die Aggregate am Boden absetzen und dann den Überstand entsorgen. Waschen Sie die Aggregate mit Serum und antibiotikafreiem DMEM.
Warten Sie, bis sich die Zellaggregate am unteren Rand absetzen, verwerfen Sie den Überstand, und fügen Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin EDTA hinzu. Inkubieren Sie die Röhre in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten, tippen Sie alle zwei Minuten, um die Zellen in Suspension zu halten. Fügen Sie dann vier Milliliter Wartungsmedium hinzu, um die Trypsin-Aktivität und Pipette 20 Mal mit einer Ein-Milliliter-Pipette nach oben und unten zu stoppen.
Schließlich zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 mal G und Raumtemperatur für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in fünf MilliliterWartungsmedium wieder auf. Verwenden Sie einen Zellenzähler, um die Zellennummer zu bestimmen, und fahren Sie mit der Beschichtung der Zellen fort.
Zu Plattenzellen, fügen Sie zunächst drei Milliliter pro Brunnen des Wartungsmediums zu einer Sechs-Well-Kulturplatte hinzu. Dann säen Sie die Zellen mit einer Dichte von 500.000 pro Brunnen. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Säen Sie die Zellen auf Deckgläser in einer Sechs-Brunnen-Kulturplatte. Wenn sie 20% Zusammenfluss erreichen, fahren Sie mit Anti-MAP2-Antikörpern immunfärbung. Isolieren Sie dann RNA und führen Sie Reverse-Transkriptions-PCR für MAP2, NueN, OCT4, NANOG und einen GAPDH durch.
In dieser Studie wird eine vereinfachte Methode zur neuronalen Differenzierung eingeführt. Die P19-Zelllinie wird in einem nicht behandelten Kulturgericht mit 5%FBS und 0,5 Mikromolar RA kultiviert. Nach vier Tagen werden die Zellaggregate mit Trypsin dissoziiert und für die nächsten vier Tage auf einer anhaftenden Zellkulturplatte gesät. Die Wirksamkeit dieser Methode wird durch den Vergleich zwischen der RTPCR-Analyse der P19-Zelllinie in einem undifferenzierten Zustand und während der Neurogenese bewertet.
Die Ergebnisse zeigen eine schnelle Abnahme der Expression von Pluripotenz-Genen wie Oct4 und NANOG und eine Upregulation von neurnomalen Markergenen wie MAP2 und NeuN. Wir glauben, dass die in dieser Studie entwickelte Methode einfach ist und eine Rolle bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen der Neurogenese sowie der neurodegenerativen Erkrankungen spielen wird.
