Diese Arbeit wurde vom Nationalfonds für aufstrebenden jungen Gelehrten (81625002), National Natural Science Foundation of China (81470389, 81270282, 81601238), Programm von Shanghai Academic Research Leader (18XD1402400), Shanghai Municipal unterstützt. Bildung Kommission Gaofeng klinische Medizin Zuschüsse (20152209), Shanghai Shenkang Krankenhaus Development Center (16CR3034A), Shanghai Jiao Tong University (YG2013MS42), Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (15ZH1003 und 14XJ10019), Shanghai-Segel-Programm (18YF1413000) und postgraduale Innovationsprogramm des Bengbu Medical College (Byycx1722). Wir danken Dr. Erhe Gao für seine früheren Hilfe in unserem Labor.

Alle Tierversuche wurden nach den nationalen Institute der Gesundheitsrichtlinien auf die Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden durch des Instituts-Tier-Ethik-Kommission genehmigt. Für die Experimente wurden männliche C57BL/6J Mäuse (im Alter von 8 bis 10 Wochen) verwendet. Untergebracht waren die Mäuse Pathogen-freies Bedingungen bei 24 ° C ± 4 ° C, unter einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus, mit freiem Zugang zu Wasser und Nahrung.
1. Vorbereitung des Adenovirus-Lösung
<ol><li>Bewahren Sie bei der Ankunft der gereinigten Adenovirus-Lösung die Lösung in einem-80 ° C Gefrierschrank auf. Hinweis: Die Adenovirus-Injektion erfolgte in lebensfähige Mäuse. Um die Sterilität der Adenovirus-Vektor zu gewährleisten, das Adenovirus (Codierung Luciferase, VDR oder ShRNA targeting VDR) wurden aufbereitet und gereinigt kommerziell9,10.</li>
	<li>Am Tag der Operation nehmen Sie die gereinigten Adenovirus-Lösung (3 x 1010 Plaque bildenden Einheiten [Pfu] /mL) aus dem-80 ° C Gefrierschrank, und tauen Sie Adenovirus-Vektor-Lösung auf dem Eis auf.</li>
	<li>Eine Gesichtsmaske, sterile Handschuhe und sterile Kleid anziehen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 50-µL Hamilton-Spritze, die am Tag vor der Operation sterilisiert worden. Hinweis: Für die Sterilisation, die Hamilton-Spritze wurde in Gaze eingewickelt und in ein hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator. Der Modus "Sterilisation für die solide" wurde ausgewählt und Sterilisation wurde begonnen, durch Drücken der Taste "Start".</li>
	<li>Nach dem vollständigen Auftauen der gereinigten Adenovirus-Lösung, Sprühen Sie die Röhrchen mit Adenoviren Lösung mit 75 % Ethanol, und verschieben Sie die Adenovirus-Lösung in einer Laminar-Flow sterile Kapuze.</li>
	<li>Aspirieren Sie in einer Laminar-Flow sterile Kapuze 50 µL Adenovirus-Lösung mit der Hamilton Spritze ohne Nadel, gefolgt durch Anbringung einer 30 G-Nadel an der Hamilton-Spritze.</li>
	<li>Halten Sie die Spritze mit der 30 G-Nadel nach oben, und schieben Sie den Kolben der Spritze, bis die Nadel mit Adenoviren Lösung (bestätigt durch das Auftreten der ersten Lösung Tropfen von der Spitze der Nadel) gefüllt ist. Hinweis: Es dauert ungefähr 45 µL Lösung um die 30 G-Nadel, füllen so jetzt fast keine Lösung in die Spritze sichtbar ist.</li>
	<li>Verwenden Sie die oben genannten vorbereitete Spritze, um eine weitere 30 µL Adenovirus Lösung sorgfältig abzusaugen, und die lose verschlossene Spritze auf Eis für eine spätere Verwendung.</li>
</ol>(2) Anästhesie und Operative Vorbereitung
<ol><li>Fügen Sie 20 mL Isofluran in einem Verdampfer Isoflurane, und schließen Sie den Verdampfer Isoflurane an ein Sauerstoffgerät.</li>
	<li>Öffnen Sie das Ventil und lassen Sie den Sauerstoff Flow aus der Sauerstofftank zum Verdampfer Isoflurane. Pflegen Sie die Sauerstoff-Durchflussmenge bei 2 L/min über ein Sauerstoff-Strömungswächter im Verdampfer Isoflurane.</li>
	<li>Induzieren Sie Anästhesie der Maus mit 4 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (2 L/min) für 2 min in einem Kunststoffkäfig verbunden zum Verdampfer Isoflurane.</li>
	<li>Herausnehmen der narkotisierten Maus aus dem Kunststoff-Käfig, sichern Sie sie auf einer Kunststoff-Plattform in Bauchlage in einem Laminar-Flow sterile Haube und Anästhesie mit 2 % Isofluran in 100 % Sauerstoff (2 L/min) über eine Nase Kegel zu erhalten.</li>
	<li>Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch das Fehlen der Zehe Prise Antwort.</li>
	<li>Eincremen Sie sterile ophthalmologischen für jedes Auge, die Hornhaut vor dem Austrocknen zu schützen.</li>
	<li>Rasieren der Brust und Oberbauch. Handelsübliche Enthaarungscreme auf die rasierte Website beantragen, 1 min. entfernen die Enthaarungscreme und verbleibende Fell mit nassen Gazen.</li>
	<li>Sterilisieren der Operationsstelle (linken unteren Teil der Brust) mit 3 Peelings von Jod-Chlorhexidin basierte antiseptisch (z.B. Entoiodine). Der Operationsstelle mit einem sterilen Tuch abdecken.</li>
</ol>3. Intramyocardial Injektion von Adenovirus in Maus-Herz
<ol><li>Die Handschuhe ausziehen und ein neues Paar sterile Handschuhe anziehen.</li>
	<li>Chirurgische Schere, Pinzette, ein Micro-Mosquito Gefäßklemme zu sterilisieren und Nadelhalter am Vortag Betrieb bei hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator (siehe Schritt 1.4 Hinweis).</li>
	<li>Machen Sie einen 0,5 cm Hautschnitt entlang der Verbindungslinie der Xiphoid und Achselhöhle. Unverblümt sezieren Sie die Brust große und kleine Brustmuskeln mit Zange und ein Micro-Mosquito Gefäßklemme.</li>
	<li>Setzen Sie die intercostalneuralgie Räume durch zurückziehen der Brust große und kleine Brustmuskeln. Durchbohren Sie und öffnen Sie den vierten intercostalneuralgie Raum (oder den breitesten intercostalneuralgie Raum durch Beobachtung) mit einem Micro-Mosquito Gefäßklemme.</li>
	<li>Drücken Sie das Herz in Richtung der Schnitt, das Herz mit dem Zeigefinger der nichtdominanten Hand zu externalisieren, durch leichtes Drücken an der rechten Seite der Brustwand.</li>
	<li>Externalisierte Herzen mit dem Zeigefinger und dem Daumen der nichtdominanten Hand sanft zu sichern.</li>
	<li>Injizieren Sie insgesamt 30 µL Adenovirus-Lösung in das Myokard des linken Ventrikels an drei Standorten (ventral, dorsal und seitliche Wand des linken Ventrikels) über den Hamilton-Spritze gefüllt mit Adenoviren (Abbildung 1) mit der dominanten Hand.</li>
	<li>Nach Abschluss der Injektion sofort platzieren Sie das Herz zurück in den Brustraum Raum.</li>
	<li>Manuell zu evakuieren der Luft im Brustraum durch leichtes Drücken der Brustwand auf der Haut-Schnitt-Website. Hinweis: Erfolgreiche Luft Evakuierung kann nachgewiesen werden, von der Brust große und kleine Brustmuskeln, verursacht durch die ausgestoßene Luft flattern.</li>
	<li>Schließen Sie die Haut durch horizontale Matratze Naht mit einer 5-0 Seide Naht. Hinweis: Die Brust große und kleine Brustmuskeln sollten nicht genäht werden weil sie nur unverblümt seziert sind und ihre anatomischen Strukturen intakt während der Operation sind.</li>
</ol>4. die Nachbehandlung
<ol><li>Verwalten Sie Buprenorphin (3 mg/kg) zweimal täglich über subkutane Injektion, postoperativen Schmerzen für die ersten 48 Stunden nach Betrieb11zu reduzieren.</li>
	<li>Nach Operation sofort behalten Sie die Mäuse auf ein Heizkissen (37 ° C) bis vollständig erholt. Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig, nachdem es vollständig erholt.</li>
	<li>Die benutzte Spritze Hamilton und 30 G Spritzennadel in einem hoher Temperatur/hoher Druck Sterilisator zu sterilisieren (siehe Schritt 1.4 Hinweis). Die sterilisierten 30 G Spritzennadel in einem Sharps Container zu sammeln.</li>
</ol>5. in-Vivo Bildgebung zur Messung der kardialen Luciferase Ausdruck
<ol><li>Am 5. Tag nach der Injektion Adenovirus bereiten Sie eine frische Stammlösung von Luciferin bei 15 mg/mL in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS). Filtern Sie die Lösung durch einen 0,2 µm-Filter.</li>
	<li>Intra peritoneally injizieren Sie die wach Mäuse mit dem Luciferin Lösung bei 150 mg/kg Körpergewicht.</li>
	<li>Schalten Sie die imaging-System.</li>
	<li>Nach automatischer Selbsttest der imaging-System, wählen Sie den bildgebenden Modus als "Leuchtende", und nehmen Sie folgende Einstellungen: Belichtung: Auto; Binning: 8; FStop: 1; Anregung: Block; Emission: offen.</li>
	<li>10 min nach der Injektion von Luciferin betäuben Sie die Mäuse durch Injektion Chloral Hydrate (300 mg/kg Körpergewicht). Bestätigen Sie ausreichende Anästhesie durch das Fehlen der Zehe Prise Antwort.</li>
	<li>Sichern Sie die narkotisierten Mäuse auf einer beheizten bildgebenden Bühne in Bauchlage, mit der Brust auf die Kamera gerichtet.</li>
	<li>Sammeln Sie Bilder (1 Bild für jede Maus) und quantifizieren Sie die Intensität der Signale durch Zeichnung identisch kreisförmige Messung Regionen von Interesse (ROI) um die Brust zu.</li>
	<li>Nach der Sammlung von Bildern Opfern Sie die Mäuse zu und sammeln Sie das Gewebe zu, wie im folgenden Abschnitt beschrieben.</li>
</ol>6. Ernte Gewebe
<ol><li>Pflegen Sie zu verschiedenen Zeitpunkten nach Virus Injektion (Abbildung 1 b) Anästhesie mit 2 % Isofluran über eine bugnase betäuben Sie die Mäuse mit 4 % Isofluran, und sichern Sie sie auf einer Kunststoff-Plattform in Bauchlage.</li>
	<li>Machen Sie einen Mittellinie ventralen Einschnitt in den vorderen Hals. Aussetzen der Rechts gemeinsamen Halsschlagader durch zurückziehen der Omohyoid und sternocleidomastoideus-Muskeln.</li>
	<li>Die Mäuse durch transecting direkt gemeinsame Halsschlagader und Entleeren das Blut zu opfern.</li>
	<li>Machen Sie einen ventralen Mittellinie-Schnitt in den Bauch. Schneiden Sie die Rippen auf beiden Seiten des Brustkorbs entlang der Midclavicular Linie und Transekt das Zwerchfell.</li>
	<li>Setzen Sie das Herz durch Anheben der Xiphoid. Finden Sie die Aorta ascendens zu und entfernen Sie vorsichtig das perivaskuläre Fettgewebe.</li>
	<li>Cannulate der Aorta und doppelthebel das Herz mit einer 30 G-Nadel befestigt eine 1 mL Spritze gefüllt mit 0,5 mL 4 ° C-Phosphat-Pufferlösung (PBS) durchspülen.</li>
	<li>Nach Perfusion Verbrauchsteuern Sie die Herzen, und teilen sie in der linken und rechten Ventrikel. Verbrauchsteuern Sie, Leber, Lunge und Milz.</li>
	<li>Nach zwei Wäschen in kaltem PBS (4 ° C) Lagern Sie die gesammelten Gewebe separat in kryogenen Fläschchen in flüssigem Stickstoff.</li>
</ol>7. Ermittlung der Proteinexpression
<ol><li>Bereiten Sie Homogenisierung Puffer durch Zugabe von Protease-Inhibitor-Cocktail in handelsüblichen Lyse Puffer in einem Verhältnis von 1: 100. Berechnen Sie das Gesamtvolumen, basierend auf der Anzahl der zu bearbeitenden Proben. Halten Sie den vorbereiteten Homogenisierung Puffer bei 4 ° C für eine spätere Verwendung.</li>
	<li>Nehmen Sie das Gewebe aus dem flüssigen Stickstoff-Tank. Wiegen Sie das Gewebe auf Präzisions-Waage (ca. 60 mg für jedes Stück des Gewebes).</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe auf einen neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Fügen Sie sofort 200 µL Homogenisierung Puffer und vorgekühlte 1,5 mm Stahlkugeln (4 ° C) in den Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Sichere Mikrozentrifugenröhrchen in vorgekühlte (4 ° C) Metall-Inhaber in eine automatische Gewebe Schleifmaschine und beginnen Homogenisierung durch Inbetriebnahme der Maschine mit den folgenden Einstellungen: Frequenz: 70 Hz; Zeit: 120 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie nach der Homogenisierung Homogenat (16.000 × g, 4 ° C), und übertragen Sie den überstand sorgfältig auf eine neue 1,5-mL-Tube mit einer 100 µL Pipette.</li>
	<li>Fügen Sie laden Puffer-Lösung (5 X), das Protein Überstand bei einem Verhältnis von 1:4 und das Protein bei 100 ° C für 5 min zu denaturieren.</li>
	<li>Die proteingehalte Ausdruck im Herzen und andere Organ Gewebe weiter durch Western-Blot Analyse (Vertreter, die Ergebnisse sind in Abbildung 2 und Abbildung 3gezeigt) überwacht gemäß dem Protokoll zuvor beschriebenen12.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yancy, C. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der vorliegende Bericht zeigt eine modifizierte Technik für die Intramyocardial Injektion von viralen Vektoren für kardiale Genmanipulation, die von einer Methode für die myokardiale Infarktbildung Induktion von Gao Et Al. geändert wurde 13 derzeit in Vivo Charakterisierung von spezifischen Genfunktionen in den meisten Fällen beinhalten die Erzeugung von Knockout oder Transgene Mäuse3,14,15,16,17 , die ist teuer, zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Lieferung von Gen-Vektoren oder SiRNA durch systemische oder lokale Injektion ist alternativ auch weithin für Genmanipulation im Herz-Kreislauf-Forschung4,5,7geübt. Insbesondere kann nicht Intramyocardial Injektion für kardiale Genmanipulation unter bestimmten Umständen ersetzt werden: Wann Website richtet Injektion erforderlich (z. B.Grenze Zone Injektion in der Herzinfarkt-Modell)11; Wann ist Dauer beschränkt Genmanipulation erforderlich (z.B.Adenoviren Injektion). Hier haben wir gezeigt, dass die modifizierte Intramyocardial Injektion Methode einfach, zeitsparend und höchst effizient.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls und zur Fehlerbehebung:
Für den erfolgreichen Betrieb dieses Protokolls mehrere kritische Schritte hinzuweisen. Bevor Absaugnadeln Virus, die Luft innerhalb der Hamilton-Spritze und die beigefügten Nadel evakuiert werden muss, kann sonst die Luft in den Herzmuskel injiziert aktuell kardiale Verletzung oder sogar Tod verursachen. Um dieses Problem zu vermeiden sollte die Ready-to-Use Hamilton Spritze gefüllt mit einem angemessenen Virus nicht mit dem Kolben nach unten platziert werden, weil dies spontan Luft durch die Schwerkraft der metallischen Kolben Aspirieren kann. Anästhesie sollten sorgfältig überwacht werden, wie tief Anästhesie postoperative Genesung verzögern kann und schwer tief Anästhesie kann zum Tod führen. Nach ausreichende Anästhesie sollte das Herz nicht externalisiert werden aus der Brusthöhle mit Gewalt, da dies zu schweren Lungenversagen führen kann. In der Tat, richtige Herz Externalisierung erfordert nur einen sanften Druck des Herzens, und jeden Widerstand kann darauf hindeuten, in die falsche Richtung drängen.
Grenzen der Technik:
Die Beseitigung der Intubation in dieser Technik, die für das Verfahren benötigte Zeit verringert, legt nahe, dass die Injektion von Intramyocardial innerhalb eines relativ begrenzten Zeitfensters, Tod zu vermeiden abgeschlossen sein sollte. Unserer Erfahrung nach sollte das Herz nicht für mehr als 30 externalisiert werden s, denn dies die Sterberate erhöht und verzögert die postoperative Heilung. Daher empfiehlt sich die Verwendung von Intubation für die ersten Versuche von dem hier beschriebenen Protokoll. Eine weitere Einschränkung ist die ungleiche Verteilung von viralen Vektoren geliefert durch diese Methode, die auch in gängigen Intramyocardial Injektion7vorhanden ist. Die hier beschriebene Methode eignet sich darüber hinaus für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation in unverletzten Herzen, die durch die Einrichtung von verschiedenen Herzerkrankungen Modelle18,19,20verfolgt werden können, 21,22,23. Die Verwendung der aktuellen Methode bei der Bereitstellung von Agenten, verletzten Herzen wie infarzierte Herzen kann jedoch eingeschränkt werden, weil diese Mäuse das Verfahren nicht tolerieren können.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:
Konventionelle Intramyocardial Injektion erfordert Intubation und Beatmung24und erschwert es, die Einstichstelle durch die schnelle Maus Herzschlag zu finden. Diese Probleme verlängern deutlich die Betrieb Zeit13, wodurch sich Abweichungen, die durch die zeitliche Verzögerung. Die modifizierte Technik hier vorgestellten ist schnell und ermöglicht präzise Injektion Standort durch die Sicherung manuell externalisierte Herzen; alles in allem deutlich potenzierende nachfolgende Studie. Darüber hinaus die Beseitigung der Intubation und mechanische Ventilation die modifizierte Methode zugänglich zu machen fast jedes Labor.

Herzerkrankung ist die häufigste Ursache von Morbidität und Mortalität weltweit1,2. Der Mangel an effektiven Therapiestrategien für lebensbedrohlichen Herzerkrankungen wie Herzinfarkt und Herzinsuffizienz zieht intensive Auseinandersetzung des zugrunde liegenden Pathomechanismen und Identifikation von neuartigen therapeutischen Optionen3. Für diese wissenschaftliche Erkundungen ist Herz-Kreislauf-spezifischen Genmanipulation weit verbreiteten4,5. Kardiale Genmanipulation von Genom-Bearbeitung mit Hilfe der leistungsfähigen Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nuklease (TALEN) erreicht werden und regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) gruppierten / CRISPR assoziierten Protein 9 (Cas9) Werkzeuge, oder durch Lieferung von ektopische genetischen Materials (z.B. Virus Vektoren mit Genen Codierung interessierender Proteine)6. Wenn Genom-Bearbeitung präziser und raumzeitlichen Genom Änderungen in lebenden Mäusen ermöglicht, ist es immer noch eine zeitraubende und arbeitsintensive Praxis6. Alternativ, Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation durch Virus Vektor oder kleine störende RNA (SiRNA) komplexe Lieferung werden routinemäßig durchgeführt6.
Virus Vektor Lieferung an die Erwachsenen Maus Herz wird erreicht, indem etwa zwei Strategien: systemische oder lokale Injektion. Systemische Injektion Cardiotropic Serotyp des Flugabwehrpanzer wie AAV9 ist nicht-invasive kardiale spezifisches gen-Manipulation-7. Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effiziente Signaltransduktion und Genexpression notwendig, und kann zu erheblichen Transduktion von Energiesubventionen Organen wie Muskeln und Leber7führen. Lokalen Virus Injektion wird durch Intramyocardial Injektion oder intracoronary Lieferung7erreicht. Intracoronary Lieferung führt zu einer gleichmäßigeren Verteilung des Virus innerhalb des Herzens im Vergleich zu Intramyocardial Injektion. Die Nachteile dieser Technik sind jedoch die schnelle Auswaschen von viralen Vektoren auf die systemische Zirkulation und Transduktion in Energiesubventionen Organe8und die Anforderung von Geräten für die Druckmessung während der Operation. Im Gegensatz dazu Vektor Intramyocardial Injektion ermöglicht bessere Virus Retention in den Herzmuskel sowie ortsspezifische Lieferung, aber es versäumt, virale verteilen-7. Für Kleintiere ist intracoronary Lieferung technisch schwierig, ausführen, während systemische AAV9 Injektion und Intramyocardial Injektion häufiger praktizierte4,5,7 sind. Obwohl systemische Injektion leicht durchzuführen ist, herkömmliche Intramyocardial Injektion erfordert mechanische Lüftung und Thorakotomie verursacht umfangreiche Gewebeschäden und ist zeitaufwendig.
In diesem Bericht beschrieben, eine einfache, zeitsparende und hocheffiziente Methode für die Intramyocardial Injektion. Adenovirus Codierung Luciferase und VDR oder ShRNA targeting VDR, injiziert wurde, um kardialen Genexpression zu manipulieren. Einmal gemeistert, kann diese Methode für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien im Herzen Maus verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow sterile hood</td><td>Fengshi Animal Experimental&amp;nbsp; Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China)</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>Tissue grinding machine</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>High temperature/high pressure sterilizer</td><td>Hirayama (Saitama, Japan)</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer&amp;nbsp;</td><td>Matrix (Orchard Park, USA)</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III imaging system</td><td>PerkinElmer (Waltham, USA)</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>Precision&amp;nbsp;balance</td><td>Sartorius (G&amp;ouml;ttingen, Germany)</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipette (10 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf (Westbury, USA)</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>Curved tip</td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton (Nevada, USA)</td><td>80501</td><td>Volume 50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Micro-mosquito hemostat</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>13011-12</td><td>Curved, tip width 1.3mm</td></tr><tr><td>Needle holder&amp;nbsp;</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>F.S.T (Foster City, USA)</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL Syringe</td><td>WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luciferase antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG</td><td>CST (Danvers,&amp;nbsp; USA)</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VDR antibody</td><td>Abcam (Cambridge, UK)</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>Chloralic hydras</td><td>LingFeng Chemical (ShangHai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang (Shanghai, China)</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP tube</td><td>Sarstedt (Newton, USA)</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore (Bedford, USA)</td><td></td><td>Pore size 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Promega (Madison, USA)</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer for western&amp;nbsp; blot</td><td>Beyotime (Shanghai, China)</td><td>P0013J</td><td>Without inhibitors</td></tr><tr><td>Ophthalmic cream</td><td>Apex Laboratories ( Melbourne, Australia))</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco (Grand Island,&amp;nbsp; USA)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific (Waltham, USA)</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 silk suture</td><td>Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steel ball</td><td>Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China)</td><td></td><td>Width 1.5 mm</td></tr><tr><td>Syringe needle</td><td>Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China)</td><td></td><td>30 gauge&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Warm mat</td><td>Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China )</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice

Genmanipulation speziell im Herzen deutlich potenzieren die Untersuchung von Herzerkrankungen Pathomechanismen und ihr Therapeutisches Potenzial. In Vivo Herz-spezifischen gen-Lieferung wird häufig durch systemische oder lokale Lieferung erreicht. Systemische Injektion über Heck Vene ist einfach und effizient bei der Manipulation von kardialen Genexpression mittels rekombinantes Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9). Jedoch diese Methode erfordert einen relativ hohen Anteil an Vektor für effizienten Transduktion und Energiesubventionen Orgel gen Transduktion führen kann. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode des Intramyocardial Injektion für in Vivo Herz-spezifischen gen-Manipulation bei Mäusen. Unter Anästhesie (ohne Lüftung) Dur und Moll Brustmuskeln waren unverblümt seziert und Maus Herzen wurde schnell durch manuelle Externalisierung durch einen kleinen Schnitt an der vierten intercostalneuralgie Raum ausgesetzt. Anschließend wurde Adenovirus Codierung Luciferase (Luc) und Vitamin-D-Rezeptor (VDR) oder kurze Hairpin RNA (ShRNA) gezielt VDR, mit einer Spritze Hamilton in der Herzmuskel injiziert. Nachfolgende in-Vivo Bildgebung gezeigt, dass Luciferase erfolgreich überexprimieren, speziell im Herzen war. Western-Blot Analyse im übrigen bestätigt die erfolgreiche Überexpression oder Schweigen der VDR im Herzen Maus. Einmal gemeistert, kann diese Technik für Genmanipulation sowie Injektion von Zellen oder anderen Materialien wie Nanogels im Herzen Maus verwendet werden.

Das Experiment-Protokoll und einige der wichtigsten Schritte für die gemeldeten Methode sind in Abbildung 1dargestellt. 5 Tage nach Intramyocardial Injektion von Adenovirus Codierung Luciferase (Adv-Luc), angegeben in Vivo imaging im Adv-Luc injiziert Mäuse robuste Überexpression des Luciferase speziell im Herzen (Abbildung 2A, B), das war durch Western-Blot Analyse (Abbildung 2), was darauf hindeutet das Fehlen von Energiesubventionen Orgel Transduktion bestätigt. Im Gegensatz dazu wurde keine Luciferase-Ausdruck in Kontroll-Mäusen nachgewiesen. In Übereinstimmung mit der erfolgreichen Überexpression der Luciferase, Western-blot Analyse vorgeschlagenen deutlich erhöhte VDR Ausdruck in der linken Herzkammer von Mäusen injiziert mit Adenovirus Codierung VDR (Adv-VDR) (Abb. 3A). Darüber hinaus reduziert Adv-ShVDR Injektion deutlich VDR Ausdruck in der linken Herzkammer (Abb. 3 b). Im Gegensatz dazu war VDR Ausdruck nicht wesentlich im rechten Ventrikel weder im Adv-VDR injiziert Mäuse oder Adv-ShVDR injiziert Mäuse (Abbildung 3, D), verändert, weil das Adenovirus nur in der linken Herzkammer Myokard injiziert wurde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig1.jpg"> Abbildung 1 . Schema für Maus Intramyocardial Injektion und Gen Ausdruck Erkennung Protokoll. (A) Abbildung zeigt drei Injektionsstellen im Myokard des linken Ventrikels. (B) Protokoll für Gen-Ausdruck-Erkennung in Maus Herz nach Injektion von angegebenen Viren. ADV-Luciferase: Adenovirus Luciferase-Codierung; AdVDR: Adenovirus Codierung VDR; AdshVDR, Adenoviren Codierung ShRNA VDR-targeting. (C) repräsentative Bilder zeigen mehrere Schritte der modifizierten Methode für die Maus Intramyocardial Injektion. a. Entfernung des Fells von im Handel erhältlichen Enthaarungscreme. b. Sterilisation von der Operationsstelle mit 3 Peelings von Povidon-Jod. c. die Operationsstelle mit einem sterilen Tuch abdecken. d. 0,5 cm Hautschnitt entlang der Verbindungslinie zwischen Xiphoid und Achselhöhle. e. stumpfe Dissektion der Brust große und kleine Brustmuskeln mit Zange und ein Micro-Mosquito Gefäßklemme. f. Externalisierung des Herzens. g. Injektion von 30 µL Adenovirus-Lösung in das Myokard des linken Ventrikels über den Hamilton-Spritze. h - i. Schließung der Haut durch eine Geldbörse-String mit einer 5-0 Seide Naht vernähen. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig2.jpg"> Abbildung 2 . Erkennung von Luciferase Ausdruck im Herzen. (A) Bilder von der imaging-System zeigt das leuchtende Signal des Herzens bei Kontroll-Mäusen und Mäusen injiziert mit Adenoviren Codierung Luciferase auf 5 Tage nach der Injektion gesammelt. (B) leuchtende Signalintensitäten in verschiedenen Gruppen (n = 3) werden statistische Analyse von t -Test unterzogen. p < 0,01 im Vergleich zu Kontroll-Mäusen. (C) Western-Blot Analyse Ergebnissen zeigt Luciferase proteingehalte in Herz, Lunge, Leber und Milz in angegebenen Gruppen 5 Tage nach der Injektion Adenovirus (n = 3). Seit Luciferase Ausdruck nur im Herzen der Adv-Luc injiziert Mäuse erkannt wurde, wurde statistische Analyse nicht durchgeführt. ADV-Luc: Adenovirus Luciferase-Codierung. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57074/57074fig3.jpg"> Abbildung 3 . Erkennung von VDR Ausdruck im Herzen. (A) Oberseite: Western-Blot bands zeigen VDR Ebenen in der linken Herzkammer (wo das Adenovirus wird gespritzt) bei 0, 5 Tage, 7 Tage und 14 Tage nach der Injektion der Adv-VDR. Bodenplatte: semi-quantitative Analyse des VDR Ausdruck in verschiedenen Gruppen (n = 4 pro Zeitpunkt). Ergebnisse wurden gegen GAPDH normalisiert und Wandel im Verhältnis zur 0day Falten umgerüstet. One-Way Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von der Bonferroni-Posttest (Gleichheit der Varianzen angenommen) oder Tamhane Posttest (Gleichheit der Varianzen nicht angenommen) wurde für statistische Analysen durchgeführt. p < 0,05 oder **p < 0,01 versus 0day. (B) Oberseite: Western-Blot bands zeigen VDR Ebenen in der linken Herzkammer auf 0 Tage, 3 Tage, 5 Tage und 7 Tage nach der Injektion der Adv-ShVDR. Bodenplatte: semi-quantitative Analyse des VDR Ausdruck in verschiedenen Gruppen (n = 4 pro Zeitpunkt). p < 0,05 versus 0day. (C) Oberseite: Western-Blot bands zeigen VDR Ebenen in der rechten Herzkammer (wo das Adenovirus nicht gespritzt) bei 0, 5 Tage, 7 Tage und 14 Tage nach der Injektion der Adv-VDR. Bodenplatte: semi-quantitative Analyse des VDR Ausdruck in verschiedenen Gruppen (n = 4 pro Zeitpunkt). (D) Oberseite: Western-Blot bands zeigen VDR Ebenen in der rechten Herzkammer auf 0 Tage, 3 Tage, 5 Tage und 7 Tage nach der Injektion der Adv-ShVDR. Bodenplatte: semi-quantitative Analyse des VDR Ausdruck in verschiedenen Gruppen (n = 4 pro Zeitpunkt). <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57074/57074fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

15.8K Aufrufe.  The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College. Hier präsentieren wir ein Protokoll für Herz-Kreislauf-spezifische Genmanipulation bei Mäusen. Unter Narkose waren die Mäuseherzen durch den vierten intercostalneuralgie Raum ausgelagert. Anschließend, blot Adenoviren, die Codierung bestimmter Gene mit einer Spritze das Myokard injiziert wurden, gefolgt von Protein Ausdruck Messung via in-Vivo Bildgebung und Western Analyse.

Serie: A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Forschung

Medizin

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genetik

Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Entwicklungsbiologie

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. Experiments involving myocardial injection are currently performed by direct surgical access through a thoracotomy. While convenient when performed at the time of another experimental manipulation such as coronary artery ligation, the need for an invasive procedure for intramyocardial delivery limits potential experimental designs. With ever improving ultrasound resolution and advanced noninvasive imaging modalities, it is now feasible to routinely perform ultrasound-guided, percutaneous intramyocardial injection. This modality efficiently and reliably delivers agents to a targeted region of myocardium. Advantages of this technique include the avoidance of surgical morbidity, the facility to target regions of myocardium selectively under ultrasound guidance, and the opportunity to deliver injectate to the myocardium at multiple, predetermined time intervals. With practiced technique, complications from intramyocardial injection are rare, and mice quickly return to normal activity on recovery from anesthetic. Following the steps outlined in this protocol, the operator with basic echocardiography experience can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Echocardiography-guided percutaneous intramyocardial injection represents an efficient, reliable, and targetable modality for the delivery of gene transfer agents or cells into the murine heart. Following the steps outlined in this protocol, the operator can quickly become competent in this versatile, minimally invasive technique.

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Elektroporationsbasierte Transgenese von Herzzellen in Mausherzen

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autor im Rampenlicht: Transgenese von Herzzellen für schnelles Gen-Screening

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection fraction (HFrEF). Before they can be considered for use, and implemented in humans, extensive preclinical studies are required in large animal models to evaluate the safety, efficacy, and fate of the injectate (e.g., stem cells) once delivered into the myocardium. Small rodent models offer advantages (e.g., cost effectiveness, amenability for genetic manipulation); however, given inherent limitations of these models, the findings in these rarely translate into the clinic. Conversely, large animal models such as rabbits, have advantages (e.g., similar cardiac electrophysiology compared to humans and other large animals), whilst retaining a good cost-effective balance. Here, we demonstrate how to perform a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection (IMI) technique, which is minimally invasive, safe, well tolerated, and very effective in the targeted delivery of injectates, including cells, into several locations within the myocardium of a rabbit model. For the implementation of this technique, we also have taken advantage of a widely available clinical echocardiography system. After putting in practice the protocol described here, a researcher with basic ultrasound knowledge will become competent in the performance of this versatile and minimally invasive technique for routine use in experiments, aimed at hypothesis testing of the capabilities of cardiac regenerative therapeutics in the rabbit model. Once competency is achieved, the whole procedure can be performed within 25 min after anaesthetizing the rabbit.

Novel therapeutic strategies in cardiac regenerative medicine require extensive and detailed studies in large preclinical animal models before they can be considered for use in humans. Here, we demonstrate a percutaneous contrast echocardiography-guided intramyocardial injection technique in rabbits, which is valuable for hypothesis testing the efficacy of such novel therapies.

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Eine einfache und effiziente Methode zur In Vivo Cardiac-spezifische Genmanipulation durch Injektion von Intramyocardial bei Mäusen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Lieferung von Modified mRNA in einem Myokardinfarkt-Mausmodell

Intramyokardiale Zell Lieferung: Beobachtungen im Herzen Murine

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Perkutane Kontrast-Echokardiographie-geführte Intramyocardial-Injektion und Zelle-Lieferung in einem großen präklinischen Modell

Adeno-assoziierten Virus-vermittelte Lieferung von CRISPR für kardiale gen Bearbeitung bei Mäusen