Name: optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
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We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am Institut für Ernährungswissenschaften, Shanghai Institute für Biologische Wissenschaften, Chinesische Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) zugelassen. 1. DIO Mausmodell <ol><li> HFHS Fütterung <ol><li> Feed the acht Wochen alten männlichen C57BL / 6-Mäuse mit einem HFHS, die 40 kcal% Fett enthält und 40 kcal% Saccharose. Haus sie in 12 h Hell-Dunkel-Zyklus Bedingungen. </li><li> Halten Sie die Mäuse in HFHS Diät-Fütterung Bedingung für vier bis 16 Wochen. Überprüfen Sie das Körpergewicht pro Woche. </li></ol></li><li> Analyse der Körperzusammensetzung und Pseudofarbbildanalyse <ol><li> Betreff die Mäuse mit einem Körperzusammensetzung Analysator Analyse. <ol><li> Sicherung bewußt nicht narkotisierten Mäusen in einem Kunststoffrohr in der. Messen Sie die Körperfettmasse, Muskelmasse und Flüssigkeiten ein NMR - System, wie zuvor beschrieben 2. </li></ol></li><li> Scannen Sie den ganzen Körper jeder Maus ein MRT-System. <ol><li> Anesthetize die Mäuse mit 1% Avertin über intraperitoneale Injektion (25 &amp; mgr; l / g) und die Bildanalyse in Spezialglasröhren durchzuführen. HINWEIS: Der Prozess der Abbildungs ​​dauert fast 0,5 h für jede Maus. Wenn die Messung abgeschlossen ist, kehren die Mäuse in ihren Käfig. </li></ol></li><li> Scannen Sie die ganze Körper der Mäuse in dorsalen, mittleren und ventralen Schichten; Scannen der Leber in der vertikalen Richtung. Verwenden Sie ein 0,55 T-Magneten und die folgenden Geräteparameter: K space = 192 x 256 &amp; mgr; m, Schnittdicke = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, und die Anzahl der Scans = 8. Scan die gleiche magnetische Zustand für die alle Gruppen von Mäusen. </li><li> Ordnen Sie das Graustufenbild auf ein Pseudofarbbild entsprechend der Signalstärke 9. </li></ol></li><li> Maus - Euthanasie <ol><li> Sterilisieren dissecting Werkzeuge, wie Zangen und Scheren. </li><li> Gießen Sie ausreichend Isofluran auf einem Papiertuch und lassen Sie die Isofluran in einem Glas verflüchtigen. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse durch das Isofluran euthanasiert werden. </li><li> Befestigen Sie die Mäuse auf einem Operationstisch. Spray jeden Bauch mit 75% Ethanol, machen einen Einschnitt in der Dermis der Xiphoidbasis Schere und reißen die Dermis der Länge nach durch die Mittellinie mit den Händen das Peritoneum zu belichten. </li><li> Klemmen Sie den Xiphoidbasis mit einer Pinzette und schneiden Sie das Peritoneum der Breite durch den Boden der Rippen die Eingeweide zu belichten. </li><li> Sammeln Sie Blut in EDTA-beschichteten Röhrchen durch Herzpunktion. </li><li> Schneiden Sie die Membran entlang der Leber und entfernen Sie vorsichtig die Leber von den enterocoelia mit einer feinen Schere. Schneiden drei Stücke von Lebergewebe für die folgenden Lipidmessungen: a) 6 x 3 x 3 mm für H &amp; E-Färbung, b) 6 x 3 x 3 mm für Oil Red-O-Färbung, und c) 20-40 mg Leber für Chloroform / Methanol-Extraktion. </li></ol></li><li> H &amp; E - Färbung <ol><li> Fixieren Sie die Leber in 4% phosphatgepufferten Formalin Acetat bei 4 ° C über Nacht und dann binde sie in Paraffinwachs. </li><li> Schneiden Sie Paraffinschnitte (5 &amp; mgr; m) und montieren sie auf Glasobjektträger für H &amp; E - Färbung, wie zuvor beschrieben 3, 10. </li></ol></li><li> Oil Red - O - Färbung <ol><li> Regent Vorbereitung <ol><li> Bereiten Oil Red O Arbeitslösung mit 10% Formalin, 60% Isopropanol, Hämatoxylin und Glycerin Gelee. Man löst 0,5 g Oil Red O-Pulver mit 100 ml Isopropanol und erhitzen Sie es in einem 60 ° C-Bad eine 0,5% ige Stammlösung zu machen. </li><li> Verdünnen mit doppelt destilliertem Wasser (ddH 2 O) in einem Verhältnis 3: 2 (3 ml der Stammlösung und 2 ml ddH 2 O). Filtern Sie die Arbeitslösung und lassen Sie für mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. </li></ol></li><li> Betten Sie die Leber in eine optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindung in aplastic Kastens. Einfrieren bei -20 ° C für 30 min. Schneiden Sie es in 8-um-Schnitte in einem Gefriermikrotom, montieren Sie das Gewebe auf einer Folie, und legen Sie es für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Legen Sie ein Papiertuch in den Boden einer Anfärbung Wanne und gießen Sie eine kleine Menge von 10% Formalin das Papiertuch zu benetzen. Legen Sie die Folie in der Färbung Badewanne und fixieren die Gefrierschnitten in Formaldehyd Dämpfe für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Tauchen Sie die Folie in 60% Isopropanol in der Färbungs Wanne für 3 s; wiederhole einmal. </li><li> Fügen Sie ein paar Tropfen Öl O Red Arbeitslösung auf die Folie alle Gewebe zu bedecken und für 15 min inkubiert. Schützen Sie das Gewebe von Licht bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die Folie in neuen 60% Isopropanol in der Färbungs Wanne für 3 s; zweimal wiederholen. </li><li> Vorsichtig spülen Sie das Wasser um das Gewebe die Folie durch destilliertes Wasser zweimal und zu entfernen. Achten Sie darauf, nicht um das Gewebe zu trocknen. </li><li> Legen Sie die Folie in Hämatoxylin für 1 min und spülen Sie vorsichtig mit Leitungswasser für 5-10Minute Vorsichtig spülen Sie die es in destilliertem Wasser, bis sie bereit auf dem Deckglas die Folie in destilliertem Wasser zweimal und halten zu setzen. </li><li> Erhitzen Sie das Glycerin Gelee in der Mikrowelle und mehrere Tropfen auf dem Gewebe platzieren. Sanft legen Sie das Deckglas auf und kümmern uns nicht um Blasen zu bilden. </li><li> Beachten Sie den Fleck unter dem Mikroskop und erfassen charakteristische Bilder mit 20X und 40X Ziele. </li></ol></li><li> Die Messung der Leberlipide <ol><li> Legen Sie die seziert Lebergewebe in einem neuen 2-mL-Zentrifugenröhrchen. Homogenisieren in 1 ml PBS mit einem Homogenisator und Transfer des Lysats auf ein neues 15-mL Glasrohr. </li><li> 5 ml Chloroform / Methanol (2: 1, v / v) Lösung, vortex die Mischung kräftig für 1 min und ließ für 2 h auf Eis stehen. </li><li> Zentrifuge bei 1.650 xg für 10 min bei 4 ° C; sollte die Mischung in drei Schichten zu trennen: die obere Methanolschicht, die mittlere Protein Scheibe und die untere Chloroform und Lipiden. </li><li> Tran<html> sfer der unteren Phase in ein neues Glasrohr mit einem Glas Pasteur Pipette; es besteht keine Notwendigkeit, jeden Tropfen der Bodenfraktion zu erhalten. Stellen Sie den Schlauch zur Seite auf dem Eis. </li><li> Hinzufügen , 600 &amp; mgr; l von 4 mM MgCl 2 und 1,5 ml Chloroform zu der überstehenden Fraktion nach links in dem vorhergehenden Rohr und kräftig vortexen. Inkubieren auf Eis für 30 min und zentrifugieren bei 1.650 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Kombinieren Sie die untere Phase mit dem ersten Bodenphase Rohr mit Pasteur-Pipette. Entsorgen Sie die oberen und mittleren Schichten. </li><li> Verdampfe das Chloroform unter Stickstoffgas in einem 37 ° C-Bad. Waschen Sie die Seiten der Glasrohre gründlich mit 200 ul 1% Triton X-100 / Chloroform (v / v). Man dampft unter Stickstoffgas. Man löst das Lipid mit 200 &amp; mgr; l ddH 2 O und Wirbel auch die endgültige Emulsion zu machen. </li><li> Messen Sie die Gesamt Triglycerid (TG) und Cholesterin (TC) Ebenen durch ein Triglycerid oder Cholesterin-Kit nach Protokoll des Herstellersxref &quot;&gt; 3. HINWEIS: Die Lipidwerte normalisiert sind , die denen der Proteinkonzentration in dem anfänglichen Homogenisat, wie 3 durch Proteinquantifizierung bestimmt. </li></ol></li></ol> 2. Primäre Maus-Hepatozyten-Modell <ol><li> Isolierung von Maus primären Hepatozyten <ol><li> Anesthetize jede Maus mit 6% Chloralhydrat (10 &amp; mgr; l / g intraperitoneal). </li><li> Isolieren primäre Hepatozyten, wie zuvor beschrieben 10. Wachsen Zellen auf Kollagen beschichteten Glasplättchen in einer 6-Well-Platte für Oil Red O Färbung. Für Lipidextraktion, Samen der Zellen auf einer 10 cm Zellkulturschale 10. </li></ol></li><li> Zellbehandlung und Oil Red - O - Färbung <ol><li> Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml Hungermedium und Inkubation bei 37 ° C für 24 h. Behandeln Sie es mit 30 mM Glucose und 100 nM Insulin. Inkubieren es in einem 37 ° C Inkubator Kultur für 24 h. </li><li> Saugen Sie das Medium. In 2 ml PBS und vorsichtig schwenken, das Medium zu spülen; wiederhole einmal. </li><li> Befestigen Sie das Deckglas auf den Objektträger mit einem Gummiband. Setzen Sie die an der äußeren Oberfläche anhaftenden Zellen. Führen Sie die Öl-Rot-O-Färbung, wie oben (Schritt 1.5) beschrieben. HINWEIS: Die Basalniveaus von Lipidakkumulation mit einem hohen Glucose plus Insulin-Behandlung nach Serumentzug stimuliert. Die Lipidtropfen werden von Oil Red-O-Färbung sichtbar gemacht. </li></ol></li><li> Messung von Lipiden <ol><li> Behandeln Sie die Hepatozyten mit hoher Glukose und Insulin im gleichen Zustand (Schritt 2.2.1). 1 ml PBS in jede 10-cm Zellkulturschale. Kratzen Sie die Zellen aus und ernten sie in neue 15-ml-Glasröhrchen, aus denen Teilmengen von 100 ul übertragen werden an die frische 1,5-ml-Röhrchen für die Proteinquantifizierung. </li><li> 4 ml Chloroform / Methanol (2: 1, v / v) an die verbleibenden 900 &amp; mgr; l der Zellen. Beschallen für ca. 20 Pieptöne und dann Vortex kräftig zu lösendas Lipid in den Zellen. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 2 Stunden. Führen Sie die Lipidextraktion (Schritt 1.6). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben. Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (Nr 81270930, 31471129 und 31671224) und die hundert Talente-Programm der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (2013OHTP04) zu YL unterstützt wurde

NASH ist eine Reihe von progressiven Lebererkrankungen, die mit metabolischem Syndrom assoziiert ist, Fettleibigkeit, Insulinresistenz oder Typ - 2 - Diabetes mellitus (T2DM) 11. Das Markenzeichen von NAFLD ist Steatose, die Anhäufung von Lipid in Hepatozyten. Hier wird ein Spektrum von Verfahren vorgestellt, die Phänotypen und die Parameter der Lebersteatose Verwendung DIO Mäuse und Maus primären Hepatozyten zu charakterisieren. Dieses Verfahren könnte hilfreich sein, die molekularen Mechanismen der NAFLD und andere damit verbundene Stoffwechselerkrankungen aufzuklären. In vivo und in - vitro - Assays Die Kombination bieten diese Methoden umfassende Analysen und Bewertungen von Hepatosteatose. Derzeit Tiermodellen von NAFLD hauptsächlich aus genetischen und ernährungsphysiologischen Modellen bestehen. Die HFHS Ernährung verwendet hier soll die moderne Ernährung Stil zu imitieren, und reicht aus, um Fettleibigkeit und Hepatosteatose in Mäusen zu induzieren. Um jedoch die molekularen Mechanismen in der develo studierenpment von Lipid Deregulierung, die zellbasierte Assay enthält offensichtliche Vorteile gegenüber Tierstudie, einschließlich einfache Handhabung durch die genetische Mutation oder pharmakologische Behandlung sowie relativ niedrige Kosten und zeitliche Verpflichtungen. Hepatische Steatose in Maus primären Hepatozyten, hohe Konzentrationen von Glucose plus Insulin erzeugen , werden verwendet , Lipidakkumulation zu induzieren, die eine neuartige und effiziente in vitro - Modell zu imitieren in vivo Diät-induzierte Hyperglykämie und Hyperinsulinämie. Diese Behandlung ist auch bei anderen Leberzelllinien, wie HepG2-Zellen. Da die gentechnisch veränderten Hepatozyten zu einer Vielzahl von pharmazeutischen Behandlungen zugänglich sind, beschrieben , die in vitro steatotic Modell überwindet hier die Beschränkung und zeitaufwendige Schritte für die Erzeugung von Tiermodellen unter Verwendung von Verstärkungs- und loss-of-function Ansätze. Die Körperzusammensetzungs-Analysen einschließlich NMR und MRI, stellen die nicht-invasive und Echtzeit-Daten aufLipid in den ganzen Körper und in der Leber. Es ist eine nicht-invasive, zeitsparende, visualisierbar und semi-qualitative Messungen. Darüber hinaus kann die Genauigkeit der Körperzusammensetzungs-Analysen stark durch die Kombination von anderen histologischen und biochemischen Messungen verbessert werden. Es ist kritisch und notwendig Hepatosteatose in vivo zu bestimmen , und in vitro unter Verwendung von H &amp; E - Färbung, Oil Red - O - Färbung und Lipidmessung, von denen alle sind Gold-Standard - Messungen für die Diagnose und Lebersteatose Einstufung. Eine der Einschränkungen des vorliegenden Verfahrens ist seine Unfähigkeit, Entzündung und Kollagenablagerung zu messen, wenn einfache Steatose Hepatitis fortschreitet, Fibrose und schließlich Leberzirrhose und Leberkrebs. Da die Diät-induzierten adipösen Mäuse haben ein geringes Risiko für die Entwicklung von NASH, ist das aktuelle Protokoll ausreichend Hepatosteatose in DIO Mäuse zu bewerten. Jedoch unter der Bedingung von NASH, andere biochemische Messungen, wie Plasma alanine-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Aminotransferase (AST) Ebenen sollten genutzt werden.

Adipositas ist eine wachsende Gesundheitsproblem in den entwickelten und den Entwicklungsländern. Es wurde eines der koexistierenden Bedingungen 1 häufig mit nicht - alkoholische Fettleber (NASH), mit einer Prävalenz im Bereich zwischen 30 und 100 Prozent in NASH Patienten in Verbindung gebracht werden berichtet. Aufgrund der starken Korrelation zwischen Fettleber und Fettsucht, Diät-induzierte fettleibig (DIO) Mausmodelle werden häufig zur Untersuchung der komplexen molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit der Entwicklung von NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 verwendet. Hepatosteatose ist das früheste Stadium von NAFLD, und es kann zu nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), Zirrhose fortschreiten und schließlich Leberkrebs 7. Daher ist das allgemeine Ziel dieser Methode Tier- und Zellmodellen der hepatischen steatotic Bedingungen zu erzeugen und zu provide detaillierte Protokolle für die effiziente und genaue Lipidmessung. Diese Modelle und Messungen sind auch geeignet für die Untersuchung von anderen Stoffwechselstörungen, wie Insulinresistenz und Typ-2-Diabetes. Da Fettleibigkeit identifiziert wird einer der wichtigsten Risikofaktoren für NAFLD, eine fettreiche, High-Saccharose-Diät (HFHS), die den Western-Stil hohen Fett-Diät imitiert sein wird verwendet, Fettleibigkeit bei Mäusen zu induzieren. Anschließend kann der Grad der Lebersteatose verschiedenen Methoden beurteilt werden. Erstens, Körpergewicht und Körperzusammensetzungsanalyse mit Kernspinresonanz (NMR) zeigen die Lipidakkumulation während der Fütterung. Die Fettmasse und Muskelmasse in einem nicht-invasiv und in Echtzeit Weise quantifiziert werden. Zusätzlich wird die Kernspintomographie (MRI) verwendet, um sowohl die Ganzkörper und die Leber Fettverteilung zu zeigen. Das Graustufensignal des MRI-Analyse kann in einem lesbaren Pseudofarbbild umgewandelt werden, und die Intensität derdie Graustufen- und Farb ist Hemi-quantifizierbar. Diese Technologie bietet einzigartige Vorteile für die Messung der Lipidakkumulation in lebenden Tieren. Zweitens ist die histologische Analyse der Leber am häufigsten verwendete Methode Hepatosteatose zu bestimmen. Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) Färbung liefert histologischen Daten wie Hepatozyten Morphologie und Makrophageninfiltration, während Oil Red-O-Färbung, die Größe und Position der Lipidtröpfchen in Hepatozyten zeigt. Drittens ist der Lipidgehalt Analyse Chloroform / Methanol-Extraktion unter Verwendung eine genaue und quantitative Messung von Leberlipiden. Gesamt-Triglycerid-und Cholesterinspiegel kann mit biochemischen Methoden gemessen werden. Wichtig ist, dass Lipid-Extraktionsanalyse und Oil Red O Färbung auch in genetisch manipulierten oder pharmazeutisch behandelten Hepatozyten verwendet werden. Der Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Verwendung von mehreren optimiert Ansätze hepatischen steatotic Modelle zu erzeugenund umfassend die Phänotypen charakterisieren sowohl in vivo und in vitro. Die DIO Mausmodelle können die Pathologie und metabolischen Phänotyp der menschlichen Fettleberkrankheit rekapitulieren. Andere Stoffwechselparameter beim Menschen können in diesem Modell als auch 8 repliziert werden. Die Erzeugung des steatotic Hepatozyten-Modell in Reaktion auf hohe Glukose plus Insulin ist effizient, nützlich und überwindet die Begrenzung der kostspielig und zeitraubend Maus funktionieren. Zusammengenommen sind diese Verfahren ausreichend und notwendig für die Untersuchung von Leberlipidstörungen und Insulinresistenz bei Nährstoff Überlastung.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Wie in 1A gezeigt ist , wurde die Mauskörpergewicht 45 ± 1,2 g nach 16 Wochen HFHS Fütterung erhöht, was etwa 1,5-fach höher als Chow - Diät Zuführgruppe ist. Die NMR - Körperzusammensetzung analysiert die Fettmasse und Muskelmasse von Mäusen zeigt , sind angegeben (1B). Die Fettverteilung des ganzen Körpers und der Leber wurden durch MRI bestimmt, und repräsentative Pseudo-Farbbilder in Live - bewusste Mäuse werden in 1C-D gezeigt. Das Körpergewicht und die Körperzusammensetzung wurden während der HFHS Diät Fütterungsvorgang gemessen und visualisiert. Um die steatotic Phänotypen sezieren, wurden die Mäuse getötet und eine Leber histologische Analyse wurde durchgeführt. Die H &amp; E und Ölrot O Anfärbung der Leber sind in 2A-B gezeigt, in der Lipidtröpfchen größer und besetzen die Zwischenräume in den meistenHepatozyten nach 4 Monaten HFHS Ernährung Fütterung. Der Grad der Hepatosteatose von HFHS Diät gefütterten Mäuse wird durch den Vergleich mit Chow-Diät gefütterten Mäuse leicht sichtbar gemacht. Die Hauptkomponenten des Lipids, wie Triglycerid und Cholesterin wurden mit Chloroform / Methanol - Extraktion (2C) gemessen. In DIO Mäuse, die überschüssige Nährstoffüberlastung verursacht abnorme Triglycerid-Akkumulation in der Leber. Mit Daten von NMR, MRI und histologische Analyse wird der Grad der Lipidablagerung wirksam und genau bestimmt werden. Wie in 3 gezeigt, wurden die Lipidspiegel in primären Hepatozyten durch hohe Glukose plus Insulin für 24 h induziert. Die akkumulierten Lipidtropfen wurden durch Ölrot O - Färbung (3A) und die quantitative Lipidanalyse wurde anschließend die Triglycerid- und Cholesterinwerte in Hepatozyten (3B) verwendet wird, bestimmt zu messen. Basierend aufModell die Auswirkungen der genetischen Veränderung oder pharmazeutischen Behandlung auf Lipidhomöostase in Hepatozyten auf effiziente und schnelle Art und Weise untersucht werden. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig1.jpg" /> Abbildung 1. High-fat, high-Saccharose - Diät (HFHS) erhöht Fettleibigkeit und Hepatosteatose bei Mäusen. Acht Wochen alte männliche C57BL / 6-Mäuse wurden für 8 Wochen auf einem Futter oder HFHS Diät gefüttert und 16 Wochen, respectively. (A) Das Körpergewicht der Mäuse. (B) Die Körperzusammensetzung der Mäuse. (C - D) Repräsentative Magnetresonanzbild der Maus und Leber. Der weiße Bereich in dem Graustufenbild zeigt, das Fett, während der rote Bereich in dem Pseudofarbbild angibt, das Fett. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) dargestellt wird, n = 5-8. * P &lt;0,05 im Vergleich zu den Chow-Diät-gefütterten Mäusen. Die Fehlerbalken stellen die SEM. Statistical Analyse wurde mit einem ungepaarten, zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse der hepatischen Steatose bei Mäusen mit einer HFHS Diät gefüttert. Acht Wochen alte männliche C57BL / 6-Mäuse wurden für 8 Wochen auf einem Futter oder HFHS Diät gefüttert und 16 Wochen, respectively. (A) Repräsentative Brutto Morphologie von enterocoelia und Leber. (B) Repräsentative H &amp; E und Oil Red - O - Färbung (Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m). Oil Red O färbt das Fett und Neutralfett und roten Punkte zeigen Lipidtröpfchen in Hepatozyten angesammelt. (C) Gesamt - Triglycerid - und Cholesterinspiegel der Leberlipidextraktionen mit der Chloroform / Methanol - Verfahren. Die Daten wurden normalisiert auf ter Lebergewicht, und sind als Mittelwert ± Standardfehler (SEM), n = 5-8 dargestellt. * P &lt;0,05 im Vergleich zu den mit Chow-Diät gefütterten Mäusen. Die Fehlerbalken stellen die SEM. Die statistische Analyse wurde mit einem ungepaarten, durchgeführt two-tailed Student-t-Test. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig3.jpg" /> Abbildung 3. Hepatosteatose wird in primären Maus - Hepatozyten ausgesetzt hohen Glukose und Insulin induziert. (A) Oil Red O Färbung von kultivierten primären behandelten Hepatozyten ohne oder mit Glukose und Insulin, wie angegeben (Maßstabsbalken: 50 &amp; mgr; m). (B) Triglyceridspiegel in den primären Hepatozyten wurde gemessen und normalisiert auf die Proteinkonzentration. Die Daten werden als Mittelwert ± vertretender Standardfehler (SEM). * P &lt;0,05 im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die Fehlerbalken stellen die SEM. Die statistische Analyse wurde mit einem ungepaarten, durchgeführt two-tailed Student-t-Test. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K Aufrufe.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

Serie: Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

Forschung

Medizin

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Biochemie

Beurteilung der Lebersteatose mit 3D-Fluoreszenz-Lipidtröpfchen-Rekonstruktion

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Autor im Rampenlicht: Analyse von fluoreszenzgefärbten Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Biologie

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

Ein Modell der experimentellen Steatose in vitro: Hepatozytenzellkultur in lipidüberlastetem Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

Neuartige In-vivo-Mikro-Computertomographie-Bildgebungsverfahren zur Beurteilung des Fortschreitens der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung

Optimierte Analyse von

Zusammenfassung

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Visualisierung und Analyse des Blutflusses und der Sauerstoffverbrauch in hepatischen Mikrozirkulation: Anwendung auf eine akute Hepatitis-Modell

^In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

Messung der Fettsäure-β-Oxidation in einer Suspension frisch isolierter Maus-Hepatozyten

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Induzieren und Charakterisieren der vesikulären Steatose in differenzierten HepaRG-Zellen

Bestimmung der Fettsäureoxidation und Lipogenese in Maus primären Hepatozyten

Ein Modell der experimentellen Steatose in vitro: Hepatozytenzellkultur in lipidüberlastetem Medium

Neuartige In-vivo-Mikro-Computertomographie-Bildgebungsverfahren zur Beurteilung des Fortschreitens der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung