This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

1. SU8 Meister Fabrication <ol><li> Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen für drei Schichtherstellungs Design-Software verwenden und die Entwürfe von einem Lieferanten auf der Leiterplatte Folie gedruckt mit 10 &amp; mgr; m Auflösung. Die Details der Gerätedesign sind in einem angeschlossenen Referenz 6 und die Kanalgeometrien sind in Abbildung 1 gezeigt , gegeben. Die Schichten sollten Ausrichtungsmarken sind auf Merkmale 8 von jeder Herstellungsschicht helfen collocate. </li><li> Legen Sie eine vorgereinigte 3 Zoll Durchmesser Silizium-Wafer auf einem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 1.750 Umdrehungen pro Minute, mit einer Schichtdicke von 80 &amp; mgr; m bereitstellt. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt weitergehen. </li><li> Setzen Sie die beschichtete Wafer auf der 1. Schicht Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung Stellen Sie den Wafer auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 sec bei 5000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 40 um liefert. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Richten Sie die 2. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 4 min 30 sec, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30sec bei 1000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 100 um bereitstellt. </li><li> Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen. </li><li> Richten Sie die 3. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 9 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren. </li><li> Entwickeln der Masken durch in ein gerührtes Bad aus Propylenglykolmonomethylether-acetat während 30 min eingetaucht wird. Waschen Sie die Wafer in Isopropanol und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min. Platzieren Sie den entwickelten Master in einer 100 mm Petrischale für Polydimethylsiloxan (PDMS) Formen. </li></ol> 2. PDMS Gerätefertigung <ol><li> Bereiten Sie 10: 1 PDMS von 50 g Silikonbasis kombiniert mit 5 g Mittel in einem Plastikbecher zu heilen. Mischen Sie den Inhalt mit einem Drehwerkzeug mit einem Rührstab ausgestattet. Degals Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden. </li><li> Gießen Sie die PDMS mit einer Dicke von 3 mm über dem Master zu geben und zurück in den Exsikkator zur weiteren Entgasung. Sobald alle Blasen entfernt werden, backen das Gerät bei 80 ° C für 80 min. </li><li> Schneiden Sie das Gerät aus der Form mit einem Skalpell und auf eine saubere Oberfläche mit der strukturierten Seite nach oben und Punsch die fluidische und -auslässe mit einer 0,75 mm Biopsie Stempel verwenden. Das Gerät ist so geschnitten werden, dass die 120 &amp; mgr; m und 220 &amp; mgr; m groß Geometrien von der Seite der Vorrichtung zugänglich sind. </li><li> Plasma behandeln Sie das Gerät, mit Feature - Seite nach oben, zusammen mit einer vorgereinigte 2 Zoll von 3 Zoll Glasträger bei 1 mbar O 2 Plasma für 20 Sekunden in einem 300 W Plasma - Reiniger. Bond, die PDMS-Gerät von der strukturierten Seite der PDMS Vorrichtung auf die plasmabehandelte Seite der Glasobjektträger platziert. Stellen Sie das Gerät in einem 80 ° C Ofen und backen Sie die zusammengebauten Vorrichtung für 40 min. </li><li> Machen Sie die Kanälehydrophob durch eine Spritze unter Verwendung der Vorrichtung mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsfluid zu spülen. Unmittelbar backen das Gerät bei 80 ° C für 10 min, das Lösungsmittel zu verdampfen. </li></ol> 3. Herstellung von optischen Komponenten <ol><li> Bereiten Sie die Laseranregung Faser, die durch die Isolierung von der letzten 5 mm von einer 105 &amp; mgr; m-Kern, 125 um Mantel zu entfernen, NA = 0,22 optischen Faser. </li><li> Bereiten Sie die 2. Farbe Laseranregung Faser um 3,1 für eine 2. identische Faser zu wiederholen. </li><li> Bereiten Sie die Faser zum Sammeln des Fluoreszenzsignals von 3,1 für einen 200 &amp; mgr; m-Kern, 225 &amp; mgr; m Mantel wiederholen, NA = 0,39 optische Faser. </li><li> Überprüfen Sie die Spitzen aller Fasern - wenn die Spitzen in einer flachen Oberfläche nicht zu Ende, wieder spalten die Enden mit einem Faserschreiber. </li><li> Bringen Sie einen Laser-Faserkoppler mit einem 50 mW, 405 nm Laser und befestigen Sie eine der 105 &amp; mgr; m Kernfasern an den Laser. Richten Sie das abisolierte Ende am Sensor der LaserleistungMeter, und die Feinjustierung des Lasers Koppler verwenden, um die Laserleistung zu maximieren. </li><li> Wiederholen 3.5 für eine 50 mW, 473 nm-Laser. </li><li> Montieren Sie einen 446/510/581/703 nm Quad-Bandpassfilter auf der PMT Linse Röhren mit Laserlicht zu blockieren und emittiert Fluoreszenz übertragen. Bringen Sie Faserkoppler, so dass Licht den Filter durchläuft, bevor die PMT zu schlagen. </li><li> Bringen Sie die Faser von 3,3 auf der montierten Einheit in 3.7. </li></ol> 4. Offline-Mischemulsion-Generation <ol><li> Besorgen Sie sich einen Strömungs Fokus Mikrofluidik dropmaker Gerät mit einem 60 &amp; mgr; m × 60 &amp; mgr; m Öffnung. </li><li> Füllen Sie eine 1 - ml - Spritze mit HFE 7500 Ölen mit 2% ionisches Fluortensid 9. </li><li> Füllen einer Reihe von 1 ml Spritzen mit den folgenden Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Dextran-konjugiertes blaue Farbstoffe (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB und 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Montieren Sie die dropmaker Gerät auf der Bühne eines invertierten Microsbewältigen und die wässrigen und Öl Spritzen auf Spritzenpumpen. Paar die Spritzen an die Geräte PE-2 Schläuche verwenden. </li><li> Laufspritzenpumpen bei 500 &amp; mgr; l / h für die Öl- und 250 &amp; mgr; l / h für die wässrigen Lösungen, erstellen einer Mischung aus 80 &amp; mgr; m-Tröpfchen, die Lösungen von 4,3 enthält. Für jede Art von wässrigen Probe, mit einem frischen dropmaker Gerät eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Sammeln Sie ~ 200 &amp; mgr; l Emulsion aus jeder Farbstoffkombination in eine leere Spritze. </li><li> Nachdem die vier Tröpfchen Typen haben in einer einzigen Sammlung Spritze, mischen die Emulsion durch mehrmaliges Drehen der Spritze gesammelt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,6 mit wässrigen Lösungen, die 0,1, 1, 10 und 100 nM FITC in PBS. </li></ol> 5. Optical Fiber Insertion <ol><li> Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip hergestellt in Schritt 2 auf der Stufe eines inversen Mikroskops gekoppelt mit einer digitalen Kamera in der Lage von &lt;100 &amp; mgr; s Verschlusszeiten. </li><li> Arbeiten sorgfältig von der Seite, insert die Faser mit dem 473-nm-Laser in die am weitesten vorgelagerten 120 &amp; mgr; m Kanal gekoppelt, dabei nicht bis zur Hauptströmungskanal zu durchstechen. </li><li> Legen Sie die Faser mit dem 405-nm-Laser in die am weitesten stromabwärts 120 &amp; mgr; m hohen Seitenkanal und bietet Faserabstand von 300 &amp; mgr; m. </li><li> Legen Sie die PMT-gekoppelten Faser in den 220 &amp; mgr; m groß Kanal senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern. </li></ol> 6. Fluoreszenzdetektion von gemischten Emulsionen <ol><li> Halterung eine 5 ml Spritze mit HFE 7500 mit 2% ionisches Fluortensid mit dem Spacer Öleinlaß der Detektionseinrichtung mit PE-2 Schlauch gefüllt. </li><li> Montieren Sie die Spritze mit dem gemischten FITC / CB-Emulsion auf einem vertikal ausgerichteten Spritzenpumpe und koppeln an das Gerät des Tröpfchens reinjection Einlass mit PE-2 Schläuche enthalten. Schließen Sie eine Länge von PE-2 Schlauch aus dem Gerät Ausgang in einen Abfallbehälter. </li><li> Prime das Gerät von jeder der Pumpen bei 1000 &amp; mgr; l / h, bis beide LaufÖl und Tröpfchen werden zu sehen regelmäßig in dem Gerät und fließt stromabwärts kombiniert werden. </li><li> Stellen Sie die Durchflussraten, so dass das Abstands Öl läuft bei 6.000 &amp; mgr; l / h und die Tröpfchen bei 100 &amp; mgr; l / h und bietet erhebliche Abstand zwischen den Tröpfchen durch den Detektionsbereich reisen. </li><li> Schalten Sie den Laser, das Datenerfassungsprogramm zu starten, und stellen Sie die PMT-Verstärkung um Signale zu liefern, die mehr sind als das Grundrauschen Boden 100x. Stellen Sie die Laserleistung so, dass alle der Dublett Peaks auf einem einzelnen, linear skaliert Timetrace deutlich sichtbar sind. </li><li> Erwerben Sie 60 Sekunden der PMT-Spannung Timetrace bei mindestens 20 kHz. Importieren Sie die Daten in Rechenprogramm wie Matlab und messen die Höhen der Spitzen der aufgenommenen Dubletten das benutzerdefinierte Berechnungsprogramm Skript. Hinweis: Dies wird als zusätzliche Information zur Verfügung gestellt. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,2-6,7 die FITC-nur gemischte Emulsion in 4.7 erstellt wurden, mit der 405-nm-Laser ausgeschaltet. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

LWL-Erkennung erfordert die Ausrichtung der optischen Fasern in Bezug auf Fluidkanäle. Da unser Gerät Führungskanäle hergestellt mit mehrschichtigen Photolithographie verwendet, die Platzierung von Masken in Bezug zueinander ist von großer Bedeutung. Wenn die Faserleitkanäle zu nahe an der Fluidkanal sind, gibt es ein Potential für eine Fluidleckage; wenn die Führungskanäle zu weit entfernt oder falsch ausgerichtet angeordnet sind, kann das Fluoreszenzsignal von der Detektionsfaser gesammelt werden deutlich vermindert. Die richtige Ausrichtung kann durch die Gestaltung Ausrichtungsmarkierungen, wie konzentrische Kreise in Masken unterstützt werden, während der Fotostrukturierungs gemeinsam angeordnet werden. Zusätzlich manuelles Einlegen von Faseroptik in das Gerät ist ein heikler Prozess mit dem Potenzial, die Spitzen der Fasern innerhalb der Vorrichtung zu brechen, sie unbrauchbar zu machen. Fesselung Faser gegen den Glasobjektträger mit dem PDMS-Gerät verbunden ist und die Fasern langsam Einsetzen, während sie mit dem Mikroskop beobachtet werden Tasten successful Fasereinführung. Schließlich Reinjektion von vorgeformten Emulsionen sollten mit einem Minimum an Handhabung auftreten. Im Idealfall, wenn die Emulsion hergestellt wird und direkt in eine leere Spritze aufgebracht, sollte sie nicht übertragen werden, bis es zur Tropfen Reinjektion verwendet wird. Mehrfarbenerkennung erfordert, dass die Spitzen in einem Signal Dublett verschieden voneinander sein können und dass Signale von aufeinanderfolgenden Tröpfchen nicht überlappen. Die Erfassungsaufbau, die wir hier verwenden, verwendet ein Paar von 125 um optische Fasern in einem Mitte-zu-Mitte-Abstand von 300 &amp; mgr; m getrennt sind, einen nicht beleuchteten Bereich von ~ 175 &amp; mgr; m zwischen Anregung Regionen bereitstellt. Dies ermöglicht eine 80 um Tröpfchen zu einem Zeitpunkt nur von einer Lichtquelle angeregt zu werden, und stellt sicher, dass jede der Spitzen in einem Dublett ausschließlich eine Folge eines Typs von Laseranregung ist. Konstruktionen, bei denen die Trennung zwischen den Anregungsbereichen ähnlich dem Tröpfchendurchmesser geben problematische Signale mit überlappenden Emissionsspitze Dubletten. Ter Breite eines Signals Dublett zu der Zeit korreliert, dass es für die Vorderkante eines Tropfens nimmt die erste Erregungsregionen auf die Zeit, die Hinterkante des Tröpfchens einzugeben, um die endgültige Anregungsbereich, einen Abstand von ~ 500 &amp; mgr; m in der zu verlassen Gerät beschreiben wir. Um die Unterscheidbarkeit von benachbarten detektierten Tröpfchen zu erhalten, müssen Signal Dubletts durch einen niedrigen Signalbereich mindestens so breit wie das Signal Dublett beabstandet sind. Für die hier beschriebene Konfiguration, 80 &amp; mgr; m Tröpfchen wenigstens 1 mm voneinander beabstandet sind. Obwohl Mehrfarbenerkennung mit einem einzigen Photodetektor zum erhebliche Einsparungen in Bezug auf die Kosten und die Komplexität im Vergleich zu Standardtechniken ermöglicht, besteht ein gewisser Verlust an Robustheit, da emittiertes Licht nicht von der Wellenlänge gefiltert wird. Dies kann problematisch sein, wenn Tröpfchen Erfassungs die mehrere Fluorophore enthalten, die bei den gleichen Wellenlängen anzuregen, da die Fluoreszenzquelle nicht zu unterscheiden ist. Diese Einschränkungen können overc seinome durch Experimente mit nicht überlappenden Anregungsprofile durchgeführt werden oder durch Experimente entwerfen, wo bluten über spectral tritt nicht in einen &quot;Kanal&quot;, wo ein empfindlicher Test durchgeführt wird. Dies ist kompatibel mit vielen Tröpfchen mikrofluidischen Detektionsanwendungen, wo ein heller Hintergrund Farbstoff verwendet wird , das Vorhandensein eines Tropfens , um anzuzeigen, und ein zweites Fluorophor verwendet wird , um das Ergebnis eines Assays Molekularbiologie 10,11 zu melden. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken, unser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile: 1) räumlich registriert Anregung Regionen die Notwendigkeit für komplizierte Lichtfilterung zu beseitigen, und 2) die Verwendung von Faseroptik entfernt die Anforderungen für ein Mikroskop und optische Hardware, um Licht. Da wir gemeinsame technische Belange mit mikrofluidischen Detektionssysteme adressieren, haben frühere Forscher Methoden entwickelt, ähnliche Bedenken auszuräumen. Zum Beispiel Martini et al. Frequenz kodieren mehrfarbige Fluoreszenz aufgezeichnetdurch einen einzigen Detektor durch eine Anregungsquelle durch eindeutig strukturiert &quot;Strichcode&quot; Projizieren Filter 12. Unsere Verwendung eines optischen Faseranordnung ermöglicht die Verwendung eines ähnlichen Schema zeitlichen Codierung unter Verwendung von Standard, Komponenten aus dem Regal. Die Literatur zeigt optische zahlreiche optische Kopplungstechniken, die mehr gesteuert werden, dass die einfache Fasereinführung, die wir beschreiben. Bliss et al. Flüssigkeit gefüllt Lichtwellenleiter für die sorgfältig kontrollierte Lieferung und Sammlung von Licht , das von bestimmten Mikrokanalstellen 13, Martinez Vasquez et al. Achten Sie auf Wellenleiter - Laser in Quarzglas Substrate geätzt Anregungslicht 14 und Vishnubhatla et al liefern. Sind können präzise Ätzung 15 Fasereinführungskanälen unter Verwendung einer Kombination von Laserbestrahlung und chemische herzustellen. Jede dieser Techniken erfordern zusätzliche Schritte als diejenigen verwendet, um die Basis fluidischer Architektur eines microfl fabrizierenuidic Chip. Während diese Herstellungsverfahren für hochempfindliche Detektionsanwendungen erforderlich sein können, haben wir das Faser Einführen in einen geformten PDMS-Kanal gefunden für die meisten der alltäglichen Anwendungen in unserem Labor ausreichend ist. Das Detektionssystem konnte FITC-Konzentrationen zu detektieren bis 100 pM in 80 &amp; mgr; m-Tröpfchen, entspricht in etwa dem Nachweis von ~ 17.000 Fluorophor-Moleküle. Diese Empfindlichkeit ist adäquat für die meisten Anwendungen Detektions in unserem Labor derzeit ein Epifluoreszenz-basierten System, die am häufigsten von dem Zellsortierung von Assay positive Tröpfchen das Äquivalent von 10 6 Fluorophor - Moleküle PCR-aktiviert werden , die 11. Die Detektionsempfindlichkeit vergleicht auch vorteilhaft auf kurzem Empfindlichkeiten anderer optischer Faser - basierten Systemen berichtet , - zum Beispiel, ist es 200x empfindlicher als die Nachweisgrenze von 20 nM von Alexa Fluor 488 berichtet in&gt; 100 um Tröpfchen 7. We haben eine kompakte und modulare Tröpfchens mikrofluidischen Mehrfarberfassungsschema als Alternative zu den teureren, komplex und voluminös Epifluoreszenzmikroskop basierten Systemen dargestellt. Die erforderlichen Nachweiskomponenten verwendet hier (Laser, Fasern, Faser Adapter, Filter und PMT) für &lt;$ 10.000 gekauft werden so dass die Mehrfarbentropfenerkennung zugänglich zu einer großen Anzahl von Forschern, und so dass einzelne Ermittler mehrere Erkennungsstationen zu leisten in einem Labor. Das System kann auch einige Erfahrung basierende Zutrittsschranken entfernen, da ein Grad der Vertrautheit erforderlich ist freien Raum optische Systeme in Verbindung mit einem Epifluoreszenzmikroskop auszurichten. Zusätzlich wird die kleine Stellfläche der Erkennungen Setup macht es ideal für tragbare und diagnostische Anwendungen geeignet.

Tröpfchen Mikrofluidik eine Plattform für einen hohen Durchsatz biology von 1 in einem Trägeröl suspendiert Experimente in einer Vielzahl von wässrigen Tröpfchen Kompartimentierung. Droplets sind für Anwendungen als Einzelzellanalyse 2, digitale Polymerase - Kettenreaktion (PCR) 3, wie variiert verwendet worden und Enzym Evolution 4. Fluoreszierende Assays sind die Standard-Erfassungsmodus für Tröpfchen Mikrofluidik, als ihre helle Signale und schnelle Zeitverhalten kompatibel sind mit Sub-Nanoliter Tropfenvolumen bei Kilohertz Raten zu erfassen. Viele Anwendungen erfordern Fluoreszenzdetektion, um gleichzeitig mindestens zwei Farben. Zum Beispiel unserem Labor führt häufig Tröpfchensortierexperimente-PCR aktiviert , die ein Detektionskanal für das Ergebnis eines Assays zu verwenden, und verwendet eine Sekundärhintergrundfarbstoff Assay negative Tröpfchen zählbaren 5 zu machen. Typische Nachweisstationen für Tröpfchen Mikrofluidik sind based auf Epifluoreszenz- Mikroskope und erfordern Licht Manipulationen Systeme kompliziert Anregungslicht von freien Raum Laser in Mikroskop eingeführt werden, die Probe fokussiert werden. Nach Fluoreszenz von einem Tröpfchen abgegeben wird, wird das emittierte fluoreszierte Licht gefiltert, so daß jeder Detektionskanal eine Photovervielfacherröhre (PMT) auf einem Wellenlängenband zentriert verwendet. Epifluoreszenzmikroskop basierte optische Detektionssysteme bieten eine Zutrittsschranke aufgrund ihrer Kosten, die Komplexität und die erforderliche Wartung. Optische Fasern liefern die Mittel eine vereinfachte und robuste Detektionsschema zu konstruieren, da Fasern manuell in mikrofluidischen Vorrichtungen eingesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit für spiegelbasierte Lichtführung zu entfernen und so dass Lichtwege unter Verwendung von Lichtwellenleiterverbindern angeschlossen zu werden. In diesem Dokument beschreiben wir die Montage und Validierung eines kompakten und modularen Schema Mehrfarbenfluoreszenzdetektion durchzuführen, indem eine Anordnung von optischen Fasern eine Verwendungda einzelne Photodetektor 6. Lichtleitfasern sind mit individuellen Lasern und eingesetzt sind senkrecht zu einer L-förmigen Strömungskanal in regelmäßigen räumlichen Offsets. Ein Fluoreszenzsammelfaser wird an die Anregungsbereiche parallel orientiert und an einem einzigen PMT verbunden. Weil ein Tröpfchen zu unterschiedlichen Zeiten den Laserstrahlen durchläuft, durch den PMT aufgezeichneten Daten zeigt einen zeitlichen Versatz, dass der Benutzer zwischen der emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden erlaubt, nachdem die Tröpfchen durch jede einzelne Laserstrahl angeregt wird. Diese zeitliche Verschiebung eliminiert die Notwendigkeit emittierte Licht zu trennen PMTs zu trennen, um eine Reihe von dichroitische Spiegel und Bandpassfilter verwendet wird. Um die Wirksamkeit des Detektors zu validieren, zu quantifizieren wir Fluoreszenz in Tröpfchenpopulationen Farbstoffe unterschiedlicher Farbe und Konzentration einkapselt. Die Empfindlichkeit des Systems wird für einfarbige Fluorescein Detektion untersucht und zeigt die Fähigkeit Tröpfchen mit Konzentrationen zu detektieren bis zu 0,1 nm, eine 200x Empfindlichkeit improvement im Vergleich zu bisherigen Vorgehensweisen auf Faserbasis 7 in der Literatur berichtet.

<table><tbody><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3&quot; silicon wafers, P type, virgin test grade</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 gaugue needles</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 polyethylene tubing</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Commonly knowns as HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox Surfactant</td><td></td><td></td><td>Synthesis instructions in ref #10</td></tr><tr><td>Dextran-conjugated cascade blue dye</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Quad bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Fiber port</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>lens tube</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Patch cable with 200 &amp;#956;m core / 225 &amp;#956;m cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Patch cable with 105 &amp;#956;m core / 125 &amp;#956;m cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &amp;#956;m fiber stripping tool</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &amp;#956;m fiber stripping tool</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>laser fiber adapter</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adapter</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser at 50&amp;nbsp;mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distributor for CNI lasers</td></tr><tr><td>473 nm CW laser at 50&amp;nbsp;mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolor fluorescence detection for droplet microfluidics using optical fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Herstellung eines PDMS - Gerät , das für das Einsetzen von optischen Fasern ermöglicht , erfordert ein mehrstufiges photolithographischen Verfahren zu schaffen Kanäle unterschiedlicher Höhe (Abbildung 1). Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird auf einen Siliziumwafer versponnen und strukturiert, um eine Maske mit dem Fluidhandhabungs Geometrie zu schaffen. Als nächstes wird eine weitere 40 &amp; mgr; m Schicht aus SU-8 auf den Wafer gesponnen und strukturiert, um eine zweite Maske unter Verwendung von Merkmalen zu erzeugen, die 120 &amp; mgr; m groß Laserfaser Einführungskanäle bilden. Last 100 um mehr SU-8 auf den Wafer gesponnen und gemusterten Kanäle 220 um tall Detektions Fasereinsteckloch zu geben. Der Master wird entwickelt und verwendet, um ein PDMS-Gerät zu formen, die an einen Glasobjektträger geklebt wiederum. Die endgültige Herstellung enthält 80 &amp; mgr; m hohen Strömungsgeometrie, Durchkontaktierungslöcher zugegriffen in der Oberseite der Vorrichtung ausgestanzt und 120 &amp; mgr; m und 220 &amp; mgr; m groß optische Faserkanäle durch die Seite der abgerufenenGerät. Die Geometrie der Vorrichtung zur Detektion verwendet wird in Abbildung 2 dargestellt. Extern erzeugte 80 um Emulsionen werden reinjiziert in einen Drop - Port und Reinjektion durch Abstandsöl beabstandet , bevor sie eine L - Form Detektionskanal strömen. Zwei Laser-gekoppelten Fasern eingesetzt sind, in 120 &amp; mgr; m groß Kanäle Anregung bei diskreten räumlichen Orten in dem Strömungskanal bereitzustellen. Da die Multimode-Fasern eingesetzt in diese Kanäle haben eine 125 &amp; mgr; m Außendurchmesser und einen Kerndurchmesser 105 &amp; mgr; m, der gesamte Querschnitt des Strömungskanals wird durch Laserlicht beleuchtet. In unserem Gerät macht die Detektionsströmungskanal einen abrupten 90-Grad-Kurve nach dem letzten Bereich Laseranregung der Nähe optischen Zugang für eine 225 &amp; mgr; m OD Faser zu schaffen verwendet, um emittierte Fluoreszenz zu erkennen. Je größer Faser wird verwendet wegen seiner hohen numerischen Apertur (NA = 0,39), die auf einem Standard-Mikroskopobjektiv ähnlich ist. Ein Tröpfchen durch den Detektionskanal fließt trifft diskreten Anregungsbereiche vor jedem der Laser gekoppelten optischen Fasern (3A). Die einzelnen PMT gekoppelt mit den Detektionsfaser Aufzeichnungen emittierten Fluoreszenz mit einer zeitlichen Verschiebung die Karten zu der Anregungsquelle. Für ein Tröpfchen , die Farbstoffe , die bei 473 nm (Bereich &quot;1&quot; in 3A) erregt und bei 405 nm (Bereich &quot;2&quot; in 3B), die sich ergebende PMT - Signal enthält ein Signal Dublett mit einer Spitzentrennung enthält , die mit dem korreliert Zeit, die ein Tröpfchen aus einem Anregungsbereich zu dem nächsten zu bewegen. Durch zeitliches spektralen Daten auf diese Weise codiert, die Notwendigkeit für weitere Lichtfilterung und separaten PMTs für jeden Fluorophor Farbe beseitigt wird . 3B zeigt Signal Dubletts für einen Zug von 4 Tropfen mit unterschiedlichen Farbstoffkombinationen. Der erste Peak in der Doppel entsprechens auf die Fluoreszenz nach Anregung mit dem 473-nm-Laser in Bereich &quot;1&quot; ausgesendet und der zweite Peak entspricht der 405-nm-Laser in Bereich &quot;2&quot; nach der Anregung emittierten Fluoreszenz. Die Wirksamkeit des Detektionsschema wurde durch Detektieren einer gemischten Emulsion von Tröpfchen getestet Farbstoffe enthalten, die bei 405 nm (Dextran-konjugiertes blau, CB) und bei 473 nm (Fluoreszein, FITC) erregen. Tröpfchen wurden bei etwa 50 Hz durch die Erfassungsbereiche floß und die Daten wurden für 60 Sekunden aufgezeichnet werden, dann mit einem Rechenprogramm Skript nachbearbeitet. Die Daten sind in Figur 4 aufgetragen , und zeigt eine klare Trennung zwischen den vier reinjiziert Tröpfchentypen. Weil das Erfassungssystem zwischen verschiedenen Farben des emittierten Lichts unterscheidet nicht, wird jedes Tröpfchen durch seine maximale Gesamtfluoreszenz beschrieben, nachdem in Region erregt wird &quot;1&quot; (Peak 1) und in Region 2 (Peak 2). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; der Dynamikbereich und die absolute Empfindlichkeit des Detektors wird untersucht , indem die 405 - nm - Laser ausgeschaltet und das Messen der Fluoreszenz einer Emulsion , enthaltend Fluoreszein-only Tröpfchen (Abbildung 5). Die Daten zeigen die Fähigkeit der Farbstoffkonzentration, die von 0,1 bis 100 nM FITC auf einem einzigen Detektor mit den gleichen Erkennungseinstellungen Bereich zu erfassen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig1.jpg" /> Abbildung 1. Multi-Layer - Photolithographie. Die Mikrofluidik-Vorrichtung wird hergestellt, indem ein Master mit drei unterschiedlichen Merkmalshöhen zu schaffen. Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird aufgeschleudert und unter Verwendung einer Maske für die Fluidkanäle strukturiert. Als nächstes 40 um mehr SU-8 wird aufgeschleudert und 120 &amp; mgr; m groß Funktionen mit einem 2 gemustert sind nd durch beide Schichten SU-8 Maskengeometrie zu ergeben 125 &amp; mgr; m groß Lichtleitfasern aufzunehmen. Danach wird 100 &amp; mgr; m mehr SU-8 aufgeschleudert und mit einer 3 rd Maske strukturiert 225 &amp; mgr; m groß Eigenschaften zu erhalten. Nach dem Entwickeln PDMS Formen und Plasma - Bindung an Glas, enthält das resultierende Gerät große Kanäle von der Seite zugänglich für Fasereinführung, zusätzlich zu den Standard geschlossenen Fluidkanäle. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig2.jpg" /> Abbildung 2. Geräte - Design und optische Layout. Die fluidischen Teile der Vorrichtung bestehen aus einem Tröpfchen reinjector besteht und einem Öl Spacer, der mit einem L-förmigen Kanal. Fasern gekoppelt einzelnen Laser werden in Strömungsrichtung eingefügt normal. Eine Detektionsfaser senkrecht zu den Laserfasern eingesetzt, um Fluoreszenzlicht zu sammeln. Dieses Licht wird durch ab gefiltertandpass Filter, bevor sie von einem einzigen PMT entdeckt zu werden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig3.jpg" /> Abbildung 3. Zeitlicher Codierung von mehrfarbigen Informationen. (A) Droplets fließen durch Anregungsbereiche &quot;1&quot; und &quot;2&quot; zu verschiedenen Zeitpunkten, Zeitverschiebung , vorausgesetzt die Identifizierung des emittierten Lichts erlaubt. (B) von einem Zug von 4 verschiedenen Tröpfchen durch den Detektionskanal fließt. Der erste Peak jedes Dublett entspricht der Fluoreszenz nach Anregung in dem Bereich &quot;1&quot; ausgesendet und die zweite Spitze in jedem Doppel entspricht der Fluoreszenz nach Anregung in dem Bereich &quot;2&quot; ausgegeben. Die Höhe des Tropfenspitzen proportional der Menge an Farbstoff im angeregten agegebenen Wellenlänge, mit der Ausnahme, wenn spektrale Ausbluten mit überlappenden Anregungsspektren auf die Verwendung von Farbstoffen durch. Die Breite der Spitzen , die durch die Höhe der Zeit bestimmt werden , dass es ein Tröpfchen nimmt einen Anregungsbereich zu durchqueren. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig4.jpg" /> Abbildung 4. Multicolor Detektion eines gemischten Tröpfchenpopulation. Streudiagramm zeigt maximale Tröpfchenintensitäten für eine gemischte Tröpfchenpopulation nach Anregung und Emission durch einen 473-nm-Laser (Peak 1) und einem 405 nm-Laser (Peak 2). Die Tröpfchen enthalten Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Kaskaden blau (CB) in nM - Konzentrationen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen</a>Zahl. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig5.jpg" /> Abbildung 5. Einzelfarberkennung auf sehr unterschiedlichen Tröpfchen Bevölkerung. Histogramm der Emissionen durch eine gemischte Tröpfchenpopulation von 0,1 bis 100 nM Fluorescein nach Anregung durch einen 473 - nm - Laser enthalten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Aufrufe.  University of California, San Francisco. Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Serie: Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. This approach to colorimetric DNA detection was based on the hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes (AuNP probes). The growth size and configuration of the AuNP are dominated by the number of DNA samples hybridized with the probes. Based on the specific size- and shape-dependent optical properties of the nanoparticles, the number of mismatches in a sample DNA fragment to the probes is able to be discriminated. The tests were conducted via droplets containing reagents and DNA samples respectively, and were transported and mixed on the pneumatic platform with the controlled pneumatic suction of the flexible PDMS-based superhydrophobic membrane. Droplets can be delivered simultaneously and precisely on an open-surface on the proposed pneumatic platform that is highly biocompatible with no side effect of DNA samples inside the droplets. Combining the two proposed methods, the multi-nucleotide polymorphism can be detected at sight on the pneumatic droplet manipulation platform; no additional instrument is required. The procedure from installing the droplets on the platform to the final result takes less than 5 min, much less than with existing methods. Moreover, this combined MNP detection approach requires a sample volume of only 10 &#181;l in each operation, which is remarkably less than that of a macro system.

This work presents a simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform. With the proposed method, the entire experiment, including droplet manipulation and detection of multi-nucleotide polymorphisms, can be performed near 23 &#176;C without the aid of advanced instruments.

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Forschung

Genetik

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Synthese und Betrieb von Leuchtstofflampen-core Mikrokavitäten für Refraktometrische Sensing

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Ingenieurwesen

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Biotechnik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Biochemie

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Biologie

<meta charset="utf8"></head><body>Mikrofluidischer Tröpfchenassay für die Analyse der Einzelzell-Zytokinsekretion

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Enthüllung der Polyfunktionalität und Heterogenität in Immunantworten

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Der Visual kolorimetrischen Nachweis von Multi-Nukleotid-Polymorphismen auf einem pneumatischen Droplet Manipulation Platform

Synthese und Betrieb von Leuchtstofflampen-core Mikrokavitäten für Refraktometrische Sensing

Ohne Linsen auskommt, Fluoreszenz-Mikroskopie auf einem Chip

Fluoreszenz-Nachweisverfahren für Mikrofluidik-Tropfen-Plattformen

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Mikrofluidische Imaging-Durchflusszytometrie durch asymmetrische Detektion Zeitstreck-Optische Mikroskopie (ATOM)

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen

Mikrofluidischer Ansatz zur Auflösung der gleichzeitigen und sequentiellen Zytokinsekretion einzelner polyfunktioneller Zellen