Name: microfluidic imaging flow cytometry by asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (atom)
Uploaded: 2017-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM at JoVE.com

Bay P. Yeung&#39;e MCF-7&#39;yi bizim için hazırladığınız için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma kısmen Hong Kong Özel İdare Bölgesi, Çin (Proje No: 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 ve HKU 720112E), Yenilik ve Teknoloji Destekleme Programı (ITS / 090/14) Araştırma Hibe Konseyi&#39;nden hibeler tarafından desteklenmiştir. ) Ve HKU Üniversite Geliştirme Fonu&#39;dur.

1. Örnek Hazırlama <ol><li> Numune hazırlama (yapışkan hücreler; MCF-7 hücreleri) <ol><li> İnkübatörden hücre kültürü çanağını çıkarın ve kültür ortamını boşaltın. </li><li> Aşırı kültür ortamı uzaklaştırmak için hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir çanakta yıkayın. </li><li> Kültür çanak (100 mm çapında)% 0.25 tripsin bir çözüm 3 ml ekleyin ve 4 dakika boyunca 37 ° C,% 5 CO2 inkübatör koydu. NOT: Tripsin, hücrelerin yapışkan proteinini çözerek kültür çanağından ayrışır. </li><li> Tüm hücrelerin hafif bir mikroskop (10X objektif) kullanarak kültür çanağından ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Değilse, yavaşça hücre kültürü çanağını sallayın. </li><li> Tripsin hareketini durdurmak için standart kültür ortamının (% 89 Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 10 sığır fetüsü serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin (PS) ile formüle edilmiş) 4 mL&#39;yi ekleyin. </li><li> TTüm karışımı (tripsin çözeltisi ve kültür ortamındaki hücreleri) bir santrifüj tüpüne atın ve 200 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Tüm sıvıyı çıkarın ve 1 mL 1x PBS&#39;de (pH değeri: 7,4, 37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılan) hücreleri tekrar askıya alın. </li></ol></li><li> Numune hazırlama (kültürlenmiş mikro algler) <ol><li> Kültür mikro alglerini ve kültür ortamını ( örn., Deniz suyu, agar veya tatlı su) 1: 5 hacim oranında (mikro algler ila kültür ortamı) yeni cam kültür tüplerine (~ 15 mL) aktarın Yeni bir alt kültür ortamı. </li><li> Deneyden önce 72-120 saat boyunca açık / koyu (LD) döngüsüne (genelde LD 16: 8) göre flüoresan ampullerden yapay ışıkla sabit aydınlatma altında cam kültür tüplerini toz geçirmez bir odaya yerleştirin. </li><li> Alt kültürlü örnekleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve iyice karıştırın. </li></ol></li></ol> 2. ATOM Sistem Kurulumu Şekil 1: Bir ATOM Sisteminin Şeması. (A) bir zaman-gerilme modülüne ve ( b ) bir in-line optik yükselteç modülüne çok hızlı darbeler vermek için bir genişbant darbeli lazer kullanılır. Zaman streç modülü, her biri lazer kaynağının dalga boyu spektrumunun kopyası olan bir geçici dalga formu trenini üretir ( yani, dalga boyundan zaman eşleme). Amplifikatör modülü, darbe gerdirme (dağınık) kayıp telafisi için kullanılır. Gerilmiş darbe, ( c ) bir kırınım ızgarasıyla mekansal olarak dağılır ve tek bir dalga boyu bileşenleri bir röle merceği çifti tarafından iletilir ve objektif mercek tarafından akan hücredeki farklı konumlara ( d ) Mikroakışkan yonga. Bu, spektral kodlamanın işlemi.Spektral olarak kodlanmış ışık hücrenin başka bir objektif lensi ve bir aynadan geçerek, kırınım ızgarasına geri döndürülmesi ve uzamsal olarak dağınık olmayan bir atımlı ışın olarak rekombinasyonuna yol açacaktır. Bu resim kodlanmış darbeli ışın daha sonra ( E ) her iki kirişin elyafa bağlanmadan önce ( f ) bıçak kenarı ile zıt yönden kısmen bloke edildiği şekilde iki yola bölünürler. Bu iki kiriş, nihai görüntünün iki (ters) kodlanmış faz-gradyan kontrastını temsil eder. Her iki sinyal kontrastının aynı anda algılanması için, sinyallerden biri, ( g ) iki sinyalin zaman içinde çoğaltılması (araya sokulması) için bir zaman geciktirme hattından geçirilir. Veri toplama için yüksek hızda bir fotodetektör ve gerçek zamanlı osiloskop kullanılır. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55840/55840fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol><li> Zaman zaman<html> Tekrar test modülü <ol><li> 800-1,500 nm yakın kızıl ötesi (NIR) aralıkta tavsiye edilen bir merkez dalga boyuyla geniş bant femtosaniye (fs) veya piks (ps) darbeli lazer kaynağı kullanın. NOT: Tipik gerekli darbe genişliği, 100 fs&#39;den birkaç ps&#39;e kadar değişebilir. Darbeli lazer kaynaklarının ayrıntılı gereksinimleri Referans 4 ve 5&#39;de görülebilir. Önemli ölçümler Tablo 1&#39;de vurgulanır. <ol><li> Lazer kaynağının, ATOM&#39;da çok hızlı görüntülemeyi sağlamak için, megahertz rejiminde ( örn. Onlarca MHz) olması gereken yüksek bir tekrarlama oranına sahip olduğundan emin olun. Ayrıca, tepe çıkış lazer gücünü, fiber boşluğunun hasar gücü eşiğinin (yaklaşık 1 kW) çok altında ayarlayın. </li><li> Darbeli lazer kaynağının iyi çekim-zamanlı ve spektral kararlılığını sağlayın. NOT: Spektral genlik dalgalanmalarındaki tipik tolerans% 1.2 içinde tutulmalıdır 19 , 20 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 21, bu kurulumda elyaf mod kilitli lazer ile sağlanır. NOT: Lazer kaynağının optik bant genişliğinin 10-100 nm olması beklenir ve bu da tek hücreli görüntülemede yeterli görüş alanını (FOV) garanti etmek için önemlidir 21 . </li></ol></li><li> Bir fiber kolimatör vasıtasıyla, lazer darbeli demeti tekli mod dağınık optik elyaf ile birleştirir; buradaki darbeler, grup hız dağılımı (GVD) yoluyla gerilir ( Şekil 1a ). NOT: Bu, her darbenin spektrumunun sonra dalga boyu tarama dalga biçimi olarak ( yani, dalga boyu-zaman eşlemesi) eşleştirildiği süreçtir. NOT: Toplam gerekli GVD, ATOM görüntüsünün genel çözünürlüğünün dalga boyundan harcanma sürecinden etkilenmediğinden emin olmaya yeterli olmalıdır (Bkz. Tartışma). Tipik olarak, NIR aralığında GVD, 0.1 ns / nm&#39;nin çok ötesinde olmalıdır. Örneğin, bir tek-modlu elyaf,1,060 nm dalga boyu (toplam fiber uzunluğu 10 km) civarında 0,38 ns / nm toplam GVD sağlar. </li></ol></li><li> Spektral kodlama modülü <ol><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi mikroakışkan kanal boyunca akan hücrelerin spektrumu kodlanmış görüntülemesini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop sistemi oluşturun. NOT: Bu optik mikroskopun ana bileşenleri şunlardır: (1) bir kırınım ızgarası, bir teleskopik röle mercek modülü ( Şekil 1&#39;deki RL1 ve RL2) ve iki objektif lens ( Şekil 1&#39;deki Obj1 ve Obj2). <ol><li> İlk olarak, zaman-uzatılmış ve paralelleştirilmiş ışını, bir spektral duş oluşturmak için bir kırınım ızgarasına (bu düzenekte transmisyon tipi ızgaralı kullanılır) aydınlatın ( Şekil 1c ). NOT: Kırınımlı kirişin gücü ( yani, kırınım etkinliği), tLittrow konfigürasyonuna kapalı ızgaralı yönlendirme. </li><li> 4-f görüntüleme sisteminde iki röle mercekini (RL1 ve RL2) yapılandırın ( yani, kırınım ızgarasını RL1&#39;in odak düzlemine yerleştirin ve RL1 ve RL2&#39;yi odak uzaklıklarının toplamına eşit bir mesafeye ayırın.) Spektral duş Obj1 objektif objektifinin arka odak düzlemi üzerine görüntülenecektir). </li><li> Obj1&#39;in arka diyaframını doldurmak için spektral duşu dikkatli bir şekilde hizalayın, böylece spektral duş tahmin edilebilir ve mikroskopun görüntü düzlemine odaklanabilir. NOT: Burada, objektif lensin NA&#39;sı ( Şekil 1&#39;deki Obj1) 0.75&#39;tir. </li><li> Bu objektif lensin arka objektifinin (Obj2) benzer bir NA ve bir düzlem ayna ile başka objektif bir objektifi ( Şekil 1&#39;deki Obj2) yerleştirin, böylece spektral duş demeti görüntü düzlemini iki katına çıkaracak ve Kırınım ızgarası. </li><li> ayarlamak(Obj1 ve Obj2), odak düzlemleri birbirleriyle örtüşecek şekilde ayarlayın. Spektral duşun aynı konumda görüntü düzlemini iki kat fazla geçip geçmediğini ve aynı yolu izleyen ızgaraya dönüp dönmediğini kontrol edin. Değilse, optik sistemin daha fazla hizalamasını ve ayarını yapın. NOT: İade edilen ışık, ışığın bir asimetrik tespit modülüne iletilebileceği şekilde ek bir kiriş splitterinden geçmelidir. </li><li> Optik yükseltici kazancını uygun bir seviyede ayarlayın, böylece elde edilen sinyal, tipik olarak&gt; 10 dB olan iyi bir SNR&#39;ye sahip fotodedektör tarafından algılanabilir. </li><li> Mikroakışkan yonganın konumunu numune platformuna yerleştirin ve ayarlayın ve spektral duşun ve dolayısıyla görüntüleme alanının mikroakışkan kanal üzerine yerleştirildiğinden emin olun ( Şekil 1d ). NOT: Spektral duş, m içindeki akışkanların akış yönüne dik olarak aydınlatılırAkışkan hareketin otomatik olarak iki boyutlu (2D) taramaları gerçekleştirecek şekilde mikro-akışkan yonga. </li></ol></li></ol></li><li> Asimetrik tespit modülü <ol><li> Görüntülenmiş kodlanmış ışını ikiye ayırmak için ek bir ışın demetleyicisi yerleştirin ( Şekil 1e ). NOT: Her kiriş kopyası kısmen bir bıçak kenarı tarafından engellenir. </li><li> Kiriş bloğundan önce kirişin optik gücünü ölçün ve kaydedin. Ardından, bıçak kenarlarını elle (doğrusal bir çevirme aşamasına monte edilmiş) konumlandırın ve kirişin yarısını kabaca engelleyecek şekilde (görsel denetimle) konumlandırın. Bundan sonra, ışın gücünü izlemek için bıçak kenarlarının konumunu ışın boyunca tercüme ederek ince ayar yaparken optik güç ölçüm cihazını kullanın. NOT: Optimum konumun, gücün orijinal değerin ~% 50 oranında düştüğü yer olduğu önerilir ( örn . Engellenmiş durumda). Bu, görüntü sinyalinin en iyi kombinasyonunu sağlayan koşuldur.Güç ve görüntü kontrast geliştirme. </li><li> Başka bir kiriş yinelemesi için adım 2.3.2&#39;yi tekrarlayın. Bir kiriş için kısmi kiriş bloğunun yönünün diğer kirişe göre zıt olduğuna dikkat edin ( Şekil 1f ). </li><li> İki kısmen bloke edilmiş ışınları, iki fiberli kolimatörlerle iki ayrı, tek modlu elyaf koluna bağlayın. NOT: Kollardan birinde, diğer replika (gecikme çizgisi olmadan) için bir zaman geciktirmesi sağlamak için, fiber bazlı bir gecikme çizgisi görevi gören ekstra bir fiber uzunluğu vardır ( Şekil 1g ). Her ikisi de, foto-algılama öncesinde bir fiber birleştirici ile tek bir fibere yönlendirilir. Zaman gecikmesi, iki kopyayı geçici olarak ayırmak için yeterince uzun ve bir sonraki dalga biçimi ile zamansal örtüşmeyi önlemek için yeterince kısa olmalıdır (diğer bir deyişle, iki kopya, algılama öncesinde tek bir elyafta zamana bağlı ve zamanla çoğaltılmıştır ( Şekil 2a )). </li><li> kapakAlgılanan optik sinyalleri gerçek zamanlı osiloskop ile inceleyin ve sayısallaştırın. Osiloskopun bant genişliğinin ve dolayısıyla örnekleme oranının, nihai görüntü çözünürlüğünü etkilemediğinden emin olmak için yeterince yüksek olduğuna dikkat edin (Bkz. Tartışma). NOT: Burada, 0.38 ns / nm&#39;lik GVD&#39;de sırasıyla&gt; 20 GHz ve&gt; 40 GSa / s&#39;lik bir arka uç edinim bant genişliği ve örnekleme oranı gereklidir. </li></ol></li></ol> 3. Deneysel İşlemler <ol><li> Numune yükleme <ol><li> Standart bir hemositometre içinde klasik bir faz kontrast mikroskop altında hücre sayımı yapın. </li><li> Hücre yoğunluğunu 1x PBS (mikro algler için kaynak suyu ile) ile seyrelterek ayarlayın ve bir pipetle iyice karıştırın. NOT: Önerilen konsantrasyon 10 5 ila 10 6 hücre / mL arasındadır. </li><li> Mikroakışkan yongayı optik görüntüleme sisteminin numune platformuna takın. NOT: MikroakışkanÇip öncelikle polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılır ve standart kopya kalıplama yöntemi kullanılarak imal edilir. Mikroakışkan kanal, hücrelerin görüntüleme bölümünde tek bir dosyada (80 μm x 80 μm (yükseklik x genişlik) bir boyutla) yüksek hızda akabileceği şekilde atalet akışı odaklama etkisini yaratmak için asimetrik kavisli bir kanal ile tasarlanmıştır . </li><li> Yoğunluğa göre ayarlanmış hücre çözeltisini 10 mL şırıngaya aktarın. </li><li> Şırıngayı, mikroakışkan yonganın girişine ve bir santrifüj tüpünü, mikroakışkan yonganın çıkışına, atık toplama işlemi için bağlayın. </li><li> Şırıngayı bir şırınga pompasına monte edin ve arzu edilen çıktı vermek için ve hücreler ile kanal arasında aşırı kesme kuvvetinden kaçınmak için uygun bir akış hızı ayarlayın. NOT: Numunelerin doğrusal hızı, 0,5 ile 10 m / s arasında olmalıdır. Gerçek görüntü kaydından önce, sistemin daha da ince ayarlanması gerektiği konusunda unutmayın;Görüntü sinyali gücünü ve 2.2.1.4-2.2.1.6 adımlarını yineleyerek görüntü odaklamasını optimize etmek. </li></ol></li></ol> 4. Veri Toplama <ol><li> Her deney için kaydedilecek uygun veri noktası sayısını belirleyin. Kaydedilecek veri noktalarının sayısı, numunelerin boyutuna ve akış oranına bağlıdır. NOT: Genellikle, 80 GSa / s örnekleme oranı altında 8-16 milyon örnek noktaya ayarlanır. </li><li> Osiloskop kullanarak veriyi toplu modelden edinin ve kaydedin. </li></ol> 5. Arka Plan İşlemleri <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55840/55840fig2.jpg" /> Şekil 2: Atom Görüntülerinin Hat Tarama Zamanı İzinden Yeniden Yapılanması. Emilim kontrastı ve diferansiyel (yükseltilmiş) faz-gradyan kontrastı ile ATOM görüntülerini yeniden oluşturmak için, iki takım zaman-gerilmiş puls (bkz. Mor ve yeşil pulslar),( A ) Zamanla çoğaltılmış geçici dalga formu izi ve daha sonra dijital olarak parçalanmış ve iki ters faz-gradyan kontrastını gösteren iki 2D görüntüsü oluşturmak için istiflenmiştir. Lazer tekrarlama oranı tahmininde yuvarlama hatasından dolayı alt dizin kaymasını telafi ederek bozulma içermeyen görüntüleri oluşturmak için ( c ) bir kesme işlemine ihtiyaç duyulduğunu unutmayın. ( D ) ham çizgi taramasını lazer kaynağının spektral yoğunluk zarfından çıkararak, görüntülerin arka planı çıkarılabilir. ( G ) Bir absorpsiyon kontrast görüntüsü, görüntülerin ( e ) ve ( f ) bir piksel piksel yoğunluğu toplamı ile elde edilebilirken, ( h ) diferansiyel bir faz-gradyan kontrast görüntüsü, görüntülerin çıkarılmasından elde edilebilir (e ) Ve (f). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55840/55840fig2large.jpg" target="_blank">Daha büyük bir versiyonu görmek için lütfen tıklayınız.</a>Bu rakamın% <ol><li> Çevrimdışı görüntü yeniden yapılandırması için verileri osiloskoptan bilgisayara aktarın. NOT: Burada veriler taşınabilir bir sabit diskte saklanır ve osiloskop ile işlemci bilgisayarları arasında manuel olarak aktarılır. Her bir deney için sabit diskin kapasitesi 500 GB&#39;dan fazla olmalıdır. <ol><li> Çizgi taramalarını 2D görüntü oluşturmak için dijital olarak istiflemek için anahtar görüntü yeniden oluşturma yordamını kullanın ( Şekil 2 ). NOT: Özel program (MATLAB&#39;da), iki zaman çoklu veri kümesini ( Şekil 2&#39;deki mor ve yeşil dalga şekilleri) ayırarak iki asimetrik tespit görüntüsü üretir. <ol><li> İki asimetrik algılama görüntüsünün yoğunluklarını çıkararak diferansiyel bir faz-gradyan kontrast görüntüsü elde edin; Iki asimetrik tespit görüntüsünü ekleyerek bir emilim kontrast görüntü elde edilebilir. MCF-7 ve mikro yosunların seçilmiş görüntüleriniŞekil 3 . Tek tek görüntülerin arka plan profillerinin öncelikle ortadan kaldırılması ve bunların görüntü yoğunlaştırma ve çıkarma işlemlerinden önce yoğunluklarının normalleştirilmesi gerektiğini unutmayın. </li></ol></li><li> İleriki analizler için, görüntülerden türetilen, hücre hacmi, dairesellik ve emilim yoğunluğu, vb . Gibi parametrelerin bir kütüphanesi oluşturun. </li></ol></li><li> Veri kütüphanesini veri görselleştirme platformuna girin ( Şekil 4 ). <ol><li> Parametre kütüphanesini ve ilgili yeniden yapılandırılmış görüntüleri görselleştirme arabirim platformuna yükleyin. </li><li> Eksenleri, ilgilenilen parametreler olacak şekilde ayarlayın. NOT: Parametreler probleme özgüdür ve kullanıcı tarafından tanımlanır. MATLAB programı tarafından ATOM görüntülerinden türetilirler. Burada, hücrenin optik absorpsiyon yoğunluğu, hücre alanı, hücre hacmi ve hücre dairesiti seçime açıktır. </li&gt; <li> Görüntülenecek veri kümesini seçin, böylece her hücre görüntüsü dağılım grafiğinde farklı bir veri noktası olarak görüntülenebilir. </li><li> Fare işaretçisini her noktaya taşıyın, böylece karşılık gelen görüntü ve diğer parametreler kayan bir alt pencerede gösterilir. NOT: Eksenler doğrusal ve logaritmik ölçekler arasında interaktif bir şekilde değiştirilebilir. </li><li> Veri setinin herhangi bir alt kümesinin dağılım grafiğini manuel olarak kontrol ederek daha fazla analiz edin. NOT: Kapatılan alt kümenin her parametresindeki histogram, kütüphanenin tamamına göre hizalanabilir. Ayrı histogramlar başka bir kayan alt pencerede görüntülenir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K., Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. , 23-45 (2016).</li><li>Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+time-encoded+amplified+imaging+for+real-time+observation+of+fast+dynamic+phenomena.">Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena.</a> Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).</li><li>Goda, K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersive+Fourier+transformation+for+fast+continuous+single-shot+measurements.">Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements.</a> Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).</li><li>Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optofluidic+time-stretch+imaging+-+an+emerging+tool+for+high-throughput+imaging+flow+cytometry.">Optofluidic time-stretch imaging - an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry.</a> Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).</li><li>Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Time+Stretch+for+High-Speed+and+High-Throughput+Imaging+-+From+Single-Cell+to+Tissue-Wide+Scales.">Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging - From Single-Cell to Tissue-Wide Scales.</a> IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).</li><li>Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+time-stretch+imaging:+Principles+and+applications.">Optical time-stretch imaging: Principles and applications.</a> Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).</li><li>Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+time-stretch+imaging:+Principles+and+applications.">Optical time-stretch imaging: Principles and applications.</a> Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).</li><li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer.">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li><li>Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+amplified+dispersive+Fourier+transformation.">Theory of amplified dispersive Fourier transformation.</a> Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).</li><li>Goda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-microparticle+imaging+flow+analyzer.">High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).</li><li>Lai, Q. T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+time-stretch+imaging+flow+cytometry+for+multi-class+classification+of+phytoplankton.">High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton.</a> Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).</li><li>Chen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Learning+in+Label-free+Cell+Classification.">Deep Learning in Label-free Cell Classification.</a> Sci Rep. 6, 21471 (2016).</li><li>Fard, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomarski+serial+time-encoded+amplified+microscopy+for+high-speed+contrast-enhanced+imaging+of+transparent+media.">Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media.</a> Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).</li><li>Lau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+time-stretch+microscopy+for+ultrafast+quantitative+cellular+and+tissue+imaging+at+1+mum.">Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum.</a> J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).</li><li>Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+high-throughput+cell+screening+in+flow.">Label-free high-throughput cell screening in flow.</a> Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).</li><li>Wong, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric-detection+time-stretch+optical+microscopy+(ATOM)+for+ultrafast+high-contrast+cellular+imaging+in+flow.">Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow.</a> Sci Rep. 4, 3656 (2014).</li><li>Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microalgae+for+biodiesel+production+and+other+applications:+A+review.">Microalgae for biodiesel production and other applications: A review.</a> Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).</li><li>Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+biodiversity+patterns+of+marine+phytoplankton+and+zooplankton.">Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton.</a> Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).</li><li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+Laser+Source+for+High+Frame-Rate+Optical+Time-Stretch+Microscopy+at+1.0+&#181;m.">Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 &#181;m.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).</li><li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breathing+laser+as+an+inertia-free+swept+source+for+high-quality+ultrafast+optical+bioimaging.">Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging.</a> Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).</li><li>Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+measurements+of+optical+spectral+coherence+by+single-shot+time-stretch+interferometry.">Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry.</a> Sci Rep. 6, 27937 (2016).</li><li>Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+serial+time-encoded+amplified+microscope.">Performance of serial time-encoded amplified microscope.</a> Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).</li><li>Alix-Panabi&#232;res, C., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+circulating+tumour+cell+research.">Challenges in circulating tumour cell research.</a> Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+counting+tumor+cells.">Beyond counting tumor cells.</a> Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).</li><li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer.">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).</li><li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+focusing+for+tumor+antigen-dependent+and+-independent+sorting+of+rare+circulating+tumor+cells.">Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells.</a> Sci Transl Med. 5 (179), (2013).</li><li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces.">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Scientific Reports. 3, 1259 (2013).</li><li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples.">marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).</li><li>Krebs, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+circulating+tumour+cells-biology+and+biomarkers.">Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers.</a> Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+Laser-Scanning+Time-Stretch+Imaging+at+Visible+Wavelengths.">Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths.</a> Light Sci Appl. , (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

ATOM sistem kurulumu sırasında özel dikkat gerektiren çeşitli teknik ayrıntılar vardır. Birincisi, asimetrik / eğik spektrumla kodlanmış aydınlatmanın emilim kontrastında kalıcı faz-gradyan bileşenleri ( örn., Gölgeleme efekti) oluşturabileceğini ve ATOM&#39;daki faz-gradyan kontrast maddenin arttırılmasını etkileyebileceğini unutmamak gerekir. Dolayısıyla oblik aydınlatmanın bu etkisi en aza indirilmelidir. İkincisi, iki çoğaltmanın içerdiği zaman çoğullama veya zaman ara yerleştirme şemasının, görüntüleme hızında önemli bir uzlaşmaya yol açmadığı ( yani, &gt; MHz&#39;in çizgi tarama hızı hala korunabilmektedir), şu şekilde ifade edilmelidir: toplam geçici genişlik Iki tarama çoğaltmasının bir satır tarama periyodunu aşmadığı. Üçüncüsü, dağınık fiber ve amplifikatörlerin entegre modülünün en uygun konfigürasyonu, mevcut amplifikatörlerin spesifikasyonu olarak hedeflenen kazanıma bağlıdır. Optik yükseltme özündeGVD 22 ile ilişkili optik kayıplarla mücadele etmek için zamana bağlı streç süreci. Prensip olarak, elyaf bazlı, zamana bağlı streç prosesi ile uyumlu olacak şekilde tercihen fiber formatında herhangi bir optik amplifikatör tipi ile uygulanabilir ( Şekil 1b ). Optik elyaf tabanlı optik yükselteçlerin pratik örnekleri, ~ 1.500-1.600 nm çalışma dalgaboyları için EDFA, ~ 1106 nm çalışma dalga boyları için YDTA katkılı fiber amplifikatörler, Ve fiber optik parametrik amplifikatörler (FOPA, herhangi bir çalışma dalga boyu için, prensip olarak, bir pompa lazer kaynağı mevcut olduğu sürece). Amplifikatör gürültüsü de modül tasarımında dikkatle düşünülmelidir. Ayrıntılı teori, Referans 8&#39;de görülebilir. Ortak bir konfigürasyon, çoklu dağınık fiber bölümleri arasına yerleştirilen çok katlı / kademeli fiber amplifikatörleri içerebilir (her biri birkaç km uzunluğundadır). ATOM a içinGenel olarak zaman-uzatmalı görüntüleme, tipik açma-kapama optik güç kazancı 20-30 dB civarında olmalıdır. İşlem dalga boyu aralığının tipik olarak, daha kısa dalga boylarında ( ör . Görünür dalga boylarında) aşırı derecede yüksek optik fiber kaybına bağlı olarak ~ 800-1.550 nm ile sınırlandırıldığına dikkat edilmelidir. Bu nedenle, zaman-gerilme görüntüleme gösterimlerinin çoğuna benzer şekilde, fiber tabanlı ATOM, görünür ışık işlemlerinin halen yaygın olduğu flüoresan görüntülemeye hemen uygulanmayacaktır. Bununla birlikte, ATOM&#39;da ultra-hızlı lazer tarayıcı görüntüleme ve floresan görüntüleme için son zamanlarda, serbest uzayda açısal-çalkantıya duyarlı gecikme (FACED) olarak adlandırılan, zaman-gerilimi andıran boş alan darbe-gerdirme kavramının kullanıldığını not edin Görünür dalga boylarında 30 . İnce tasarımı dikkate alması gereken bir diğer önemli parametre ise görüntü çözünürlüğüdür. Klasik ışık mikroskopisinin aksine, görüntüATOM çözünürlüğü ve spektral duş ekseni boyunca genel zaman-uzatma görüntüleme üç sınırlama rejimi 22 tarafından yönetilmektedir: (i) uzaysal dağılım-sınırlı çözünürlük, ışınım ızgarasının spektral çözünürlüğü ile ilişkilidir, δ x uzamsal ; (Ii) GVD 22&#39;nin kareköküyle ters terazi gösteren dalga boyu-zaman eşleştirme işleminin δ x SPA belirsizliği olarak tanımlanan durağan fazlı yaklaşım sınırı; Ve (iii) son uzaysal çözünürlüğü de etkileyebilen foto-detektörün sonlu bant genişliğini tanımlayan foto-detektör-sınırlı çözünürlük δ x det . Genel olarak, bu üç parametredeki en büyük değer ATOM&#39;un görüntü çözünürlüğü, δ x ( yani δ x = max { δ x uzamsı , δ <em&gt; X SPA , δ x det }). Nihai çözünürlüğün mekansal dağılımla sınırlı olduğunu ( yani, δ x = δ x uzaysal &gt; δ x SPA &gt; δ x det ) emin olmak istenir. Bu nedenle, fotodetektörün hem GVD&#39;sinin (basamak 2.2.1.1) hem de bant genişliğinin (basamak 2.3.5) bu durumu sağlamak için yeterince yüksek olması gerekir. Öte yandan, akış yönündeki görüntü çözünürlüğü kırınım sınırı ile değerlendirilir. Bu, yalnızca Nyquist&#39;in örnekleme koşulu yerine getirildiğinde geçerlidir ( yani, lazer tekrar hızı (R, Hz) ve hücrelerin akış hızı (F, m / s olarak), piksel boyutu Akış yönü F / R &lt;2 δ y, burada δ y akış yönü boyunca difraksiyona sınırlı çözünürlüktür). Izgaranın özelliklerinin ( örn., &lt;/ Em&gt; oluk yoğunluğu) ve objektif lens ( örneğin, sayısal diyafram açıklığı (NA)) hedeflenen çözünürlüğü karşılamak üzere dikkatlice tasarlanmalıdır. Mevcut ATOM gösterisi ve protokolü, veri toplamanın osiloskop ile gerçekleştirildiğini ve veri işlemenin çevrimdışı izlendiğini gösterirken, gerçek zamanlı, sürekli veri toplama, işleme ve hatta analiz yeteneğini kullanarak elde etmeyi daha uygun buluyor. ATOM tarafından getirilen çok hızlı ve yüksek kontrastlı görüntü yakalama yetenekleri. Bu amaçla, grafik işlemci birimi (GPU) ve / veya alan programlanabilir kapı dizisi (FPGA) gibi yüksek performanslı ve yüksek verimli bir sinyal işleme birimi benimsenmelidir ve bu yetenekler şunları içerir: ~ 1-10 GB / s gibi yüksek bir veri işleme kapasitesi elde edin. Bu, ATOM&#39;un çok hızlı örnekleme kabiliyeti ile ( yani ~ 10 GSa / s) uyumludur. ATOM ve yüksek verimli bir veri işleme a entegrasyonuCcelerator, veri ile yönlendirilen biyolojik araştırmalarda, özellikle de muazzam bir nüfustaki farklı tek hücreler arasındaki bilinmeyen heterojenliğin çözümünde yeni bir paradigmayı mümkün kılmaktadır. Bu tür teknoloji, hastalık sürecindeki nadir, anormal hücrelerin etiketsiz bir şekilde nicelleştirilebildiği yeni nesil klinik araştırmalarını da güçlendirebilir.

Optik görüntüleme, birçok hücresel / subselüler bileşenin detaylı mekansal dağılımını (neredeyse) non-invaziv olarak görselleştirmek için güçlü bir araç ve hücre tabanlı tahlil sunar ve böylece hücrelerin morfolojik, biyofiziksel ve biyomoleküler imzalarını açığa çıkartır. Bununla birlikte, tek hücrelerden yüksek içerikli bilgi çıkarabilme kabiliyeti, muazzam ve heterojen bir hücre popülasyonunun araştırılması gerektiği zaman genellikle tehlikeye atılmıştır. Bu durum, ölçüm çıktısı ve içerik arasındaki hücre tabanlı tahlillerde ortak bir dengeyi işaret eder. Dikkat çekici bir örnek, akış sitometrisine görüntüleme kapasitesinin eklenmesinin, klasik olmayan görüntüleme akış sitometrelerine kıyasla en az 1-2 sıra büyüklüğünde bir işlemin aşağı ölçeklendirilmesine neden olmasıdır. Standart akış sitometreleri 1 ile mümkün olmayan karmaşık morfolojik tek hücreli analiz sunabileceği halde, görüntüleme akış sitometrisi genellikle id için yeterli verimlilikten yoksundurYüksek istatistiksel güvenle hücresel heterojenliği sağlayın. Bu, biyolojide yeni buluşlar için ve hastalıkların patogenezini anlamak için gereklidir. Temel teknik zorluk, yaygın optik görüntüleme stratejileri tarafından verilen doğal hız sınırında yatmaktadır: lazer ışını taraması, ( örneğin, galvanometrik aynalar ile) ve / veya görüntü sensörleri ( örneğin, yük bağlı cihaz (CCD) ve tamamlayıcı metal- Oksit yarı iletken (CMOS)). Lazer tarama hızı esas olarak tarama aynalarının mekanik ataletiyle sınırlanırken, CCD veya CMOS çerçeve hızı, görüntüleme hızı ve hassaslık arasındaki temel dengelenme ile sınırlandırılır ( yani, kare hızı arttıkça azaltılmış sinyal algılama hassasiyeti Ve tam tersi). Tümüyle optik, ultra hızlı görüntü kodlama mekanizmasına dayanan optik zaman-gerilme görüntüleme, yüksek verimli görüntüleme akış siteleri için çekici bir platform olarak gösterilmiştirOmetreler, geleneksel görüntü sensörlerine veya mekanik lazer taramasına gerek kalmadan 2 , 3 . Zaman-gerilme görüntüleme çalışma prensibinin ayrıntılı açıklamaları referans 4 , 5 , 6 , 7&#39;de bulunabilir . Kısaca, iki değiştirilebilir haritalama adımından oluşur: (i) görüntü numunesinin uzamsal koordinatlarının, ışık saçan kirişin 8 , 9 , ve 10&#39;un spektrumu boyunca farklı dalga boylarına eşlendiği spektrum kodlaması (dalga boyu-alan haritalaması) Ve (ii) tekli lazer darbelerinin dalga boyu bileşenleri, grup hız dağılımı (GVD) vasıtasıyla zamansal (dalga boyu taramalı) dalga biçimlerine dönüştürülen (gerdirilmiş) bir dispersif Fourier dönüşümü (dalga boyu zaman eşlemesi) 9 ( Şekil 1 ). Önemli birZaman-germe görüntüleme özelliği, ultra-hızlı fotodeteksiyon ve GVD kaybına bağlı olarak duyarlılık kaybıyla mücadelede kritik bir rol oynayan ve böylece foto-detektör gürültüsü 9 tarafından kontamine olmadan görüntü sinyal-gürültü oranını (SNR) arttıran optik amplifikasyon . Her bir lazer palsı, hücrelerin tek yönlü akışına dik olan görüntülenen örneğin bir çizgi taramasını kodladığından, etkili bir çizgi tarama hızı, tipik olarak 10 MHz&#39;in ötesinde olan lazer tekrar hızı ile belirlenir. Bu çok hızlı işlem, 10.000.000 hücre / s&#39;lik bir işleme ( ör . Geleneksel görüntüleme akış sitometrisinden 10-100 kat daha yüksek) ile bulanık olmayan, tek hücreli görüntü yakalama imkanı sağlar. Sonuç olarak, zaman-gerilimli görüntüleme, yüksek hacimli, tek hücreli, görüntü tabanlı taramada, özellikle bilinmeyen bir heterojenite veya nadir bulunan / sapmış hücreleri önemli bir nüfusta (binlerce ila milyonlarca cel<html> Ls), nadir kanser hücresi taraması 10 veya mikro yosun sınıflaması 11 gibi . Süre uzatmalı görüntüleme çoğunlukla, 2 , 3 , 9 , 10 , 11 hücrelerinden gelen ışık saçılması ve emilimi ile görüntü kontrastının üretildiği parlak alan (BF) görüntü yakalama özelliğini kullanır. Bu gibi etiketsiz, tek hücreli görüntüleme yetenekleri, sitotoksisite ve photobleaching gibi floresan etiketlerle bağlantılı zararlı etkileri atlayabilir ve yine de hücresel ve alt hücresel doku ve morfolojiye dayanan tekli hücre analizi için değerli bilgiler sağlayabilir. Bu etiketsiz parametrelerin, özellikle muazzam bir hücre popülasyonu olduğunda, hücrelerin derin görüntü sınıflandırması için etkili olduğu kanıtlanmıştır 11 ,&quot;Xref&quot;&gt; 12. Bununla birlikte, birçok durumda, BF görüntüleme, etiketsiz şeffaf hücrelerin ayrıntılı morfolojisini ortaya çıkarmak için yeterli kontrast sağlamaz. 13 , 14 ve 15 numaralı çok hızlı kare hızlarında görüntü kontrastını arttırmak için farklı etiketsiz, faz kontrastlı, zaman gergin görüntüleme yöntemleri geliştirildi. Bu teknikler arasında, Schlieren fotoğrafçılığına benzer bir konsepte dayalı faz-gradyan (diferansiyel-parazit-kontrast- (DIC) benzeri) kontrastı ortaya çıkarmak için asimetrik tespit zaman-streç optik mikroskopi (ATOM) geliştirildi ve etiket- (10 m / s&#39;ye kadar) çok hücreli, yüksek kontrastlı görüntüleme 16 . Bu etki, görüntü kodlamalı kiriş yolunu kısmen bloke ederek veya fotodeteksiyon öncesi kirişi eğmek suretiyle eğik tespit veya aydınlatma yoluyla kolayca üretilebilir. ATOM&#39;un diğer bir avantajı daZıt yöndeki iki faz-gradyan kontrastını eşzamanlı olarak elde etmek için çok yönlülüğü sağlar. İki zıt kontrastlı görüntünün yoğunluk çıkarma ve toplamı, aynı çizgi taramasından sırasıyla diferansiyel faz-gradyan kontrastını ve absorpsiyon kontrastını verir. Bu çalışma ATOM&#39;un optik kurulum, örnek hazırlama ve veri toplama ve görüntüleme dahil olmak üzere uygulanmasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Özellikle, bu çalışma insan kan hücrelerinin, kanser hücrelerinin ve fitoplanktonun (mikroalgler) tek hücre görüntülemesi ile ATOM işlemini gösterir. Bu, ATOM&#39;un yalnızca biyomedikal alanda değil aynı zamanda deniz ve biyoyakıt araştırmasında 17 , 18 görüntüleme akış sitometrisine uygulanabilirliğini vurgular.

<table><tbody><tr><td>Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X</td><td>Nikon</td><td>MRF07420</td><td>Objective lens (Obj2)</td></tr><tr><td>Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X</td><td>Olympus</td><td>RMS40X-PF</td><td>Objective lens (Obj1)</td></tr><tr><td>N-BK7 Plano-Convex Lenses</td><td>Thorlabs</td><td>LA1145-C</td><td>For relaying spectral shower</td></tr><tr><td>FC/APC Fiber Collimation Package</td><td>Thorlabs</td><td>F220APC-1064</td><td>For outputing and collecting laser pulses</td></tr><tr><td>Pellicle beamsplitter</td><td>Thorlabs</td><td>BP145B3</td><td>For making beam replica</td></tr><tr><td>Protected silver mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>For reflecting light</td></tr><tr><td>800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver</td><td>Newport</td><td>1544-B</td><td>For converting light into electrical signal</td></tr><tr><td>Infiniium High-Performance Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSOX91604A</td><td>To save the light-converted electrical signals</td></tr><tr><td>HI1060 optical fiber</td><td>Corning</td><td>HI1060</td><td>Optical fiber for time-stretch</td></tr><tr><td>YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER</td><td>Keopsys</td><td>KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA</td><td>Optical in-line amplifier</td></tr><tr><td>Holographic grating</td><td>Wasatch Photonics</td><td>020305-6</td><td>Grating</td></tr><tr><td>Infuse/Withdraw Syringe Pumps</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PHD 2000</td><td>Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels</td></tr></tbody></table>

microfluidic imaging flow cytometry by asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (atom)

Çok boyutlu veri analizine ve dolayısıyla daha yüksek güvenlikte istatistiksel sonuçlara izin veren ölçülebilir parametrelerin sayısının ölçeklendirilmesi, akış sitometrisinin gelişmiş gelişiminde ana eğilim olmuştur. Özellikle, yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleri eklenmesi, hücresel / alt hücreli yapıların karmaşık morfolojik analizine olanak tanır. Standart akış sitometrelerinde bu mümkün değildir. Bununla birlikte, hücresel işlevler hakkındaki bilgilerimizi geliştirmek için değerlidir ve yaşam bilimi araştırması, klinik teşhis ve çevresel izlemeden yararlanabilir. Görüntüleme özelliklerini akış sitometrisine dahil etmek, öncelikle kamera teknolojilerinde hız ve hassaslık sınırlamaları nedeniyle tahlil çıktısını tehlikeye atmaktadır. Görüntü kalitesini korurken, görüntüleme akış sitometrisi ile karşılaşan bu hız veya verim sorunu üstesinden gelmek için, asimetrik tespit zaman streç optik mikroskopi (ATOM), yüksek kontrastlı, tek hücreli imgeleri etkinleştirmek için gösterilmiştir100.000 hücre / s&#39;ye kadar yüksek bir görüntüleme kapasitesinde, alt hücresel çözünürlük ile görüntüler. ATOM, çok-hızlı genişbant lazer atımlarının kullanımı ile tüm optik görüntü kodlama ve alımına dayanan geleneksel zaman-gerilme görüntüleme konsepti temelinde, etiketlenmemiş / lekelenmemiş hücrelerin görüntü kontrastını arttırarak görüntü performansını artırıyor. Bu, spektral olarak tek atış genişbant darbelerine kodlanmış hücrelerin faz-gradyan bilgisine erişerek sağlanır. Bu nedenle, ATOM, hücre tipleri, durumları ve hatta işlevleri gösteren tek hücreli morfolojinin ve doku bilgilerinin yüksek verimli ölçümlerinde özellikle avantajlıdır. Sonuç olarak, bu, hücrelerin biyofiziksel fenotiplendirme için güçlü bir görüntüleme akış sitometri platformu haline gelebilir ve mevcut en son biyokimyasal işaretleyici tabanlı hücresel testi tamamlayabilir. Bu çalışma bir ATOM sisteminin temel modüllerini oluşturmak için bir protokolü tanımlamaktadır (optik ön uçtan veri p&#39;yeIşleme ve görselleştirme arka plandaki) yanı sıra örnek olarak insan hücreleri ve mikro algler kullanılarak ATOM&#39;a dayalı görüntüleme akış sitometrisinin iş akışı.

<html> Bu çalışma ATOM tarafından memeli hücreleriyle (insan periferik kan mononükleer hücre s (PBMC) ve meme kanseri hücreleri (MCF-7)) ve fitoplankton (Scenedesmus ve Chlamydomonas) olan iki tek hücreli görüntüleme gösterimini göstermektedir. İlk deney, kandaki dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC&#39;lerin) tespiti, sayımı ve karakterizasyonu için sıvı biyopside artan ilgiden dolayı motive oldu. Primer tümör bölgelerinden kan dolaşımına yayılmış CTC&#39;leri ölçme özelliği, metastatik kanser progresyonunun incelenmesine olanak tanır 24 , 25 . Bununla birlikte, CTC analizinde zorluklar bulunmaktadır: (i) CTC sayısı, tam kandaki fıstık miktardaki kan hücrelerinden önemli ölçüde daha düşüktür. CTC&#39;leri belirlemek ve iyileştirmek için güncel yöntemler çoğunlukla hücre zenginleştirme ve ayırma adımlarını içerir<html> Class = &quot;xref&quot;&gt; 26 , 27 , 28 . Bununla birlikte, kan hücrelerinden kaynaklanan kirli arka plan ve / veya zenginleştirilmiş CTC&#39;lerin canlılığı, sonraki molekül analizleri ( örn., RNA dizilemesi) için bir endişe olarak kalmaya devam etmektedir29. (Ii) CTC&#39;ler hem biyofiziksel hem de biyomoleküler işaretler bakımından son derece heterojen olup, CTC zenginleştirme ve saptama verimliliğini sınırlar. Bu amaçla, yüksek görüntüleme kapasitesine sahip etiketsiz görüntüleme akış sitometrisi, muazzam bir kan hücresi popülasyonunda CTC&#39;lerin doğrudan görüntülenmesine ve tanımlanmasına olanak tanıyan, zenginleştirme adımlarını asgariye indiren veya hatta atlayan çekici bir araçtır. İkinci deney, özellikle çevre bilimlerindeki ilerlemeleri etkileyebilecek büyük ölçekli fitoplankton karakterizasyonu ile ilgilidir ( örneğin, zararlı algal bloom (HAB) türlerinin tespitiS = &quot;xref&quot;&gt; 29 ve mikroalgal türlerin yenilenebilir biyodizel kaynakları olarak tanımlanması). ATOM tarafından etkinleştirilen, yüksek verimli ve yüksek kontrastlı tek hücreli fitoplankton görüntüleme kabiliyeti, farklı cins ve türler arasındaki büyüklük, doku ve morfolojideki heterojenliği açığa çıkarmak için değerli olabilir. Şekil 3 , ATOM tarafından yakalanan mikroalgler, Scenedesmus ve Chlamydomonas (~ 2 m / s&#39;lik bir hızda akan) yanı sıra memeli hücrelerinin, MCF-7&#39;nin ve PBMC&#39;nin (~ 10 m / s&#39;lik bir hızda akan) görüntülerini göstermektedir . Dört durumda da iki ters faz-gradyan kontrastı, zamanla çoğaltılan, asimetrik olarak tespit edilen sinyallerle elde edildi (2.3. Adımda açıklanmıştır). Her ikisi de, her biri karşılıklı iki gölgelendirme yönelimi gösteren DIC görüntüsüne benzeyen, sözde üç boyutlu bir görünüm sergilerler ( Şekil 3a&#39;daki sütun 1 ve 2) <stroNg&gt; -d). Piksel yönündeki yoğunluk toplamını ve bu iki karşıt kontrast ATOM görüntüsünün farkını değerlendirirken, aynı anda iki ek ATOM kontrastı elde etmek mümkündür ( ör . Emme-yalnızca ve arttırılmış diferansiyel faz-gradyan kontrastları, Şekil 3a&#39;daki sütun 3 ve 4 -d ). Etiketsiz ATOM bulanık olmayan tek hücreli görüntüleri ortaya çıkarmakla kalmaz, ayrıca yüksek kontrastlı hücresel yapıları karakterize eder. Özellikle, mikro alglerdeki vakuoller, pirenoit ve flamotella Şekil 3&#39;de açıkça görülebilir. Bu görüntüleme özelliği, otomatik resim bazlı sınıflandırma için içsel hücresel ve alt hücresel doku / morfolojilerden türetilen zengin tanımlayıcı setinin çıkarılmasını eleştirel bir şekilde sağlar. Bu çalışma, hücre daireselliği ve hücre boyutu gibi biyofiziksel özelliklerin,<html> R MCF-7 ve PBMC&#39;nin sınıflandırılması. MCF-7 örneğinde iki kümenin görüldüğüne dikkat edin. Tüm veri noktaları için yüksek kontrastlı görüntülerin bulunması, kümelerden birinin parçalara / pisliğe tekabül ettiğini incelememizi sağlar ( Şekil 4a ). ATOM görüntülerine dayanan iki tip fitoplankton arasındaki benzer bir sınıflandırma da gerçekleştirildi. Burada, sınıflandırma sonuçları, özelleştirilmiş kullanıcı arabirimi tarafından görselleştirilen 2D dağılım çiziminin bir formunda sunulmaktadır ( Şekil 4 ). Her bir hücreye karşılık gelen dağılım çizimindeki her ek açıklanmış veri noktası, ATOM&#39;dan türetilmiş farklı parametrelerle daha ayrıntılı olarak incelenebilir. İlgili ATOM görüntüsü doğrudan arsa üzerinde etkileşimli olarak görüntülenebilir. Daha fazla sınıflandırma ve analiz yapılmasını kolaylaştırmak için bu görselleştirme arayüzünde manuel kapılar da desteklenmektedir. Iles / ftp_upload / 55840 / 55840fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: Ultra-Hızlı Akan Hızda (~ 2-10 m / s) Mikro yosun ve Memeli Hücrelerinin ATOM Görüntü Gamı. ( A ) Scenedesmus; ( B ) Chlamydomonas; ( C ) meme kanseri hücreleri, MCF-7; Ve ( d ) insan PBMC&#39;si. Scenedesmus ve Chlamydomonas ~ 2 m / s&#39;de akarken, MCF-7 ve PBMC 10 m / s&#39;de akıtılır. Her bir hücre tipi için sol iki sütun (sütun 1 ve 2) iki ters faz-gradyan kontrastını temsil eder. Sütun 3 ve 4 sırasıyla emme kontrastı ve diferansiyel (gelişmiş) faz-gradyan kontrastı temsil etmektedir. Ölçek çubukları = 20 μm (kırmızı renkte). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55840/55840fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55840/55840fig4.jpg" /> FiGure 4: ATOM Görüntülerine Dayalı Sitometrik Analiz için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü. Bu arayüzde, kullanıcı, ATOM görüntülerinden türetilen farklı hücre parametrelerini ( örn. Hücre boyutu, dairesellik, emilim yoğunluğu, vb. ) Tanımlayarak hücre tipi sınıflandırma ve analiz gerçekleştirebilir. Sonuç, orta panelde görüntülenen dağılım çiziminde gösterilebilir. X ve y ekseni (X ve Y ekseni parametre düğmeleri) için parametrelerin ve ölçeklendirmenin değiştirilmesi ve veri kümeleri (Veri Kümesi düğmesi) arasında geçiş yapılması da dahil çeşitli ekran seçeneklerine erişmek ve denetlemek mümkündür. Ayrıntılı hücre bilgisi (Hücre bilgileri sekmesi), belirli bir veri noktasının üzerine gelmek suretiyle okunabilir. Hızlı gezinmeyi etkinleştirmek için kullanıcı başka bir görüntüleme moduna geçebilir ve aynı anda dağılım plakasındaki tüm görüntüleri orta panelde görüntüleyebilir (İzleme modları düğmesi). Daha ileri analiz için manuel geçitleme de yapılabilir. Sarı veri noktaları MCF-7 hücre örneğini temsil etmektedir (in ( a &lt;/ Strong&gt;) ve Scenedesmus (SCE) (in ( b )), kırmızı veri noktaları insan PBMC örneğini ((a)) ve Chlamydomonas (CHA) (b) &#39;yi temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55840/55840fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM at JoVE.com

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır.

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

microfluidic-imaging-flow-cytometry-asymmetric-detection-time-stretch

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Engineering

Unit 1

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Operational Amplifiers

SCIENTISTS IN ACTION

10.2K Görüntüleme.  The University of Hong Kong.  Bu protokol, ultrafast mikroakışkan akışta tek hücreli görüntüleme için asimetrik tespit zamanlı streç optik mikroskopi sisteminin uygulanmasını ve görüntüleme akış sitometrisi uygulamalarını anlatmaktadır. 

Video: Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

Birden Farklı Suşlarının incelenmesi için bir mikroakışkan Cihazı

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general relatively bulky and costly, making them less effective in the resource limited settings. To potentially address these limitations, we have recently demonstrated the integration of wide-field fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on cell-phones using compact, light-weight, and cost-effective opto-fluidic attachments. In our flow cytometry design, fluorescently labeled cells are flushed through a microfluidic channel that is positioned above the existing cell-phone camera unit. Battery powered light-emitting diodes (LEDs) are butt-coupled to the side of this microfluidic chip, which effectively acts as a multi-mode slab waveguide, where the excitation light is guided to uniformly excite the fluorescent targets. The cell-phone camera records a time lapse movie of the fluorescent cells flowing through the microfluidic channel, where the digital frames of this movie are processed to count the number of the labeled cells within the target solution of interest. Using a similar opto-fluidic design, we can also image these fluorescently labeled cells in static mode by e.g. sandwiching the fluorescent particles between two glass slides and capturing their fluorescent images using the cell-phone camera, which can achieve a spatial resolution of e.g. ~ 10 &mu;m over a very large field-of-view of ~ 81 mm2. This cell-phone based fluorescent imaging flow cytometry and microscopy platform might be useful especially in resource limited settings, for e.g. counting of CD4+ T cells toward monitoring of HIV+ patients or for detection of water-borne parasites in drinking water.

We review our recent results on the integration of fluorescent microscopy and imaging flow cytometry tools on a cell-phone using compact and cost-effective opto-fluidic attachments. These cell-phone based micro-analysis devices might be useful for cytometric analysis, such as performing various cell counting tasks as well as for high-throughput screening of e.g., water samples in resource limited settings.

Bir Cep telefonu ile ilgili Geniş alan Floresan Mikroskopi ve Floresan Görüntüleme Flow Sitometri

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as hydrodynamics, ecology and environmental engineering. Modeling bacterial transport in porous environments at different spatial scales is critical to better predict the consequences of bacterial transport, yet current models often fail to up-scale from laboratory to field conditions. Here, we introduce experimental tools to study bacterial transport in porous media at two spatial scales. The aim of these tools is to obtain macroscopic observables (such as breakthrough curves or deposition profiles) of bacteria injected into transparent porous matrices. At the small scale (10-1000 &#181;m), microfluidic devices are combined with optical video-microscopy and image processing to obtain breakthrough curves and, at the same time, to track individual bacterial cells at the pore scale. At larger scale, flow cytometry is combined with a self-made robotic dispenser to obtain breakthrough curves. We illustrate the utility of these tools to better understand how bacteria are transported in complex porous media such as the hyporheic zone of streams. As these tools provide simultaneous measurements across scales, they pave the way for mechanism-based models, critically important for upscaling. Application of these tools may not only contribute to the development of novel bioremediation applications but also shed new light on the ecological strategies of microorganisms colonizing porous substrates.

Breakthrough curves (BTCs) are efficient tools to study the transport of bacteria in porous media. Here we introduce tools based on fluidic devices in combination with microscopy and flow cytometric counting to obtain BTCs.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

Çevre

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

Manyetik Nanopartikül Bazlı İmmünoassaylar için Kademeli Bir Kısıtlama ile Mikroakışkan Akrilik Cihazın Bilgisayar Sayısal Kontrol Mikrofrezelenmesi

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

Mühendislik

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Biyokimya

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, appearance of defects in microcirculation can be a primary indicator in the development of multiple pathologies. Advances in optical imaging have made intravital microscopy (IVM) a practical approach, permitting imaging at the cellular and subcellular level in live animals at high-speed over time. Yet, despite the importance of maintaining adequate tissue perfusion, spatial and temporal variability in capillary flow is seldom documented. In the standard approach, a small number of capillary segments are chosen for imaging over a limited time. To comprehensively quantify capillary flow in an unbiased way we developed Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow (STAFF), a macro for FIJI open-source&#160;image analysis software. Using high-speed image sequences of full fields of blood flow within capillaries, STAFF produces&#160;images that represent motion over time called kymographs for every time interval for every vascular segment. From the kymographs STAFF calculates velocities from the distance that red blood cells move over time, and outputs the velocity data as a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses. In normal mouse livers, STAFF analyses quantified profound differences in flow velocity between pericentral and periportal regions within lobules. Even more unexpected are the differences in flow velocity seen between sinusoids&#160;that are side by side and fluctuations seen within individual vascular segments over seconds. STAFF is a powerful new tool capable of providing novel insights by enabling measurement of the complex spatiotemporal dynamics of capillary flow.

To quantify microvascular flow from high speed capillary flow image sequences, we developed STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow) software. Across the full image field and over time, STAFF evaluates flow velocities and generates a sequence of color-coded spatial maps for visualization and tabular output for quantitative analyses.

Mikrovaskülüste AlanSal Akışın Mekansal Zamansal Analizi

Changes in blood flow velocity and distribution are vital in maintaining tissue and organ perfusion in response to varying cellular needs. Further, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Hücreli Sitokin Sekresyon Analizi için Mikroakışkan Damlacık Testi

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Bağışıklık Tepkilerinde Çok İşlevlilik ve Heterojenliğin Ortaya Çıkarılması

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...