Name: generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Koch-Institut-Unterstützung (Kern) Grant P30-CA 14051 vom National Cancer Institute, von den nationalen Instituten der Gesundheit Grant (CA206157-22 und GM118066) und Curt Marmor Cancer Research Fund, Angelika Amon unterstützt. Angelika Amon ist auch ein Investigator am Howard Hughes Medical Institute und Glenn Foundation for Biomedical Research. S. S. wurde von der amerikanischen italienischen Krebs-Stiftung (AICF), durch ein Stipendium in der Krebsforschung von Marie-Curie-Maßnahmen und die italienische Vereinigung für Cancer Research (AIRC), und eine KI Quinquennial Cancer Research Fellowship unterstützt. E.M wurde durch ein Stipendium aus dem Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

Kultur-Zustand
RPE-1 hTERT-Zell-Linie wurde in Dulbeccos geändert Eagle Medium (Table of Materials) ergänzt mit 10 % kultiviert fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin. Zellen wurden bei 37 ° C mit 5 % CO2 in eine feuchte Umgebung inkubiert. Die nachfolgend beschriebene Protokoll entwickelt wurde, mit 10-cm-Gerichte und alle technischen Details berichtet beziehen sich auf die Gerichte. Skalieren, wenn verschiedene Gerichte, oben oder unten entsprechend.
(1) Synchronisation der RPE-1-Zellen
<ol><li>Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen, die nicht mehr als 15 Passagen für alle Experimente durchlaufen haben. Am 1. Tag Tauen und ~2.5 - 5,0 x 105 RPE-1-hTERT-Zellen in der Kulturschale 10 cm Gewebe zu verzichten. 8 mL standard Wachstumsmedium hinzugeben und über Nacht inkubieren. Zellzahl Standardzelle Zähler (z. B. ein Hemocytometer) zu bestimmen. Hinweis: Zelldichte Wachstumsbedingungen des RPE-1-Zellen bezeichnet. Wachstumsbedingungen variieren zwischen verschiedenen Zelllinien; Betrachten sie entsprechend anpassen.</li>
	<li>Am 2. Tag synchronisieren Sie Zellen an der G1/S-Grenze durch regelmäßige Wachstumsmedium Absaugen und Hinzufügen von 8 mL 5 mM Thymidin-haltigem Medium. Hinweis: Thymidin Konzentration und Dauer der Behandlung variieren in verschiedenen Zelllinien. Es ist ratsam, pilot Experimente ermitteln die besten Voraussetzungen für die Zelle Zeile(n) getestet werden.</li>
	<li>Am 3. Tag, 24 h nach dem Hinzufügen von Thymidin Medium (Schritt 1.2) Thymidin-Block durch Absaugen von Medium und Zellen dreimal mit 1 X PBS waschen befreien. Geben Sie 8 mL regelmäßige Wachstumsmedium hinzu und wieder Platten in den Inkubator.</li>
</ol>2. Generation von Aneuploiden Zellen durch Interferenz mit der Tätigkeit der mitotischen Kinase Mps1
<ol><li>Am 3. Tag, 6 h nach der Entlassung von Thymidin-Block (Schritt 1.3; Dies ist ca. 3-6 h, bevor Zellen Mitose eindringen), Aspirieren Medium, einmal mit 1 X PBS waschen und mit 500 nM Reversine (Mps1-Hemmer)-haltigem Medium zu ersetzen. Hinweis: RPE-1-Zellen eindringen Mitose 9-12 h nach Thymidin Auswaschen10,11. Jedoch Zellzykluskinetik variieren zwischen den verschiedenen Zelllinien. Daher ist es wichtig diese Kinetik in Pilotversuchen durch Analyse der Zellzyklus durch bewährte Methoden (z.B.durch die Messung des DNA-Inhalt über FACS-Analyse) zu bestimmen. Darüber hinaus variiert die optimale Arbeit Konzentration Mps1 Inhibitor von Zelllinien. Frühere Experimente mit RPE1 Zellen wurden erfolgreich mit Reversine in einer Arbeitsgruppe Konzentration von 500 nM10,11,12. Es ist ratsam, pilot Experimente ermitteln die optimale Konzentration für die Zell-Linie getestet werden.</li>
	<li>Am Tag 4, 12 h nach Reversine Behandlung (ca. 6 h nach Zellen in Mitose waren) Aspirieren Sie Reversine Medium und waschen Sie Zellen dreimal mit 1 X PBS. Die Platte 8 mL regelmäßige Wachstumsmedium hinzu und Zellen in den Inkubator zurück.</li>
</ol>3. Entfernung von Radsport Aneuploiden Zellen und Anreicherung von ArCK Bevölkerung
<ol><li>Am Tag 6, ca. 72 h nach Zellen der ersten Mitose eingeben (Schritt 2.2; Dies ist ca. 66 h nach Reversine Auswaschen, das entspricht etwa 2-3 Zelle Zyklen), Aspirieren Medium, einmal mit 1 X PBS waschen und mit 300 nM Nocodazole-haltigem Medium zu ersetzen. Hinweis: Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass RPE-1-Zellen beherbergen aneuploiden Karyotypen genomisch instabil sind und ihre Verbreitung über verhaften 2-3 Zelle Zyklen nach dem ersten fehlerhaften Mitose10. Allerdings variieren diese Kinetik unter verschiedenen Zelllinien. Daher ist es entscheidend für pilot Experimente um das richtige Timing für die Entfernung von Radsport aneuploiden Zellen zu bestimmen.</li>
	<li>Am Tag 7, 12 h nach der Nocodazole Behandlung Aspirieren Sie Medium und 3 mL 1 X PBS auf den Teller. Der mitotischen Zellen durch Tippen auf die Seite der Platte abschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jeder Berührung, sogar die Entfernung der mitotischen Zellen ermöglichen.</li>
	<li>Um die vollständige Entfernung der mitotischen Zellen gewährleisten, wiederholen Sie schütteln-off für mehrere Runden (3-5 mal empfohlen), Absaugen und das Hinzufügen von 3 mL 1 X PBS zwischen jeder Runde.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach dem schütteln sanft jede Flüssigkeit, die den Deckel oder die Kante der Platte eingehalten. Kurz, überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Sicherstellen Sie, dass nur wenige mitotische Zellen beobachtet werden. Wenn mehr als fünf mitotische Zellen unter 10 X Objektiv gesehen werden, wiederholen Sie eine weitere Runde der Shake-off. Hinweis: Mitotische Zellen scheint abgerundet und können nach dem schütteln teilweise getrennt werden. Es ist entscheidend für die vollständige Entfernung der mitotischen Zellen vor der Belichtung der Zellen in die nächste Runde der Nocodazole Behandlung zu gewährleisten. Nichtbeachtung kann zur mitotischen Zelltod führen und/oder bei der Erzeugung von tetraploiden Zellen führen.</li>
	<li>Waschen Sie nach dem letzten Shake Zellen einmal mit 5 mL 1 X PBS. Fügen Sie 8 mL Medium mit 330 nM Nocodazole in die Platte und 12 h inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie Nocodazole Behandlung/Shake-off (Schritte 3.1-3.5) alle 12 h bis keine mitotischen Zellen nach Inkubation eingehalten werden. In der Regel sind 4 bis 5 Runden Behandlung/Shake-off empfohlen. Hinweis: Die hier bereitgestellten Informationen beziehen sich auf RPE-1-Zellen. Die Anzahl der runden Behandlung/Shake-off variieren zwischen verschiedenen Zelllinien. Zur Vermeidung von langwierigen und unnötige Exposition gegenüber Nocodazole ist es entscheidend, die in einem Pilotversuch sorgfältig die Anzahl der Runden, die für die effiziente und vollständige Entfernung der Radsport aneuploiden Zellen bestimmen.</li>
	<li>Fügen Sie nach 4 bis 5 Runden der Nocodazole Behandlung/Shake-off (Schritte 3.1-3.6) 10 mL regelmäßige Wachstumsmedium und inkubieren. Lassen Sie Zellen für 12-24 h vor Manipulationen oder Assay Nachnutzung ruhen. Hinweis: Nach dem letzten Shake, Zellen bleiben auf der Platte sind Zellzyklus verhaftet und vor kurzem10, siehe Hafen komplexe Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen bezeichnet. Es ist ratsam, Assays auf ArCK Populationen innerhalb einer Woche nach der Isolation führen.</li>
	<li>Optional, den Anteil der verhafteten Zellen mit komplexen Karyotypen bewerten, sammeln Sie und zählen Sie Zellen von jeder Shake off Standardzelle Zähler.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Abbildung 1: insgesamt schematische der Methode zum Generieren und Isolieren von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp (ArCK) und repräsentative Bilder. (A) schematische ArCK Zellen Generation und Isolation Protokoll. (B) repräsentative Bilder der RPE-1 hTERT Zellen in jeder Phase der Behandlung. Letzte Paneel (rot dargestellt) repräsentiert die isolierten Zellen ArCK. Skala bar 100 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
4. Charakterisierung der ArCK Bevölkerung
<ol><li>Bestätigen Sie erfolgreiche Isolierung der ArCK Bevölkerung durch Ausführen der folgenden Tests.<ol>
<li>Esel Beta-Galaktosidase Färbung (die Markierung der Seneszenz) mit einem handelsüblichen kit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Sekretion von Pro-inflammatorischen Zytokinen, z. B. CCL2, durch den Einsatz von handelsüblichen Kits (siehe Tabelle der Materialien) zu messen.</li>
		<li>Erhöhte Niveaus des Zellzyklus-Hemmer p53, p21, p16 durch Western-Blot zu bestätigen. Hinweis: Um diese Tests richtig zu steuern, sollte ArCK Populationen mit euploide und Aneuploidie Radsport Zellen verglichen werden. Ersteres ist niedrig Durchgang, Wildtyp RPE-1 hTERT Zellen wächst exponentiell. Letztere erhalten Sie durch Induktion Chromosom MIS Segregation im RPE-1 hTERT und Ernte Zellen 72 h nach der ersten aberranten Mitose. Folgen Sie dazu das Protokoll beschriebenen Schritt 1.1 und Ernte Zellen direkt vor der ersten Nocodazole-Behandlung (Schritt 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie einzellige Sequenzierung um den Karyotyp der verhafteten Zellen zu beurteilen. Hinweis: Einzellige Sequenzierung ist eine etablierte Methode zur Bestimmung von chromosomaler und Sub-chromosomaler Veränderungen in einer Zellpopulation an der Einzelzelle Level13. Modalitäten für einzellige Sequenzierung durchführen finden Sie ebenfalls10.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy.">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li><li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer:+from+yeast+to+man.">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li><li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer.">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li><li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boveri+revisited:+chromosomal+instability,+aneuploidy+and+tumorigenesis.">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li><li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress,+senescence+and+cell+depletion.">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li><li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells.">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668 (2015).</li><li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability.">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754 (2016).</li><li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast.">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li><li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast.">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).</li><li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System.">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li><li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation.">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes &amp; Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li><li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine.">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li><li>L&#243;pez-Soto, A., Gonzalez, S., L&#243;pez-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes.">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li><li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown!.">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!.</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese neuartige Methode zu erzeugen und zu bereichern für festgenommene Zellen mit komplexen Karyotypen (ArCK) ermöglicht die Untersuchung von Zellen, die mehrere Chromosom Gewinne oder Verluste und aufhören zu teilen. Die Methode Setup wurde entwickelt, um die Isolation der ArCK Zellen auf eine schnelle und zuverlässige Weise zu erleichtern.
Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist rigoros die Timeline der medikamentösen Behandlung und vor allem die Beseitigung von Radsport aneuploiden Zellen steuern. Um optimale Ergebnisse zu erzielen ist das Timing von Nocodazole Behandlung und Shake-off von besonderer Bedeutung, um sicherzustellen, dass Radfahren Zellen von der Platte entfernt werden, während sie noch abgerundet und mitotischen, die Möglichkeit der mitotischen Zelltod oder Schlupf in G1 zu verhindern, potenziell Erstellen einer tetraploiden Bevölkerung. Es wird nicht empfohlen, dass das Timing der Shake-aus mehr als zwei Stunden von der empfohlenen 12-h-Nocodazole-Inkubation abweicht.
Zukünftige Studien an Zellen das Potenzial haben, zu ein tieferes Verständnis der wie komplex Karyotypen erleichtern ArCK beeinflussen Zellphysiologie. Insbesondere zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass Zellen des Immunsystems in der Lage sind zu interagieren und Trigger immun Clearance von ArCK10 Zellen. Die hier beschriebene Methode bietet einen hervorragenden Ausgangspunkt für die weitere Charakterisierung der ArCK Zellen, einschließlich der Klärung von den molekularen Mechanismen immun Lichtung im untransformierten Zellen und die Studie wie Onkogenen Transformation kann dieser Überwachungsmechanismus, eine entscheidende Frage in das Feld14,15umgehen.

Fehler in den Prozess der Trennung der Chromosomen führen zu Aneuploidie, ein Zustand, gekennzeichnet durch eine Chromosomenzahl, die kein Vielfaches der haploiden Ergänzung1,2,3,4. Aneuploidie Karyotypen Trigger Replikation Stress, die weiter genomische Instabilität5,erzeugt6,7,8,9,10, erhöht Karyotyp Komplexität, und letztlich zu Zellzyklus Festnahme von einer Subpopulation von Zellen10führt. Die hier vorgestellte Methode soll zu generieren und so eine Subpopulation aus dem Radsport Zellen zu trennen. Durch den Einsatz von preiswerten Gewebekultur Techniken, erleichtert dieses Protokoll die Isolierung und Charakterisierung des Zellzyklus verhaftet aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen und ihre euploide Radsport Gegenstücke als Steuerelemente bezeichnet.
Dieses Protokoll ist die erste, für diesen Zweck eingerichtet werden und ermöglicht für die Isolierung und weiter zu studieren, ArCK Linien einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ihre induzierte Seneszenz und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP), ihre Pro-inflammatorischen Funktionen und ihre Fähigkeit, mit Immunzellen zu engagieren. Die hier vorgestellte Methode entwickelt wurde, in den untransformierten, verewigt menschlichen Zellen aber in Krebs Linien noch nicht getestet. Einige transformierten Zellen möglicherweise unempfindlich gegen Zellzyklus Festnahme aufgrund der Unterdrückung der einen oder mehrere Pfade; Daher sollten weitere Validierung in anderen Zelllinien durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium)&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 antibody</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Senescence b-Galactosidase Staining Kit</td><td>Cell Signaling Technology&amp;nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

generation and isolation of cell cycle-arrested cells with complex karyotypes

Chromosom MIS Trennung führt zu Aneuploidie, eine Bedingung, in denen Zellen eine unausgewogene Chromosomenzahl beherbergen. Einige Linien des Beweises deuten stark, dass Aneuploidie löst Genom Instabilität, letztlich Erzeugung von Zellen mit komplexen Karyotyp, die ihre Verbreitung zu verhaften. Isolierung und Charakterisierung von Zellen beherbergen komplexe Karyotypen sind entscheidend für die Auswirkungen einer unausgewogenen Chromosomenzahl auf Zellphysiologie untersuchen. Bisher wurden keine Methoden zuverlässig solche aneuploiden Zellen isolieren gegründet. Dieses Dokument enthält ein Protokoll zur Bereicherung und Analyse von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen standard, preiswerte Gewebekultur Techniken. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um mehrere Funktionen von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen einschließlich ihrer induzierte Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp, Pro-inflammatorische Eigenschaften und Fähigkeit zur Interaktion mit Immunzellen zu analysieren. Da Krebszellen oft Ungleichgewichte im Chromosom Nummer Hafen, ist es wichtig, zu entschlüsseln, wie Aneuploidie Zellphysiologie in normalen Zellen, mit dem Ziel der Aufdeckung seiner Pro und anti tumorigenic Effekte auswirkt.

Diese Methode nutzt eine in-vitro- Gewebekultur-System um aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die ihre Verbreitung zu verhaften. Diese Bevölkerung wird als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotypen) Zellen bezeichnet. Abbildung 1A zeigt das Schema des Experiments. Wildtyp Radsport RPE-1 hTERT Zellen sind an der G1/S-Grenze mit Thymidin synchronisiert und behandelt mit einem Mps1-Inhibitor, Chromosom MIS Segregation zu induzieren. Die Spindel vergiften Nocodazole ergänzt die Zellen 72 h nach Induktion der Chromosom MIS Segregation. 12 h nach der Nocodazole Behandlung der aneuploiden Zellen, noch in der Lage zu vermehren sind, geben Sie Mitose und befinden sich in dieser Phase des Zellzyklus aufgrund von Interferenzen mit Mikrotubuli Polymerisation gefangen. Diese gefangen Zellen werden dann einfach durch sanftes schütteln entfernt. Der Shake-off-Prozess soll wiederholte 3 - 5 Mal vollständige Entfernung des Radsports Zellen sichergestellt. Abbildung 1 b zeigt die repräsentative Bilder der RPE-1-Zellen in jeder Phase der Behandlung.
ArCK Zellen zeigen erhöhte der Zellzyklus-Inhibitoren, wie p53, p21 und p16 im Vergleich zu euploide und aneuploiden Zellen, Radfahren, wie in Abbildung 2Agezeigt. Darüber hinaus zeigt Abbildung 2 b positive β-Galaktosidase Färbung in ArCK Zellen im Vergleich zu euploide Kontrollzellen, eine gut etablierte Marker für zelluläre Seneszenz.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung ArCK Zellen. (A) Western-blot Beurteilung der Zellzyklus Inhibitor Ebenen in euploide, Aneuploidie, Radfahren und ArCK Zellen. Die Ebenen von p53, p21 und p16 wurden durch western-Blot Analyse ermittelt. Aktin als laden Kontrolle diente. (B) β-Galaktosidase Färbung, die Höhe der Seneszenz in ArCK Zellen. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (β-Gal) Aktivität war in euploide und ArCK Zellen bestimmt. Skala bar 100 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Diese Zellzyklus Festnahme ist ein hervorstechendes Merkmal der aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp, wie gezeigt durch repräsentative Karyotyp Analyse von einzelligen Sequenzierung in Abbildung 3, in dem ArCK Zellen mehrere Anzeigen zufällig Chromosom Gewinne und Verluste. Dieser Befund ist in voller Übereinstimmung mit früheren Berichte10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative einzellige Sequenzierung von ArCK Zellen. Segmentierung Grundstücke zeigen den Karyotyp der sechs repräsentative ArCK Zellen. Segmentierung Diagramme zeigen die Kopienzahl alle Chromosomen von 1 bis X bezogen auf ein euploide Verweis auf eine Log2 Skala (Wilde Typ RPE-1 ist eine diploide Zelle Linie weiblichen Ursprungs). Chromosom-Gewinne werden in rot, Chromosom Verluste in grün hervorgehoben. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.

Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

10.4K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology. Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.

Serie: Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Forschung

Genetik

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum deprivation; chemicals which arrest cells at different cell cycle phases; or the use of mitotic shake-off which exploits their reduced adherence. However, all of these have disadvantages. For example, serum starvation works well for normal cells but less well for tumor cells with compromised cell cycle checkpoints due to oncogene activation or tumor suppressor loss. Similarly, chemically-treated cell populations can harbor drug-induced damage and show stress-related alterations. A technique which circumvents these problems is counterflow centrifugal elutriation (CCE), where cells are subjected to two opposing forces, centrifugal force and fluid velocity, which results in the separation of cells on the basis of size and density. Since cells advancing through the cycle typically enlarge, CCE can be used to separate cells into different cell cycle phases. Here we apply this technique to primary acute lymphoblastic leukemia cells. Under optimal conditions, an essentially pure population of cells in G1 phase and a highly enriched population of cells in G2/M phases can be obtained in excellent yield. These cell populations are ideally suited for studying cell cycle-dependent mechanisms of action of anticancer drugs and for other applications. We also show how modifications to the standard procedure can result in suboptimal performance and discuss the limitations of the technique. The detailed methodology presented should facilitate application and exploration of the technique to other types of cells.

This protocol describes the use of centrifugal elutriation to separate primary acute lymphoblastic leukemia cells into different cell cycle phases.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Krebsforschung

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Biochemie

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Entwicklungsbiologie

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biologie

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...