Wir danken Herrn P. Yeung für die Vorbereitung der MCF-7 für uns. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Forschungsstipendienrats der Sonderverwaltungsregion Hongkong, China (Projekt Nr. 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 und HKU 720112E), dem Programm für Innovation und Technologie (ITS / 090/14 ) Und dem Universitätsentwicklungsfonds der HKU.

1. Probenvorbereitung <ol><li> Probenvorbereitung (adhärente Zellen, MCF-7-Zellen) <ol><li> Nehmen Sie die Zellkulturschale aus dem Inkubator heraus und entleeren Sie das Kulturmedium. </li><li> Spülen Sie die Zellen auf einer Schale mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um überschüssiges Kulturmedium zu entfernen. </li><li> Füge 3 ml einer Lösung von 0,25% Trypsin zur Kulturschale (Durchmesser von 100 mm) hinzu und lege sie in einen 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator für 4 min. HINWEIS: Das Trypsin löst das adhäsive Protein der Zellen auf, so dass sie sich von der Kulturschale lösen. </li><li> Überprüfen Sie, ob sich alle Zellen mit einem Lichtmikroskop (10X-Objektiv) von der Kulturschale gelöst haben. Wenn nicht, schütteln Sie die Zellkulturschale vorsichtig. </li><li> Fügen Sie 4 ml des Standardkulturmediums hinzu (formuliert mit 89% Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (PS)), um die Wirkung des Trypsins zu stoppen. </li><li> TRunden die gesamte Mischung (Zellen in Trypsinlösung und Kulturmedium) zu einem Zentrifugenröhrchen ab und zentrifugieren für 5 min bei 200 x g. </li><li> Entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und setzen Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS (pH-Wert: 7,4, vorgewärmt auf 37 ° C) wieder auf. </li></ol></li><li> Probenvorbereitung (kultivierte Mikroalgen) <ol><li> Übertragen Sie die kultivierten Mikroalgen und das Kulturmedium ( zB Meerwasser, Agar oder Süßwasser) auf neue Glaskulturröhrchen (~ 15 ml) in einem Volumenverhältnis (Mikroalgen zu Kulturmedium) von 1: 5 Ein neues Subkulturmedium. </li><li> Legen Sie die Glaskulturrohre in eine staubdichte Kammer unter ständiger Beleuchtung durch künstliche Beleuchtung von Leuchtstofflampen nach einem Licht / Dunkel (LD) Zyklus (meist LD 16: 8) für 72 - 120 h vor dem Experiment. </li><li> Die subkultivierten Proben in ein Zentrifugenröhrchen überführen und gut vermischen. </li></ol></li></ol> 2. ATOM System Setup Abbildung 1: Schema eines ATOM-Systems. Ein breitbandiger gepulster Laser wird verwendet, um ultraschnelle Impulse an ( a ) ein Zeitstreckmodul und ( b ) ein optisches Inline-Verstärkermodul zu liefern. Das Zeitstreckmodul erzeugt eine Folge von zeitlichen Wellenformen, von denen jede die Replik des Wellenlängenspektrums der Laserquelle ist ( dh eine Wellenlängen-zu-Zeit-Abbildung). Das Verstärkermodul dient zur Pulsstreckung (dispersive) Verlustkompensation. Der gestreckte Puls wird dann ( c ) räumlich durch ein Beugungsgitter dispergiert, wobei eine 1D-Spektralduschenbeleuchtung gebildet wird, bei der einzelne Wellenlängenkomponenten durch ein Relaislinsenpaar weitergeleitet und durch die Objektivlinse auf unterschiedliche Positionen auf der fließenden Zelle innerhalb des ( d ) Mikrofluidischen Chip. Dies ist der Prozess der spektralen Kodierung. DasSpektral codiertes Licht wird die Zelle wieder durch eine andere Objektivlinse und einen Spiegel passieren, kehrt zum Beugungsgitter zurück und rekombiniert als räumlich undispergierter Pulsstrahl. Dieser bildkodierte gepulste Strahl ist dann ( E ) in zwei Pfade aufgeteilt sind, so dass beide Strahlen teilweise mit ( f ) der Messerkante, aber aus entgegengesetzten Richtungen blockiert werden, bevor sie in die Fasern eingekoppelt werden. Diese beiden Strahlen repräsentieren die beiden (entgegengesetzten) codierten Phasen-Gradienten-Kontraste des endgültigen Bildes. Für die gleichzeitige Erfassung beider Signalkontraste erfährt eines der Signale ( g ) eine Zeitverzögerungsleitung, so dass die beiden Signale zeitlich gemultiplext (verschachtelt) werden. Für die Datenerfassung werden ein Hochgeschwindigkeits-Photodetektor und ein Echtzeit-Oszilloskop verwendet. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55840/55840fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Zeit st<html> Retch-Modul <ol><li> Verwenden Sie eine breitbandige Femtosekunden- (psose-) oder pikosekunden- (ps) gepulste Laserquelle mit einer empfohlenen Mittenwellenlänge im nahen Infrarotbereich (NIR), 800-1500 nm. HINWEIS: Die typische erforderliche Pulsbreite kann von Sub-100 fs bis zu einigen ps reichen. Detaillierte Anforderungen der gepulsten Laserquellen sind in den Verweisen 4 und 5 zu sehen. Wichtige Kennzahlen sind in Tabelle 1 hervorgehoben . <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Laserquelle eine hohe Wiederholrate hat, die im Megahertz-Regime ( z. B. Dutzende MHz) liegen sollte, um eine ultraschnelle Bildgebung in ATOM zu gewährleisten. Stellen Sie auch die Spitzenleistung der Laserleistung weit unter die Schadensschwelle des Faserhohlraums, ca. 1 kW. </li><li> Sicherstellung einer guten Schuss-zu-Schuss-Zeit- und Spektralstabilität der gepulsten Laserquelle. HINWEIS: Typische Toleranz bei der spektralen Amplitudenschwankung sollte innerhalb von 1,2% gehalten werden 19 , 20 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 21, wie es der Faser-Modus-verriegelte Laser in diesem Setup erreicht hat. HINWEIS: Die optische Bandbreite der Laserquelle wird voraussichtlich 10-100 nm betragen, was für eine ausreichende Bildgebung (FOV) in der Einzelzell-Bildgebung wesentlich ist. </li></ol></li><li> Durch einen Faserkollimator koppeln Sie den lasergepulsten Strahl zu einer einmodendispersiven optischen Faser, in der die Impulse über die Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) gestreckt werden ( Abbildung 1a ). HINWEIS: Dies ist der Prozess, nach dem das Spektrum jedes Pulses auf die Zeit als eine wellenlängengespannte Wellenform ( dh eine Wellenlängen-zu-Zeit-Abbildung) abgebildet wird. HINWEIS: Die gesamte erforderliche GVD sollte ausreichen, um sicherzustellen, dass die gesamte ATOM-Bildauflösung nicht durch den Wellenlängen-zu-Zeit-Mapping-Prozess beeinflusst wird (siehe Diskussion). Typischerweise sollte die GVD im NIR-Bereich weit über 0,1 ns / nm liegen. Zum Beispiel ist eine Einmodenfaser, die in thi verwendet wirdS Stromaufbau liefert eine Gesamt-GVD von 0,38 ns / nm um die Wellenlänge von 1.060 nm (eine Gesamtfaserlänge von 10 km). </li></ol></li><li> Spektralkodierungsmodul <ol><li> Konstruieren Sie ein optisches Mikroskopsystem, um die spektral codierte Abbildung der Zellen, die entlang des mikrofluidischen Kanals fließen, durchzuführen, wie in 1 dargestellt . HINWEIS: Die Schlüsselkomponenten dieses optischen Mikroskops sind: (1) ein Beugungsgitter, ein teleskopisches Relaislinsenmodul (RL1 und RL2 in Abbildung 1 ) und zwei Objektivlinsen (Obj1 und Obj2 in Abbildung 1 ). <ol><li> Zuerst beleuchten Sie den zeitgesteuerten und kollimierten Strahl auf ein Beugungsgitter (Transmissionstyp-Gitter wird in diesem Aufbau verwendet), um eine spektrale Dusche zu erzeugen ( Abbildung 1c ). HINWEIS: Die Leistung des gebeugten Strahls ( dh die Beugungseffizienz) kann durch Einstellen von t maximiert werdenEr Rasterorientierung für die Littrow-Konfiguration geschlossen. </li><li> Konfigurieren Sie die beiden Relaislinsen (RL1 und RL2) in einem 4-f-Bildsystem ( dh legen Sie das Beugungsgitter auf die Brennebene von RL1 und trennen Sie RL1 und RL2 um einen Abstand, der der Summe ihrer Brennweiten entspricht Wird dann auf die hintere Brennebene der Objektivlinse Obj1 abgebildet). </li><li> Die Spektraldusche sorgfältig ausrichten, um die hintere Blende des Obj1 zu füllen, so dass die spektrale Dusche projiziert und auf die Bildebene des Mikroskops fokussiert werden kann. HINWEIS: Hier ist die NA der Objektivlinse (Obj1 in Abbildung 1 ) 0,75. </li><li> Legen Sie eine weitere Objektivlinse (Obj2 in Abbildung 1 ) mit einem ähnlichen NA und einem Planspiegel an der hinteren Blende dieser Objektivlinse (Obj2), so dass der spektrale Duschstrahl so ausgerichtet werden kann, dass er die Bildebene verdoppelt und zurückkehrt Beugungsgitter. </li><li> EinstellenDas Objektivobjektiv (Obj1 und Obj2), so dass sich ihre Fokalebenen einander überlappen. Überprüfen Sie, ob die spektrale Dusche die Bildebene am selben Ort verdoppelt und kehrt nach demselben Weg zum Gitter zurück. Wenn nicht, führen Sie eine weitere Ausrichtung und Abstimmung des optischen Systems durch. HINWEIS: Das zurückgeführte Licht sollte durch einen zusätzlichen Strahlteiler gehen, so dass das Licht auf ein asymmetrisches Detektionsmodul übertragen werden kann. </li><li> Die Verstärkung des optischen Verstärkers auf einen geeigneten Pegel einstellen, so dass das resultierende Signal vom Photodetektor mit einem guten SNR detektiert werden kann, das typischerweise bei&gt; 10 dB liegt. </li><li> Legen Sie die Position des mikrofluidischen Chips auf die Probenplattform und stellen Sie sicher, dass die spektrale Dusche und damit der Abbildungsbereich über dem mikrofluidischen Kanal platziert ist ( Abbildung 1d ). HINWEIS: Die spektrale Dusche wird orthogonal zur Strömungsrichtung der Fluidik im Inneren des m beleuchtetMikrofluidischen Chip, so dass die fließende Bewegung automatisch zweidimensionale (2D) Scans durchführt. </li></ol></li></ol></li><li> Asymmetrisches Detektionsmodul <ol><li> Legen Sie einen zusätzlichen Strahlteiler, um den abgebildeten Strahl in zwei zu trennen ( Abbildung 1e ). HINWEIS: Jede Balkenreplik ist teilweise durch eine Messerkante blockiert. </li><li> Messen und Aufzeichnen der optischen Leistung des Strahls vor dem Strahlblock. Dann die Messerkanten manuell positionieren (auf einer linearen Translationsstufe montiert), so dass sie die Hälfte des Strahls grob blockieren (durch visuelle Inspektion). Danach verwenden Sie das optische Leistungsmessgerät, um die Strahlleistung zu überwachen, während Sie die Position der Messerkanten fein abgestimmt haben, indem Sie sie über den Strahl übersetzen. HINWEIS: Es wird vorgeschlagen, dass die optimale Position dort ist, wo die Leistung um ~ 50% des ursprünglichen Wertes verringert wird ( dh der unblockierte Fall). Dies ist die Bedingung, die die beste Kombination von Bildsignal liefertKraft- und Bildkontrastverstärkung. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 für eine andere Strahlreplik. Beachten Sie, dass die Orientierung des Teilstrahlblocks für einen Strahl gegenüber dem anderen Strahl entgegengesetzt sein sollte ( Abbildung 1f ). </li><li> Die beiden teilweise blockierten Strahlen in zwei getrennte Einmoden-Faserarme durch Zweifaser-Kollimatoren vermengen. HINWEIS: Einer der Arme hat eine zusätzliche Faserlänge, die als faserbasierte Verzögerungslinie dient, um eine zeitliche Verzögerung in Bezug auf die andere Replik (ohne die Verzögerungslinie) einzuführen ( Abbildung 1g ). Beide werden vor der Photodetektion auf eine einzige Faser durch einen Faserkoppler gerichtet. Die Zeitverzögerung sollte lang genug sein, um die beiden Repliken zeitweise zu trennen und kurz genug zu sein, um eine zeitliche Überlappung mit der nächsten Wellenform zu vermeiden ( dh die beiden Repliken sind immer zeitverschachtelt und zeitmultiplexiert in einer einzigen Faser vor der Detektion ( Abbildung 2a )). </li><li> KappeTrennen und digitalisieren die detektierten optischen Signale mit dem Echtzeit-Oszilloskop. Beachten Sie, dass die Bandbreite und damit die Abtastrate des Oszilloskops ausreichend hoch sein sollte, um sicherzustellen, dass sie die endgültige Bildauflösung nicht beeinflussen (siehe Diskussion). HINWEIS: Hier ist bei der GVD von 0,38 ns / nm eine Backend-Erfassungsbandbreite und eine Abtastrate von&gt; 20 GHz bzw.&gt; 40 GSa / s erforderlich. </li></ol></li></ol> 3. Experimentelle Verfahren <ol><li> Probenbeladung <ol><li> Führen Sie die Zellzählung unter einem herkömmlichen Phasenkontrastmikroskop in einem Standard-Hämocytometer durch. </li><li> Die Zelldichte durch Verdünnen mit 1x PBS (mit Quellwasser für Mikroalgen) anpassen und gut mit einer Pipette vermischen. HINWEIS: Die vorgeschlagene Konzentration beträgt 10 5 bis 10 6 Zellen / ml. </li><li> Montieren Sie den mikrofluidischen Chip auf die Probenplattform des optischen Abbildungssystems. HINWEIS: Die mikrofluidischeChip besteht hauptsächlich aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und wird nach dem Standard-Replik-Formverfahren hergestellt. Der mikrofluidische Kanal ist mit einem asymmetrisch gekrümmten Kanal ausgelegt, um den inertialen Strömungsfokussierungseffekt zu erzeugen, so dass die Zellen in einer Einzeldatei im Abbildungsabschnitt (mit einer Abmessung von 80 μm x 80 μm (Höhe x Breite)) mit hoher Geschwindigkeit fließen können . </li><li> Übertragen Sie die Dichte-fixierte Zelllösung auf eine 10-ml-Spritze. </li><li> Verbinden Sie die Spritze mit dem Einlass des mikrofluidischen Chips und einem Zentrifugalrohr zum Auslass des mikrofluidischen Chips für die Entsorgung. </li><li> Montieren Sie die Spritze auf eine Spritzenpumpe und stellen Sie eine geeignete Durchflussrate ein, um einen wünschenswerten Durchsatz zu erzielen und um eine übermäßige Scherkraft zwischen den Zellen und dem Kanal zu vermeiden. HINWEIS: Die lineare Geschwindigkeit der Proben sollte innerhalb von 0,5 und 10 m / s liegen. Beachten Sie, dass vor der eigentlichen Bildaufzeichnung oftmals eine Feinabstimmung des Systems erforderlich istBildsignalstärke und Optimierung der Bildfokussierung durch Wiederholen der Schritte 2.2.1.4-2.2.1.6. </li></ol></li></ol> 4. Datenerfassung <ol><li> Legen Sie für jedes Experiment eine geeignete Anzahl von Datenpunkten fest. Die Anzahl der zu speichernden Datenpunkte hängt von der Größe und dem Durchfluss der Proben ab. HINWEIS: In der Regel ist es auf 8-16 Millionen Probenpunkte unter einer Abtastrate von 80 GSa / s eingestellt. </li><li> Erfassen und Speichern der Daten im Batch-Modus mit dem Oszilloskop. </li></ol> 5. Backend-Verarbeitung <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55840/55840fig2.jpg" /> Abbildung 2: Rekonstruktion von ATOM-Bildern aus der Line-Scan-Zeitspur. Zur Rekonstruktion der ATOM-Bilder mit dem Absorptionskontrast und dem differenziellen (verstärkten) Phasenkontrast werden zwei Sätze von zeitgesteuerten Impulsen (siehe die violetten und grünen Impulse) extrahiert( A ) die zeitmultiplexierte zeitliche Wellenform-Spur und werden dann digital segmentiert und gestapelt, um ( b ) zwei 2D-Bilder zu bilden, die die beiden entgegengesetzten Phasen-Gradienten-Kontraste zeigen. Beachten Sie, dass ein Schervorgang erforderlich ist, um ( c ) die verzerrungsfreien Bilder zu bilden, indem die Subindexverschiebung aufgrund des Rundungsfehlers in der Laserwiederholungsratenschätzung kompensiert wird. Durch Subtrahieren der ( d ) Rohlinienabtastung von der spektralen Intensitätshüllkurve der Laserquelle kann der Hintergrund der Bilder entfernt werden. ( G ) Ein Absorptionskontrastbild kann durch eine Pixel-für-Pixel-Intensitätssummierung der Bilder ( e ) und ( f ) erhalten werden, während ( h ) ein Differenzphasen-Gradienten-Kontrastbild aus der Subtraktion von Bildern (z.B. ) Und (f). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55840/55840fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen</a>Dieser Figur. <ol><li> Übertragen Sie die Daten vom Oszilloskop auf die Computer für die Offline-Bildrekonstruktion. HINWEIS: Hier werden die Daten auf einer tragbaren Festplatte gespeichert und manuell zwischen dem Oszilloskop und den Verarbeitungscomputern übertragen. Die Kapazität der Festplatte sollte für jedes Experiment mehr als 500 GB betragen. <ol><li> Verwenden Sie die Schlüsselbild-Rekonstruktionsroutine, um die Zeilen-Scans digital zu digitalisieren, um ein 2D-Bild zu bilden ( Abbildung 2 ). HINWEIS: Das benutzerdefinierte Programm (in MATLAB) erzeugt dann zwei asymmetrische Erfassungsbilder, indem die beiden zeitmultiplexten Datensätze (violette und grüne Wellenformen in Abbildung 2 ) getrennt werden. <ol><li> Erhalten eines Differenzphasen-Gradienten-Kontrastbildes durch Subtrahieren der Intensitäten der beiden asymmetrischen Erfassungsbilder; Kann ein Absorptionskontrastbild durch Addition der beiden asymmetrischen Erfassungsbilder erhalten werden. Sehen Sie ausgewählte Bilder von MCF-7 und Mikroalgen inAbbildung 3 Beachten Sie, dass die Hintergrundprofile einzelner Bilder zunächst eliminiert und ihre Intensitäten vor der Bildsummierung und Subtraktionsoperationen normalisiert werden sollten. </li></ol></li><li> Generieren Sie eine Bibliothek von Parametern, die aus den Bildern abgeleitet sind, wie z. B. Zellvolumen, Kreisförmigkeit und Absorptionsdichte, etc. für die weitere Analyse. </li></ol></li><li> Geben Sie die Datenbibliothek in die Datenvisualisierungsplattform ein ( Abbildung 4 ). <ol><li> Laden Sie die Bibliothek der Parameter und die entsprechenden rekonstruierten Bilder auf die Visualisierungsschnittstellenplattform. </li><li> Setzen Sie die Achsen auf die Parameter von Interesse. HINWEIS: Die Parameter sind problemspezifisch und werden vom Benutzer definiert. Sie werden aus den ATOM-Bildern vom MATLAB-Programm abgeleitet. Hier ist die optische Absorptionsdichte der Zelle, des Zellbereichs, des Zellvolumens und der Zellkreisförmigkeit zur Auswahl verfügbar. </lI&gt; <li> Wählen Sie den anzuzeigenden Datensatz aus, damit jedes Zellbild als unterschiedlicher Datenpunkt auf dem Streudiagramm visualisiert werden kann. </li><li> Bewegen Sie den Mauszeiger auf jeden Punkt, so dass das entsprechende Bild und andere Parameter in einem schwebenden Unterfenster angezeigt werden. HINWEIS: Die Achsen können zwischen den linearen und logarithmischen Skalen interaktiv geändert werden. </li><li> Führen Sie eine weitere Analyse einer beliebigen Teilmenge des Datensatzes durch manuelles Verschieben auf dem Streudiagramm durch. HINWEIS: Das Histogramm in jedem Parameter der gated Teilmenge kann gegen die der gesamten Bibliothek aufgetragen werden. Die separaten Histogramme werden in einem anderen schwimmenden Unterfenster angezeigt. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K., Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. , 23-45 (2016).</li><li>Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+time-encoded+amplified+imaging+for+real-time+observation+of+fast+dynamic+phenomena.">Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena.</a> Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).</li><li>Goda, K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersive+Fourier+transformation+for+fast+continuous+single-shot+measurements.">Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements.</a> Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).</li><li>Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+time-stretch+imaging+-+an+emerging+tool+for+high-throughput+imaging+flow+cytometry.">Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry.</a> Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).</li><li>Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Time+Stretch+for+High-Speed+and+High-Throughput+Imaging+-+From+Single-Cell+to+Tissue-Wide+Scales.">Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales.</a> IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).</li><li>Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+time-stretch+imaging:+Principles+and+applications.">Optical time-stretch imaging: Principles and applications.</a> Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).</li><li>Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+time-stretch+imaging:+Principles+and+applications.">Optical time-stretch imaging: Principles and applications.</a> Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).</li><li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer.">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li><li>Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+amplified+dispersive+Fourier+transformation.">Theory of amplified dispersive Fourier transformation.</a> Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).</li><li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer.">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li><li>Lai, Q. T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+time-stretch+imaging+flow+cytometry+for+multi-class+classification+of+phytoplankton.">High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton.</a> Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).</li><li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Learning+in+Label-free+Cell+Classification.">Deep Learning in Label-free Cell Classification.</a> Sci Rep. 6, 21471 (2016).</li><li>Fard, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+serial+time-encoded+amplified+microscopy+for+high-speed+contrast-enhanced+imaging+of+transparent+media.">Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media.</a> Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).</li><li>Lau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+time-stretch+microscopy+for+ultrafast+quantitative+cellular+and+tissue+imaging+at+1+mum.">Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum.</a> J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).</li><li>Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+high-throughput+cell+screening+in+flow.">Label-free high-throughput cell screening in flow.</a> Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).</li><li>Wong, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric-detection+time-stretch+optical+microscopy+(ATOM)+for+ultrafast+high-contrast+cellular+imaging+in+flow.">Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow.</a> Sci Rep. 4, 3656 (2014).</li><li>Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+for+biodiesel+production+and+other+applications:+A+review.">Microalgae for biodiesel production and other applications: A review.</a> Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).</li><li>Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+biodiversity+patterns+of+marine+phytoplankton+and+zooplankton.">Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton.</a> Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).</li><li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+Laser+Source+for+High+Frame-Rate+Optical+Time-Stretch+Microscopy+at+1.0+&#181;m.">Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 &#181;m.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).</li><li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breathing+laser+as+an+inertia-free+swept+source+for+high-quality+ultrafast+optical+bioimaging.">Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging.</a> Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).</li><li>Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+measurements+of+optical+spectral+coherence+by+single-shot+time-stretch+interferometry.">Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry.</a> Sci Rep. 6, 27937 (2016).</li><li>Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+serial+time-encoded+amplified+microscope.">Performance of serial time-encoded amplified microscope.</a> Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+circulating+tumour+cell+research.">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+counting+tumor+cells.">Beyond counting tumor cells.</a> Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).</li><li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer.">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).</li><li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells.">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Sci Transl Med. 5 (179), (2013).</li><li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces.">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Scientific Reports. 3, 1259 (2013).</li><li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples.">marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).</li><li>Krebs, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumour+cells-biology+and+biomarkers.">Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Laser-Scanning+Time-Stretch+Imaging+at+Visible+Wavelengths.">Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths.</a> Light Sci Appl. , (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere technische Details, die während des ATOM-Systemaufbaus besondere Aufmerksamkeit erfordern. Zunächst ist zu beachten, dass asymmetrische / schräge spektral-kodierte Beleuchtungen im Absorptionskontrast Restphasen-Gradienten-Komponenten ( dh die Shadowing-Wirkung) einführen und die Verstärkung des Phasenkontrastes in ATOM beeinflussen können. Daher sollte dieser Effekt der Schrägbeleuchtung minimiert werden. Zweitens sollte betont werden, dass das Zeitmultiplex- oder Zeitverschachtelungssch...

Die optische Bildgebung stellt ein leistungsstarkes Werkzeug und zellbasiertes Assay dar, um die detaillierte räumliche Verteilung vieler zellulärer / subzellulärer Komponenten (fast) nicht-invasiv zu visualisieren und so eine Vielzahl von morphologischen, biophysikalischen und biomolekularen Signaturen von Zellen aufzudecken. Allerdings wurde diese Fähigkeit, hochinhaltswerte Informationen aus einzelnen Zellen zu extrahieren, im Allgemeinen beeinträchtigt, als eine enorme und heterogene Population von Zellen untersucht werden musste. Dies markiert einen gemeinsamen Kompromiss in zellbasierten Assays zwischen Messdurchsatz und Inhalt. Ein bemerkenswertes Beispiel ist, dass das Hinzufügen von bildgebenden Fähigkeiten zur Durchflusszytometrie zu einer Abwärtsskalierung des Durchsatzes um mindestens 1-2 Größenordnungen im Vergleich zu dem der klassischen nicht-bildgebenden Durchflusszytometer geführt hat. Obwohl es eine komplexe morphologische Einzelzellanalyse anbieten könnte, die bei Standard-Durchflusszytometern 1 nicht möglich ist, fehlt der Imaging-Durchflusszytometrie im Allgemeinen ein ausreichender Durchsatz an idVermitteln zelluläre Heterogenität mit hohem statistischem Vertrauen. Dies ist notwendig für neue Entdeckungen in der Biologie und für ein Verständnis der Pathogenese von Krankheiten. Die zentrale technische Herausforderung liegt in der inhärenten Geschwindigkeitsbegrenzung, die durch die üblichen optischen Abbildungsstrategien auferlegt wird: Laserstrahlabtastung ( z. B. durch galvanometrische Spiegel) und / oder Bildsensoren ( z. B. ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD) und komplementäre Metall- Oxid-Halbleiter (CMOS)). Die Laserscangeschwindigkeit wird durch die mechanische Trägheit der Abtastspiegel intrinsisch eingeschränkt, während die Bildrate von CCD oder CMOS durch den grundsätzlichen Kompromiß zwischen Abbildungsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit begrenzt wird ( dh die Erhöhung der Bildrate führt zu einer reduzierten Signaldetektionsempfindlichkeit , und umgekehrt). Basierend auf einem all-optischen, ultraschnellen Bildkodierungsmechanismus wurde die optische Zeitstreck-Bildgebung als eine attraktive Plattform für den Hochdurchsatz-Durchflusszyklus gezeigtOmeter ohne Notwendigkeit der herkömmlichen Bildsensoren oder mechanischen Laserscans 2 , 3 . Ausführliche Beschreibungen des Arbeitsprinzips der Zeit-Streck-Bildgebung finden sich in den Referenzen 4 , 5 , 6 , 7 . Kurz gesagt besteht sie aus zwei austauschbaren Abbildungsschritten: (i) spektrale Kodierung (Wellenlängen-Raum-Abbildung), bei der die räumlichen Koordinaten der abgebildeten Probe auf unterschiedliche Wellenlängen über das Spektrum des lichtgepulsten Strahls 8 , 9 abgebildet werden, Und (ii) eine dispersive Fourier-Transformation (Wellenlängen-Zeit-Abbildung) 9 , bei der die Wellenlängenkomponenten einzelner Laserpulse über Gruppengeschwindigkeitsdispersion (GVD) in zeitliche (wellenlängengespannte) Wellenformen transformiert (gestreckt) werden ( Abbildung 1 ). Ein wichtigerMerkmal der Zeitstreck-Bildgebung ist die optische Verstärkung, die bei der Bekämpfung des Verlustes der Empfindlichkeit durch ultraschnelle Photodetektion und GVD-Verlust eine entscheidende Rolle spielt, wodurch das Bildsignal-Rausch-Verhältnis (SNR) verbessert wird, ohne dass es durch das Photodetektorrauschen 9 verunreinigt wird . Da jeder Laserpuls eine Zeilenabtastung der abgebildeten Probe kodiert, die orthogonal zum unidirektionalen Fluss der Zellen ist, wird eine effektive Zeilenabtastrate durch die Laserwiederholrate bestimmt, die typischerweise über 10 MHz hinausgeht. Diese ultraschnelle Operation ermöglicht eine unscharfe, einzellige Bildaufnahme bei einem Durchsatz von 10.000-100.000 Zellen / s ( dh 10-100 mal höher als herkömmliche Bildgebungsdurchflusszytometrie). Infolgedessen konnte die Zeitstreckungsdarstellung im Hochdurchsatz-, Einzelzell- und bildbasierten Screening einzigartige Anwendungen finden, insbesondere wenn es notwendig ist, unbekannte Heterogenität oder seltene / aberrante Zellen innerhalb einer beträchtlichen Population zu identifizieren (Tausende bis Millionen von Cel<html> Ls), wie seltene Krebszellen-Screening 10 oder Mikro-Algen-Klassifizierung 11 . Die Time-Stretch-Bildgebung beruht vorwiegend auf einer Hellfeld-Feldaufnahme (BF), aus der der Bildkontrast durch Lichtstreuung und Absorption aus den Zellen 2 , 3 , 9 , 10 , 11 erzeugt wird . Solche etikettfreien, einzelligen Bildgebungsfähigkeiten könnten die nachteiligen Effekte, die mit den fluoreszierenden Markierungen verbunden sind, wie z. B. Zytotoxizität und Photobleichung, umgehen und dennoch wertvolle Informationen für die Einzelzellanalyse basierend auf der zellulären und subzellulären Textur und Morphologie liefern. Diese etikettfreien Parameter erwiesen sich als wirksam für die Tiefenbildklassifizierung von Zellen, besonders wenn eine enorme Zellpopulation verfügbar ist 11 ,&quot;Xref&quot;&gt; 12 Allerdings stellt die BF-Bildgebung in vielen Fällen keinen ausreichenden Kontrast dar, um die detaillierte Morphologie der etikettfreien transparenten Zellen zu zeigen. Für die Verbesserung des bildgebenden Kontrastes bei ultraschnellen Bildraten 13 , 14 , 15 wurden verschiedene etikettfreie, phasenkontrast- und zeitstreckenbildende Modalitäten entwickelt. Unter diesen Techniken wurde eine asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) entwickelt, um den Phasendifferenz- (Differential-Interferenz-Kontrast- (DIC) -ähnlichen) Kontrast auf der Grundlage eines Konzepts ähnlich der Schlieren-Fotografie zu zeigen, Freie, kontrastreiche Bildgebung einzelner Zellen mit einer ultrahohen mikrofluidischen Geschwindigkeit (bis zu 10 m / s) 16 . Dieser Effekt kann leicht durch eine schräge Erfassung oder Beleuchtung durch teilweises Blockieren des bildkodierten Strahlengangs oder Kippen des Strahls vor der Photodetektion erzeugt werden. Ein weiterer Vorteil von ATOM ist seinUm gleichzeitig zwei Phasen-Gradienten-Kontraste entlang entgegengesetzter Orientierungen zu erwerben. Intensitäts-Subtraktion und Summierung von zwei entgegengesetzten Kontrastbildern ergeben den differenziellen Phasenkontrast bzw. den Absorptionskontrast aus dem gleichen Zeilen-Scan. Diese Arbeit stellt ein detailliertes Protokoll dar, das die Implementierung von ATOM beschreibt, einschließlich der Einrichtung des optischen Aufbaus, der Probenvorbereitung und der Datenerfassung und Visualisierung. Speziell zeigt diese Arbeit die ATOM-Operation mit der einzelligen Bildgebung von menschlichen Blutzellen, Krebszellen und Phytoplankton (Mikroalgen). Dies unterstreicht die Anwendbarkeit von ATOM auf die bildgebende Durchflusszytometrie nicht nur im biomedizinischen Bereich, sondern auch in der Meeres- und Biokraftstoffforschung 17 , 18 .

<table><tbody><tr><td>Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X</td><td>Nikon</td><td>MRF07420</td><td>Objective lens (Obj2)</td></tr><tr><td>Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X</td><td>Olympus</td><td>RMS40X-PF</td><td>Objective lens (Obj1)</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lenses</td><td>Thorlabs</td><td>LA1145-C</td><td>For relaying spectral shower</td></tr><tr><td>FC/APC Fiber Collimation Package</td><td>Thorlabs</td><td>F220APC-1064</td><td>For outputing and collecting laser pulses</td></tr><tr><td>Pellicle beamsplitter</td><td>Thorlabs</td><td>BP145B3</td><td>For making beam replica</td></tr><tr><td>Protected silver mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>For reflecting light</td></tr><tr><td>800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver</td><td>Newport</td><td>1544-B</td><td>For converting light into electrical signal</td></tr><tr><td>Infiniium High-Performance Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSOX91604A</td><td>To save the light-converted electrical signals</td></tr><tr><td>HI1060 optical fiber</td><td>Corning</td><td>HI1060</td><td>Optical fiber for time-stretch</td></tr><tr><td>YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER</td><td>Keopsys</td><td>KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA</td><td>Optical in-line amplifier</td></tr><tr><td>Holographic grating</td><td>Wasatch Photonics</td><td>020305-6</td><td>Grating</td></tr><tr><td>Infuse/Withdraw Syringe Pumps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels</td></tr></tbody></table>

microfluidic imaging flow cytometry by asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (atom)

Die Skalierung der Anzahl der messbaren Parameter, die eine multidimensionale Datenanalyse und damit höhere statistische Konsequenzen ermöglicht, war der Haupttrend in der fortgeschrittenen Entwicklung der Durchflusszytometrie. Besonders das Hinzufügen hochauflösender Imaging-Fähigkeiten ermöglicht die komplexe morphologische Analyse von zellulären / subzellulären Strukturen. Dies ist bei Standard-Durchflusszytometern nicht möglich. Allerdings ist es wertvoll, unser Wissen über zelluläre Funktionen voranzubringen und kann der Life Science Forschung, der klinischen Diagnostik und der Umweltüberwachung zugute kommen. Die Einbindung von bildgebenden Fähigkeiten in die Durchflusszytometrie beeinträchtigt den Assay-Durchsatz, vor allem aufgrund der Einschränkungen der Geschwindigkeit und der Empfindlichkeit in den Kameratechnologien. Um diese Geschwindigkeits- oder Durchsatz-Herausforderung zu überwinden, die der bildgebenden Durchflusszytometrie unter Beibehaltung der Bildqualität entgegensteht, wurde die asymmetrische Erkennungszeit-Streck-Optikmikroskopie (ATOM) gezeigt, um ein kontrastreiches, einzelliges Individuum zu ermöglichenMit subzellulärer Auflösung, bei einem Bilddurchsatz bis zu 100.000 Zellen / s. Basierend auf dem bildgebenden Konzept der konventionellen Zeitstreck-Bildgebung, das durch die Verwendung von ultraschnellen Breitband-Laserpulsen auf die gesamte optische Bildcodierung und -abfrage beruht, führt ATOM die Bildgebungsleistung weiter, indem der Bildkontrast von unmarkierten / ungefärbten Zellen verbessert wird. Dies geschieht durch den Zugriff auf die Phasengradienteninformation der Zellen, die spektral in Einzelschuss-Breitbandimpulse codiert wird. Daher ist ATOM besonders vorteilhaft bei Hochdurchsatzmessungen von Einzelzellmorphologie und Textur - Information, die auf Zelltypen, Zustände und sogar Funktionen hindeutet. Letztendlich könnte dies zu einer leistungsfähigen bildgebenden Durchflusszytometrieplattform für die biophysikalische Phänotypisierung von Zellen werden, die den derzeitigen, auf dem Stand der Technik basierenden zellulären Test auf biochemischem Marker ergänzt. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erstellung der Schlüsselmodule eines ATOM-Systems (vom optischen Frontend bis hin zu Daten pRüstungs- und Visualisierungs-Backend) sowie der Workflow der bildgebenden Durchflusszytometrie auf Basis von ATOM unter Verwendung menschlicher Zellen und Mikroalgen als Beispiele.

<html> Diese Arbeit veranschaulicht zwei Einzelzell-Imaging-Demonstrationen von ATOM: eine mit Säugetierzellen (menschliche periphere Blutmononukleäre Zellen s (PBMC) und Brustkrebszellen (MCF-7)) und eine andere mit Phytoplankton s (Scenedesmus und Chlamydomonas). Das erste Experiment wurde durch das wachsende Interesse an der Flüssigbiopsie für die Detektion, Aufzählung und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) im Blut motiviert. ...

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Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie.

Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

microfluidic-imaging-flow-cytometry-asymmetric-detection-time-stretch

Universidad San Sebastian

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Electrical Engineering

Engineering

Unit 1

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Operational Amplifiers

SCIENTISTS IN ACTION

10.2K Aufrufe.  The University of Hong Kong.  Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines asymmetrischen Detektions-Zeitstreck-Optikmikroskopiesystems für die Einzelzell-Bildgebung in ultraschnellen mikrofluidischen Strömung und seine Anwendungen bei der Bildgebungsdurchflusszytometrie. 

Serie: Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Forschung

Biotechnik

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und Fluoreszenz-Imaging Durchflusszytometrie auf einem Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

Kombination von Fluidic Devices mit Mikroskopie und Durchflusszytometrie zur Untersuchung des mikrobiellen Transports in porösen Medien über räumliche Skalen hinweg

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Umwelt

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Immunologie und Infektion

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

Ingenieurwesen

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Biochemie

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

Räumliche Temporale Analyse des feldweisen Flusses in der Mikrovaskulatur

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Mikrofluidischer Tröpfchenassay für die Analyse der Einzelzell-Zytokinsekretion

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Enthüllung der Polyfunktionalität und Heterogenität in Immunantworten

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...