In dieser Handschrift beschriebenen Arbeiten wurden mit Mitteln des Patrick F. Taylor Stiftung ermöglicht.

1. Chromosom Ernten von adhärenten Zellen <ol><li> Standard-Protokoll <ol><li> Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. Wenn die Zellen logarithmischen Phase (80% Konfluenz) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. Ein Minimum von 2 x 10 6 Zellen empfohlen. </li><li> Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator für 45 min. Verwendung einer sterilen Pipette Medien von Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Beiseite stellen. </li><li> Behutsam die Zellen durch Zugabe von 2 ml HBSS-Puffer in den Kolben. Swirl Puffer und entfernen Sie dann mit einer Pipette. Entsorgen. </li><li> 1 ml Trypsin, um sicherzustellen, dass es die gesamte Oberfläche der Flasche bedeckt. Nur lassen die Zellen in Trypsin für ca. 2 min. Nachdem die Mehrheit der Zellen freistehend, pipettieren, die Medien in der konischen Rohr wieder auf den Zellen. </li><li> Übertragen der Zellsuspension in 10 ml-Aliquots in 15 ml konische Röhrchen.Zentrifuge bei 200 × g für 10 min. Überstand entfernen und das Pellet. </li><li> 10 ml 0,075 M KCl, die auf 37 ° C zu der verbleibende Pellet im konischen Rohr vorgewärmt wurde. Wirbelrohr bei mittlerer Geschwindigkeit zu KCl und Zellen mischen. </li><li> Zellen bei 37 ° C für 10 min. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Überstand entfernen (bis etwa 0,5 ml Überreste) und Pellet erneut. </li><li> Zu den Zellen unter Vortexen: 5 ml frischem Carnoy-Fixativ (Eisessig 3:1-Verhältnis von Methanol) Vorsichtig. Daraufhin 5 ml mehr ohne Fixiermittel Vortexen für insgesamt 10 ml. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand entfernen und resuspendieren Zellen. 5 ml der Fixierlösung in jedes Röhrchen. Die Zellen können nun in 4 ° C für bis zu einem Jahr gelagert werden. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom harvesting Lymphoblastoidzelllinien <ol><li> Wachsen Zellen nach bestimmten Zellkulturbedingungen. (Verwenden Sie geeignete Kanne für die Menge an Zellen in Kultur). Wenn die Zellen logarithmischen Phase (etwa 2 Tage nach Zellen aufgeteilt sind) erreicht, mit 10 ul / ml Colcemid zu der Zellkulturflasche. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus Vollblut Phytohämagglutinin (PHA), ein Lektin aus der roten Bohne abgeleitet ist, ist ein leistungsfähiges Mitogen für humane T-Zellen 16. 72 Stunden nach der Zugabe von PHA in die Kultur, etwa 45% der Zellen in der S-Phase. Dies stellt den Peak mitotische Aktivität und der optimale Punkt, an dem für Chromosomenstudien ernten. Andere Mitogene, wie Pokeweed (1-10 ug / ml) kann, wenn B-Zellen analysiert 17,18 verwendet werden. <ol><li> Sammeln Sie mindestens 1 ml Vollblut in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Verwenden Sie innerhalb von 3 Tagen nach der Sammlung. Shop Blut bei RT until bereit. </li><li> Aliquots von 0,25 ml Vollblut in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon und 1% PHA). Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li><li> Änderung des Protokolls Nr.: Chromosom Ernte aus dem Knochenmark Zytogenetische Analyse auf das Knochenmark ist hilfreich bei vielen malignen hämatologischen Erkrankungen, wie die Beobachtung eines chromosomal abnormen Klon kann diagnostisch für eine bestimmte Art der Leukämie. Chromosomenstudien werden auch verwendet, um den Krankheitsverlauf wie der Beginn der Blastenkrise und Ansprechen auf die Therapie zu beurteilen. Da Knochenmarkzellen werden aktiv teil ist keine Mitogenstimulation notwendig 9,19. Bei akuten Leukämien 24 und 48 h Kulturen werden ebenfalls eingerichtet. <ol><li> Sammeln Sie mindestens 1 ml Knochenmark in einem grünen Top Natrium-Heparin-Röhrchen. Aliquots von 0,25 ml Knochenmark in 10 ml vollständigem RPMI-Medium, das L-Glutamin (20% fötales Rinderserum, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% Fungizon). Bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Slide Vorbereitung und Solid-Färbung Eine schnelle Auswertung von einem Vertreter Folie wird Informationen über die Qualität der Ernte, bevor wieder weitere Verfahren wie die G-Bänderung, FISH, CGH, SKY oder bereitzustellen. Manche Labors lieber festen Fleck die Zellen für die schnelle Ernte und Chromosom Beurteilung. Alternativ kann ein Phasenkontrastmikroskop für diese Analyse verwendet werden. Objektträger werden am besten vorbereitet, wenn die Luftfeuchtigkeit etwa 50% und die Temperatur der Umgebungs (20-25 ° C). <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 200 × g für 5 min bei 25 ° C. Entfernen Sie den Überstand bis nur 0,3-0,5 ml verbleibt. </li><li> Nach vorsichtigem Resuspendieren des Pellets, Pipette drei Tropfen der Zellsuspension aus einer Entfernung von etwa 2 auf eine Folie, die in einem Winkel von etwa 45 ° geneigt und ermöglichen der Suspensionum über die Rutsche rollen. In einem großen Tropfen Frisch Carnoy-Fixativ auf der Folie. </li><li> Trocknen Sie die Rückseite der Folie auf ein Papiertuch und dann sitzen die Folie zum Trocknen für mindestens 10 min. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein. </li><li> Bereiten Sie frischen Giemsa-Färbelösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. Spülen Sie mit destilliertem Wasser gleitet, abtropfen und an der Luft trocknen. </li><li> 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Wenn die Metaphase Zellen reichlich und gut verteilt sind, können die restlichen Folien für andere experimentelle Verfahren verwendet werden. </li></ol> 3. G-Banding Mit Trypsin und Giemsa (GTG) &lt;p&gt; Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das euchromatic Histone in DNA-Bereichen mit höheren Transkriptionsaktivität resultierende denaturiert. Nach Giemsa-Färbung, werden diese Regionen als Streifen treten. Hoch verdichtete Chromatin mit wenig oder ohne Transkriptionsaktivität (Heterochromatin) einen großen Teil seiner Histone vom Trypsin geschützt haben und daher dunkel färben folgenden Giemsa. Es ist wichtig, zunächst G-Band eine Folie, um die Bedingungen zu überwachen und einstellen Trypsin Timing bei Bedarf für die folgenden Folien. <ol><li> Fügen Sie die folgenden Lösungen bis 4 Coplin Gläser. Glas # 1 = 30 ml 1X HBSS und 4 ml 10x Trypsin (0,5%) Jar # 2 = 50 ml 1x HBSS Glas # 3 = 45 ml 1X HBSS und 5 ml fötales Rinderserum Jar # 4 = 50 ml 1x HBSS </li><li> Tauchen Sie jede Folie im Glas Nr. 1 für 5 Sekunden, schnelle Spülung in Jar # 2, lassen jede Folie im Glas Nr. 3 für mindestens 30 sec, schnelles Spülen im Glas Nr. 4 dann lassen Folien zu trocknen. </li><li> Bereiten fresh Giemsa-Lösung (3:1-Verhältnis von Gurr Buffer und Giemsa-Färbung). Legen Sie die Folien auf eine Färbung Rack. Decken Sie die gesamte Folie in der Giemsa-Lösung. Lassen Sie die Folien in der Farblösung für 5 min zu bleiben. </li><li> Spülen Sie gleitet in destilliertem Wasser in der gleichen Reihenfolge, dass sie gefärbt wurden. Die Objektträger für 10 min trocknen. Der Schlitten sollte vollständig trocken sein. </li><li> 4 Tropfen Permount und ein Deckglas auf den Objektträger. Stellen Sie sicher, dass keine Blasen unter dem Deckglas. Das überschüssige Permount kann mit einem Papiertuch entfernt werden. </li><li> Analysieren Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung. Einstellen Trypsin Zeitpunkt der Rest der Schlitten auf der Basis der Ergebnisse der ersten Folie. </li></ol>

<ol><li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+screening+for+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li>
<li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussbuam%2C+R+%22Genetics+in+Medicine%3A+7th+Edition%22">Genetics in Medicine: 7th Edition</a>. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).</li>
<li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Obstet.+Gynecol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li>
<li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions%5BTitle%5D)+AND+%22Ginecol.+Pol%22%5BJournal%5D)">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li>
<li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stillbirth+classification%E2%80%94Developing+an+international+consensus+for+research%3A+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li>
<li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+congenital+heart+defects%3A+Current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li>
<li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Syndrome%3A+Trisomy+21.%5BTitle%5D)+AND+%22PubMed+Health%22%5BJournal%5D)">Down Syndrome: Trisomy 21.</a> PubMed Health. , (2010).</li>
<li>Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li>
<li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li>
<li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li>
<li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li>
<li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev.+Rep%22%5BJournal%5D)">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li>
<li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+cytogenetics%3A+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li>
<li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22The+Association+of+Genetic+Technologists+Cytogenetics+Laboratory+Manual.+San+Francisco%3A+3rd+edition%22">The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition</a>. , ACT. Houston, TX. (1997).</li>
<li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22In+Clinical+Laboratory+Medicine%2C+2nd+edition%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).</li>
<li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7R%CE%B1+deficiency+in+p53%28null%29+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Different%22%5BJournal%5D)">IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li>
<li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--%3Eqter+due+to+paternal+Y%3B+16+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li>
<li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li>
<li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+conventional+cytogenetics+%28G-banding%29%2C+comparative+genomic+hybridization+%28CGH%29+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+%28i-FISH%29+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li>
</ol>

Wir haben die vorliegenden Verfahren für Chromosom Isolierung aus Zellen von verschiedenen Organismen, einschließlich von verschiedenen humanen Zelltypen zu erhalten, Rhesus-Makaken, Ratten und Mäuse verwendet 11,20-22. Das Standardprotokoll vorgesehen ist, aber bestimmte Schlüsselschritte und Variablen benötigen, um für diese verschiedenen Arten von Zellen eingestellt werden. Mehrere spezifische Schritte in dem sowohl die chromosomale Herstellung und G-banding, um die bestmögliche Qualität der Ergebnisse sicherzustellen entscheidend. Eine der Variablen, die den Assay beeinflussen kann, ist die Inkubationszeit Colcemid. Zu wenig Zeit in Colcemid ergibt weniger Metaphasespreitungen und länger, überlappt Chromosomen. Längere Inkubationszeiten in Colcemid wird kürzer und dicker Chromosomen, die schwierig zu analysieren sind, führen. Eine weitere wichtige Variable ist die Molarität der hypotonischen Lösung. Eine 0,075 M Kaliumchlorid-Lösung werden die Zellen gerade genug, um die richtige Chromosom verbreiten, ohne Lyse der Zellen ergeben anschwellen. Beim Hinzufügen vonder Carnoy-Fixativ-Lösung, müssen die ersten 5 ml zu dem Pellet unter Mischen zugegeben werden. Dies gewährleistet, dass alle zusätzliche Proteine ​​werden vor dem Speichern der Herstellung von Folien oder Proben entnommen. Wenn in dem Fall, dass die Zellen nicht gut genug gemischt, wird eine gelbe Kappe Protein auf der Oberseite des Pellet zu bilden, die bei der anschließenden Verfahren zu Komplikationen führen kann. Die richtige Folie Vorbereitung ist unerlässlich. Während Fallenlassen des resuspendierten Zellpellet auf Objektträger, stellen Sie sicher, dass der Schieber auf ca. 45 ° Winkel geneigt und es gibt genügend Abstand (mindestens 2 cm) aus der Pipette auf den Objektträger, so dass die Chromosomen korrekt auf den Objektträger für die Analyse zu verteilen . Überschwemmung die Folie mit Fixiermittel unmittelbar nach Ablegen der Zellen auf dem Objektträger wird auch helfen, die Chromosomen zu verbreiten. Temperatur und Luftfeuchtigkeit, die, wie schnell die Zellsuspension trocknet an der Folie beeinflussen, sind andere Faktoren, die Einfluss auf Chromosom verbreiten. Diese können<html> Herstellung von Folien in einer Umgebung mit etwa 50% Feuchte und einer Temperatur von etwa 20-25 ° C kontrolliert, und / oder indem gleitet auf einer Trägerwärmer für schnelleres Trocknen. G-Banding, der Hauptfaktor, der die Qualität der Chromosomen beeinflusst, ist die Trypsin Belichtungszeiten. Bei einer längeren Exposition Trypsin, erscheinen Chromosomen verteilt und geschwollen. Umgekehrt wird ein unzureichend kurze Chromosomen mit Trypsin-Inkubation nicht zu unterscheiden Bands und wenig Kontrast ergeben. Das Trypsin Inkubation Timing ist Änderungen vorbehalten abhängig von jedem spezifischen Zelllinie und Erntebedingungen. Deshalb sollte ein Vertreter G-gebändert Folie zuerst bereit ist, die Bedingungen vor der Färbung Trypsin den Rest der Folien zu evaluieren. Fetales Rinderserum verwendet, um die Trypsin-Aktivität vor der Färbung zu inaktivieren. Wir stellen das Protokoll mit Giemsa (GTG), aber Wright-Färbung anstelle Giemsa für GTW Streifenbildung und führt zu ähnlichen Ergebnissen verwendet werden. t &quot;&gt; Dieses Verfahren ist relativ preiswert und effektiv durchzuführen. G-Banding kann verwendet werden, um Chromosomenanomalien, wie Translokationen, Deletionen und Aneuploidie, die üblicherweise bei malignen Erkrankungen, genetischen Störungen gesehen werden Diagnose-und Stammzellen in vitro kultiviert werden 10,11 , 13. Dies bietet die unverzichtbaren Visualisierung des Chromosoms Verfassung und die globale Bewertung des gesamten Genoms in mehreren Zellen. Es wird allgemein in klinischen und Forschungslabors weltweit für die Diagnose, Prognose und Bewertung der therapeutischen Krebszellen 10. Pränatale und verwendet postnatale Gewebeproben werden routinemäßig zur Identifizierung von numerischen und strukturellen Anomalien, genetische Erkrankungen wie z. B. Down-Syndrom verursachen ausgewertet. Stammzellen können schnell auf das Vorhandensein von Chromosom Instabilität ausgewertet werden. Jedoch ist die Auflösung von G-Bändelung für die Identifizierung von begrenzt Mikrodeletionen oder komplexe Chromosomenanomalien wie in metas gesehentatic Malignomen. Deshalb, wenn Routine-Chromosom G-Banding ist mit Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) ergänzt, die Erkennungsrate von Chromosomenanomalien 23 drastisch erhöht. Aus diesem Grund ist die Verwendung des vorliegenden Protokolls in Kombination mit diesen anderen molekularen zytogenetischen Verfahren wird zunehmend von verschiedenen Laboratorien für die Auswertung von Chromosomen Instabilität sowohl in der klinischen Forschung und die Einstellung von 13 bis 15 verwendet.

Chromosomenanalyse ist eine herkömmliche Technik genutzt, um den Chromosom Instabilität und Umlagerungen, die zu genetischen Störungen und Bösartigkeit 1,2,8,9 diagnostizieren. Darüber hinaus kann eine höhere Auflösung für die Diagnose und Erforschung von Krebs-und Verfassungs erworbene genetische Anomalien mit der Kombination der klassischen zytogenetischen Verfahren und molekulare zytogenetischen Methoden wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH) erreicht werden und spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15. In jüngerer Zeit haben diese Techniken für die Beurteilung von Chromosom Instabilität mit Stammzellen assoziiert genutzt. Karyotypischen Anomalien wie Aneuploidie von Langzeit kultivierten embryonalen Stammzellen (ES) und adulten Stammzellen aus verschiedenen Organismen wurden von mehreren Laboratorien gemeldet. Neuere Erkenntnisse unterstützt, dass einige Zelllinien sind von Natur aus eher auf Chromosom instabiNG unabhängig von den Kulturbedingungen. Aus diesem Grund wird bei der Festlegung und / oder Aufrechterhaltung von Mensch, Maus oder Rhesus Stammzelllinien, die Chromosomenanalyse wird als Teil der Qualitätskontrolle empfohlen. Viele Berichte beschreiben die zunehmendes Interesse an der Verwendung von Routine-und molekularen Zytogenetik, um die chromosomale Stabilität von Stammzellen und malignen Zellen oder verschiedenen Organismen in der Kultur 10-13 überwachen. Diese Protokolle werden zunehmend von nicht-genetischen Labors für die schnelle Chromosomen Bewertung ihrer kultivierten Zellen 13 verwendet. Wir stellen unsere grundlegende Verfahren zur Herstellung von Chromosom verschiedenen Zelltypen, die sowohl für klinische und Forschungszwecke und Zellen von verschiedenen Organismen stammen angewendet werden können.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tablets &quot;GURR&quot;</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosome preparation from cultured cells

Chromosom (zytogenetische Analyse) wird weithin für den Nachweis von Chromosomen-Instabilität verwendet. Wenn durch G-Banding und molekularen Techniken wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), gefolgt, hat dieser Test die leistungsfähige Möglichkeit, einzelne Zellen zu Aberrationen, die Gewinne oder Verluste von Abschnitten des Genoms und Umlagerungen, die ein oder mehrere Chromosomen betreffen analysieren. Bei Menschen, in etwa 1 pro 160 Lebendgeburten 1,2, 60-80% aller Fehlgeburten treten Chromosomenanomalien 3,4, 10% der Totgeburten 2,5, 13% der Personen mit angeborenen Herzfehlern 6, 3-6% der Unfruchtbarkeit Fällen 2 und bei vielen Patienten mit Entwicklungsverzögerung und der Geburtsdefekte 7. Zytogenetische Analyse der Bösartigkeit wird routinemäßig von Forschern und Klinikern verwendet, wie Beobachtungen von klonalen Chromosomenanomalien haben gezeigt, dass sowohl diagnostische als auch prognostische Bedeutung haben 8,9.60; Chromosomentrennung ist von unschätzbarem Wert für die Gentherapie und Stammzellforschung von Organismen einschließlich nicht-menschlichen Primaten und Nagetiere 10-13. Chromosomen von Zellen von lebenden Geweben, einschließlich Blut-Lymphozyten, Haut-Fibroblasten, Amniozyten, Plazenta, Knochenmark und Tumorproben isoliert werden. Chromosomen werden in der Metaphase-Stadiums der Zellteilung analysiert, wenn sie am meisten verdichtet werden und damit deutlich sichtbar. Der erste Schritt des Chromosoms Isolationstechnik beinhaltet die Unterbrechung der Spindelfasern durch Inkubation mit Colcemid, um die Zellen ausgehend von der nachfolgenden Stufe Anaphase verhindern. Anschließend werden die Zellen mit einer hypotonischen Lösung behandelt und in ihrem gequollenen Zustand mit Carnoy-Fixiermittel erhalten. Die Zellen werden dann auf Objektträger fallengelassen, und können dann für eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden. G-Banding beinhaltet Trypsin-Behandlung gefolgt von einer Färbung mit Giemsa zu charakteristischen hellen und dunklen Streifen zu schaffen. Das gleiche procedure Chromosomen isolieren können zur Herstellung von Zellen für die Verfahren, wie Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), vergleichende genomische Hybridisierung (CGH), und die spektrale Karyotypisierung (SKY) 14,15 verwendet werden.

Hochwertige Metaphasespreitungen sind für die Chromosomenanalyse. Ein erfolgreicher Test ergibt Chromosomen, die gut verteilt sind und von geeigneten Chromosomenmorphologie. Richtig G-gebänderten Chromosomen enthalten den charakteristischen hellen und dunklen Bandenmuster. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Abbildung 1. Eine erfolgreiche chromosomalen Ausbreitung in der die Chromosomen mit einer durchschnittlichen Länge, gut verteilen und leicht erkennbar voneinander und ausreichend Kontrast zwischen hellen und dunklen Streifen. Gute Chromosom Morphologie ermöglicht die Identifizierung der einzelnen Chromosomen und Bewertung für alle Umlagerungen Richt von Chromosom Instabilität.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Preparation From Cultured Cells at JoVE.com

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

81.1K Aufrufe.  Louisiana State University Health Science Center.  Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden. 

Serie: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines<em&gt; In Vitro</em&gt; System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Forschung

Genetik

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

Gründung der proliferativen Tetraploid Zellen aus nicht-transformierten menschlichen Fibroblasten

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Entwicklungsbiologie

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

Erfassung der Chromosomenkonformation über Längenskalen hinweg

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

Schnelle Analyse von Chromosomenaberrationen in Maus-B-Lymphozyten durch PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

Immunologie und Infektion

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Biologie

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Ein zellfreien Assay zu Chromatindekondensation Studieren am Ende der Mitose

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Eine schnelle Klima trockenen Dropping Chromosom Herstellungsverfahren Geeignet für FISH in Pflanzen

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Die Analyse der Feinstaub in der Luft-induzierte Chromosomenaberrationen Mit Hilfe eines