Name: optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis at JoVE.com

We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية في معهد علوم التغذية والمعاهد شنغهاي للعلوم البيولوجية، الأكاديمية الصينية للعلوم (شنغهاي، الصين). 1. DIO ماوس نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التغذية HFHS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغذية الذكور البالغ من العمر ثمانية أسابيع C57BL / 6 الفئران مع HFHS التي تحتوي على 40 سعرة حرارية٪ من الدهون و 40 سعر حراري٪ سكروز. إيوائهم في 12 ساعة الظروف دورة الظلام الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الفئران في HFHS حالة اتباع نظام غذائي الرضاعة لمدة أربعة إلى ستة عشر أسبوعا. تحقق الأسبوعية وزن الجسم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل تكوين الجسم وتحليل الصور الزائفة اللون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الفئران لتحليل الجسم تكوين محلل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين واعية، والفئران لا تخدير في أنبوب بلاستيكي في. قياس الدهون في الجسم كتلة، كتلة العجاف، والسوائل باستخدام نظام الرنين المغناطيسي النووي، كما هو موضح سابقا (2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح الجسم كله من كل فأر باستخدام نظام التصوير بالرنين المغناطيسي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع 1٪ آفيرتين عن طريق الحقن داخل الصفاق (25 ميكرولتر / ز) وإجراء تحليل التصوير في أنابيب زجاجية المتخصصة. ملاحظة: عملية التصوير يستمر لمدة ما يقرب من 0.5 ساعة لكل الماوس. عندما يتم الانتهاء من قياس، وعودة الفئران إلى قفص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح أجسام كاملة من الفئران في ظهري، والمتوسطة، والطبقات البطنية. فحص الكبد في الاتجاه الرأسي. استخدام 0.55 T المغناطيس والمعلمات فعال التالية: K مساحة = 192 × 256 ميكرون، سمك الباب = 3 مم، TE = 14.8 مللي، TR = 400 مللي ثانية، FOVRead = 100 ملم، FOVPhase = 100 مم، وعدد من مسح = 8. المسح الضوئي باستخدام حالة المغناطيسية نفسها لجميع الفئات من الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خريطة صورة رمادية على صورة شبه لون وفقا لشدة إشارة 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القتل الرحيم الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم dissectiأدوات نانوغرام، مثل ملقط ومقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب الأيزوفلورين كافية على منشفة ورقية، والسماح للالأيزوفلورين تتطاير في وعاء زجاجي. تأكد من أن الفئران يصرح باستخدامها من قبل الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الفئران على طاولة العمليات. رش كل البطن مع 75٪ من الإيثانول، وجعل شق في الأدمة من عملية الخنجري باستخدام مقص، وتمزق الأدمة بالطول من خلال خط الوسط مع يد لفضح الصفاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك عملية الخنجري مع ملقط وقطع breadthwise البريتوني من خلال الجزء السفلي من الأضلاع لفضح الأحشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم في أنابيب المغلفة EDTA من ثقب في القلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحجاب الحاجز على طول الكبد وإزالة بعناية الكبد من enterocoelia باستخدام مقص غرامة. قطع ثلاث قطع من أنسجة الكبد للقياسات الدهون التالية: أ) 6 × 3 × 3 مم ل H &amp; E تلطيخ، ب) 6 × 3 × 3 مم للنفط الأحمر يا تلطيخ، وج) 20-40 ملغ من الكبد لالكلوروفورم / استخراج الميثانول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H &amp; E تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الكبد في 4٪ مخزنة الفوسفات الفورمالين خلات عند 4 درجات مئوية خلال الليل ثم تضمين ذلك في شمع البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أقسام البارافين (5 ميكرون)، وجبل لهم على الشرائح الزجاجية لH &amp; E تلطيخ، كما هو موضح سابقا 3، 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النفط الأحمر يا تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ريجنت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل العاملة النفط الأحمر O مع 10٪ من الفورمالين، 60٪ الأيزوبروبانول، الهيماتوكسيلين، والجلسرين هلام. حل 0.5 غرام من زيت أحمر يا مسحوق مع 100 مل من الأيزوبروبانول وتسخينها في C حمام 60 درجة لجعل 0.5٪ محلول المخزون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخفف بالماء المقطر مزدوجة ([ده 2 O) في نسبة 3: 2 (3 مل من محلول المخزون و 2 مل من ده 2 O). تصفية حل العاملة واسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الكبد في درجة الحرارة المثلى القطع (أكتوبر) مركب في ا ف بlastic مربع التضمين. تجميده عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قطع عليه إلى أقسام 8 ميكرومتر في مشراح التجميد، تركيب الأنسجة على شريحة، ووضعه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع منشفة ورقية في الجزء السفلي من حوض استحمام في تلطيخ وصب كمية صغيرة من 10٪ من الفورمالين لتبلل منشفة ورقية. ضع الشريحة في حوض تلطيخ وإصلاح الأجزاء المجمدة في أبخرة الفورمالدهايد لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في 60٪ الأيزوبروبانول في حوض تلطيخ لمدة 3 ق. التكرار مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بضع قطرات من محلول تعمل النفط الأحمر O إلى الشريحة لتغطية جميع الأنسجة واحتضان لمدة 15 دقيقة. حماية الأنسجة من الضوء في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشريحة في الجديد 60٪ الأيزوبروبانول في حوض تلطيخ لمدة 3 ق. كرر مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف بلطف الشريحة من خلال الماء المقطر مرتين وإزالة المياه في جميع أنحاء الأنسجة. تأكد من عدم تجفيف الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة في الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة وشطف بلطف بماء الصنبور لمدة 5-10دقيقة. شطف بلطف الشريحة في الماء المقطر مرتين والحفاظ على ذلك في الماء المقطر حتى على استعداد لوضع على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين هلام الجلسرين في الميكروويف ووضع عدة قطرات على رأس الأنسجة. وضع بلطف ساترة على رأس والحرص على عدم تشكيل فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة وصمة عار تحت المجهر والتقاط الصور المميزة باستخدام 20X 40X والأهداف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس نسبة الدهون في الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنسجة الكبد تشريح في أنبوب جديد للطرد المركزي 2-مل البلاستيك. التجانس في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع الخالط ونقل المحللة إلى أنبوب جديد زجاج 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من الكلوروفورم / الميثانول (2: 1، ت / ت) حل، دوامة الخليط بقوة لمدة 1 دقيقة، واسمحوا الوقوف لمدة 2 ساعة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1650 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. يجب فصل الخليط إلى 3 طبقات: الطبقة العليا والميثانول، والقرص البروتين المتوسطة، والكلوروفورم السفلي والدهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تران<html> SFER مرحلة القاع في أنبوبة زجاجية جديدة باستخدام الزجاج باستور الماصة. ليست هناك حاجة للحصول على كل قطرة من جزء السفلي. تعيين أنبوب جانبا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 600 ميكرولتر من 4 مم MgCl 2 و 1.5 مل من الكلوروفورم إلى جزء طاف المتبقية في الأنبوب السابق ودوامة بقوة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 1650 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين مرحلة القاع مع أول أنبوب مرحلة القاع باستخدام الماصة باستور. تجاهل الطبقات العليا والمتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر الكلوروفورم تحت غاز النيتروجين في C حمام 37 درجة. غسل الجانبين من أنابيب الزجاج بدقة مع 200 ميكرولتر من 1٪ تريتون X-100 / الكلوروفورم (ت / ت). تتبخر تحت غاز النيتروجين. حل الدهون مع 200 ميكرولتر من ده 2 O ودوامة جيدا لجعل مستحلب النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس إجمالي الدهون الثلاثية (TG) والكولسترول (TC) مستويات باستخدام الدهون الثلاثية أو الكوليسترول عدة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعةXREF &quot;&gt; 3. ملاحظة: القيم الدهون هي طبيعية لتلك التي تركيزات البروتين في جناسة الأولي، على النحو الذي يحدده البروتين الكمي 3. </li></ol></li></ol> 2. الابتدائية ماوس الكبدية نموذج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل خلايا الكبد الأولية الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير كل فأر مع هيدرات كلورال 6٪ (10 ميكرولتر / ز البريتونى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل خلايا الكبد الأولية، كما هو موضح سابقا (10). تنمو الخلايا على coverslips الزجاج المغلفة الكولاجين في لوحة 6 جيدا للنفط الأحمر يا تلطيخ. لاستخراج الدهن، البذور الخلايا على 10 سم صحن الثقافة خلية 10. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج بالخلايا والنفط الأحمر يا تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة مع 2 مل من المتوسط ​​الجوع واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. علاج مع 30 ملي الجلوكوز والأنسولين 100 نانومتر. احتضان في 37 درجة مئوية حاضنة الثقافة لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في المتوسط. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني ودوامة بلطف لشطف المتوسطة. التكرار مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح ساترة إلى الشريحة مع الشريط المطاطي. كشف الخلايا الملتصقة على السطح الخارجي. أداء تلطيخ النفط الأحمر يا كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.5). ملاحظة: مستويات القاعدية من تراكم الدهون وحفز مع ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى العلاج الأنسولين بعد التجويع المصل. وتصور قطرات الدهن بالزيت الأحمر يا تلطيخ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس نسبة الدهون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج خلايا الكبد مع ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين في نفسه شرط (الخطوة 2.2.1). إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني على كل طبق خلية ثقافة 10 سم. كشط الخلايا وحصادها في أنابيب الزجاج 15 مل الجديدة، والتي يتم نقل aliquots من 100 ميكرولتر إلى الطازج أنابيب 1.5 مل لتقدير البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من الكلوروفورم / ميثانول (2: 1، ت / ت) إلى 900 ميكرولتر المتبقية من الخلايا. يصوتن لالتقريبية 20 الصفافير ثم دوامة بقوة على إطلاق سراحالدهون في الخلايا. احتضان الخليط على الجليد لمدة 2 ساعة. تنفيذ عملية الاستخراج الدهون (الخطوة 1.6). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Angulo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medical+progress+-+Nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha.">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice.">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21.">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li><li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting.">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li><li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue,+insulin+resistance,+and+hepatic+steatosis+in+obesity.">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li><li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fatty+liver+disease:+old+questions+and+new+insights.">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li><li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease.">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier.">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice.">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li><li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+NAFLD+to+diabetes+mellitus,+cardiovascular+disease+or+cirrhosis.">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة. التمويل: وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81270930، 31471129، 31671224 و) ومئة وزنة البرنامج التابع للأكاديمية الصينية للعلوم (2013OHTP04) إلى YL

NAFLD هو عبارة عن سلسلة من أمراض الكبد التقدمية التي ترتبط مع متلازمة التمثيل الغذائي، والسمنة، ومقاومة الأنسولين، أو من النوع 2 من مرض السكري (T2DM) 11. السمة المميزة لNAFLD هو تنكس دهني، وتراكم الدهون في خلايا الكبد. هنا، يتم تقديم مجموعة متنوعة من الأساليب لتوصيف الظواهر والمعلمات من تشحم الكبد باستخدام الفئران ديو وخلايا الكبد الماوس الابتدائي. هذا الإجراء يمكن أن تكون مفيدة لتوضيح الآليات الجزيئية للNAFLD وغيرها من الأمراض الاستقلابية ذات الصلة. الجمع بين المجراة في المقايسات المختبر، وتوفر هذه الأساليب التحليلات والتقييمات من تشحم الكبد شاملة. حاليا، نماذج حيوانية من NAFLD تتكون أساسا من النماذج الوراثية والغذائية. ويهدف النظام الغذائي HFHS المستخدمة هنا لتقليد النمط الغذائي الحديث وغير كافية لإحداث السمنة وتشحم الكبد في الفئران. ومع ذلك، لدراسة الآليات الجزيئية في development من رفع القيود الدهون، وفحص خلية القاعدة يحتوي على مزايا واضحة على دراسة أجريت على الحيوانات، بما في ذلك التلاعب بسهولة عن طريق طفرة جينية أو العلاج الدوائي، وكذلك تكاليف منخفضة نسبيا والالتزامات الوقت. لتوليد تشحم الكبد في خلايا الكبد الأولية الماوس، يتم استخدام تركيزات عالية من الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين للحث على تراكم الدهون، وهو رواية وكفاءة في نموذج المختبر لتقليد في الجسم الحي ارتفاع السكر في الدم الناجم عن النظام الغذائي وفرط. وهذا العلاج هو أيضا تنطبق على خطوط الخلايا الكبدية الأخرى، مثل الخلايا HepG2. وبالنظر إلى أن خلايا الكبد المعدلة وراثيا يمكن الوصول إلى مجموعة متنوعة من العلاجات الدوائية، في المختبر نموذج steatotic الموصوفة هنا يتغلب على الحد منها، والخطوات تستغرق وقتا طويلا لتوليد نماذج حيوانية باستخدام gain- والنهج الخسارة من وظيفة. يحلل تكوين الجسم، بما في ذلك الرنين المغناطيسي والتصوير بالرنين المغناطيسي، وتوفير البيانات غير الغازية وفي الوقت الحقيقي علىالدهون في الجسم كله والكبد. ومن غير الغازية، وتوفير الوقت، visualizable، وقياس شبه النوعي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن دقة التحليلات تكوين الجسم يمكن أن تحسن كثيرا من خلال الجمع بين القياسات النسيجية والكيميائية الحيوية الأخرى. فمن الأهمية بمكان وضروري لتحديد تشحم الكبد في الجسم الحي في المختبر باستخدام H &amp; E تلطيخ، النفط الأحمر يا تلطيخ، وقياس الدهون، وكلها قياسات الذهب القياسية لتشخيص وتصنيف تشحم الكبد. واحد من أوجه القصور في المنهج الحالي هو عدم قدرتها على قياس الالتهاب وترسب الكولاجين عندما تقدم تنكس دهني بسيط لالتهاب الكبد، تليف، وفي نهاية المطاف، تليف الكبد وسرطان الكبد. وبالنظر إلى أن الفئران السمينة التي يسببها النظام الغذائي لديها منخفضة المخاطر لتطوير ناش، البروتوكول الحالي يكفي لتقييم تشحم الكبد في الفئران DIO. ومع ذلك، في حالة ناش، وغيرها من القياسات البيوكيميائية، مثل ALANI البلازماالألانين شمال شرق (ALT) ومستويات الألانين اسبارتاتي (AST)، وينبغي أن تستخدم.

السمنة مشكلة صحية المزدهرة في البلدان المتقدمة والنامية. تم الإبلاغ عن أن تكون واحدة من شروط التعايش كثيرا ما يرتبط مع غير الكحولي مرض الكبد الدهني (NAFLD)، مع انتشار تتراوح بين 30 و 100 في المئة في المرضى الذين يعانون NAFLD 1. ويرجع ذلك إلى ارتباط قوي بين الكبد الدهني والسمنة، وتستخدم يعانون من السمنة المفرطة (ديو) نماذج الماوس التي يسببها النظام الغذائي على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية المعقدة المرتبطة تطوير NAFLD 2، 3، 4، 5، 6. تشحم الكبد هو أول مرحلة من NAFLD، وأنها يمكن أن تتطور إلى التهاب الكبد الدهني غير الكحولي (ناش)، تليف الكبد، وفي نهاية المطاف، سرطان الكبد 7. ولذلك، فإن الهدف العام من هذه الطريقة لتوليد الحيوانات والخلايا نماذج من الظروف steatotic الكبدية والعلاقات العامةبروتوكولات وإجراءات تفصيلية أوفيد لقياس الدهون كفاءة ودقة. هذه النماذج والقياسات هي مفيدة أيضا للتحقيق في الاضطرابات الأيضية الأخرى، مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري من النوع 2. كما تم تحديد السمنة لتكون واحدة من عوامل الخطر الرئيسية للNAFLD، ونسبة عالية من الدهون، ويستخدم عالية السكروز النظام الغذائي (HFHS) أن يقلد على النمط الغربي عالية من الدهون نظام غذائي للحث على السمنة في الفئران. وفي وقت لاحق، ودرجة تشحم الكبد يمكن تقييم باستخدام أساليب مختلفة. أولا، ووزن الجسم وتحليلها وتكوين هيئة من الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تظهر تراكم الدهون خلال فترة الرضاعة. كتلة الدهون والكتلة الخالية من الدهن يمكن قياسها بطريقة غير الغازية وفي الوقت الحقيقي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لإظهار كل من الجسم كله، وتوزيع الكبد من الدهون. إشارة الرمادي لتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن تحويلها إلى مقروءا الصورة الزائفة اللون، وشدةوالرمادي واللون هو-نصفي للقياس الكمي. توفر هذه التقنية مزايا فريدة لقياس تراكم الدهون في الحيوانات الحية. ثانيا، التحليل النسيجي للكبد هو الأسلوب الأكثر شيوعا لتحديد تشحم الكبد. يوفر الهيماتوكسيلين ويوزين (H &amp; E) تلطيخ المعلومات النسيجية، مثل التشكل الكبدية وتسلل بلعم، في حين يظهر النفط الأحمر يا تلطيخ حجم وموضع من قطرات الدهون في خلايا الكبد. ثالثا، تحليل محتوى الدهون باستخدام استخراج الكلوروفورم / الميثانول هو القياس الدقيق وكمية من الدهون الكبدية. ويمكن قياس مجموع مستويات الدهون الثلاثية والكوليسترول مع أساليب الكيمياء الحيوية. الأهم من ذلك، تحليل استخلاص الدهون والزيوت الأحمر يا تلطيخ يمكن أن تستخدم أيضا في معالجة جينيا أو صيدلانيا تعامل خلايا الكبد. وميزة هذا الأسلوب هو استخدامه من النهج الأمثل متعددة لتوليد نماذج steatotic الكبديةولتوصيف شامل الظواهر سواء في المجراة في المختبر. يمكن للنماذج DIO الماوس ألخص في علم الأمراض والتمثيل الغذائي الظواهر من مرض الكبد الدهني البشري. المعلمات الأيضية الأخرى في البشر يمكن تكرارها في هذا النموذج، وكذلك 8. توليد نموذج الكبدية steatotic ردا على ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين هو فعالة ومفيدة، ويتغلب على الحد من عمل الماوس مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. معا، وهذه الأساليب هي كافية وضرورية لدراسة الخلل الدهون الكبدية ومقاومة الأنسولين خلال الحمولة الزائدة من المغذيات.

<table><tbody><tr><td>O.C.T compound</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Cholesterol kit</td><td>Fisher&amp;nbsp;Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Collagen type I, Rat tail</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (low glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>dissolve in PBS, 1 mM for stock</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>6-well-plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Magnetic Resonance</td><td>Niumag technology</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>High fat high surcose diet (HFHS)</td><td>Research Diets</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

optimized analysis of in vivo and in vitro hepatic steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

كما هو مبين في الشكل 1A، تم زيادة وزن جسم الفأر إلى 45 ± 1.2 غرام بعد 16 أسبوعا من HFHS التغذية، وهو ما يقرب من 1.5 أضعاف أعلى من مجموعة التغذية الحمية تشاو. تكوين هيئة NMR تحليلات تظهر كتلة الدهون والكتلة الخالية من الدهن من الفئران يشار إلى (الشكل 1B). تم تحديد توزيعات الدهون في الجسم كله ومن الكبد عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي، وأظهرت الصور التمثيلية الزائفة اللون في العيش، والفئران واعية في الشكل 1C-D. تم قياس وزن الجسم والجسم تكوينها وتصور أثناء عملية التغذية الحمية HFHS. لمزيد من تشريح الظواهر steatotic، تمت التضحية الفئران ويقوم على التحليل النسيجي الكبد. وترد تلطيخ H &amp; E وزيت الأحمر يا للكبد في الشكل 2A-B، التي قطرات الدهون تنمو أكبر وتحتل المساحات في معظمخلايا الكبد بعد 4 أشهر من HFHS التغذية الحمية. هو تصور درجة تشحم الكبد من HFHS النظام الغذائي بتغذية الفئران بسهولة عن طريق مقارنة مع تشاو الفئران التي تتغذى على النظام الغذائي. تم قياس المكونات الرئيسية من الدهون، مثل الدهون الثلاثية والكوليسترول، مع استخراج الكلوروفورم / الميثانول (الشكل 2C). في الفئران DIO، تسبب الزائد المغذيات الزائدة تراكم الدهون الثلاثية غير طبيعي في الكبد. مع بيانات من الرنين المغناطيسي، التصوير بالرنين المغناطيسي، والتحليل النسيجي، ودرجة ترسب الدهون يمكن تحديد بكفاءة ودقة. كما هو مبين في الشكل (3)، وقد يتسبب في مستويات الدهون في خلايا الكبد الأولية من خلال ارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين لمدة 24 ساعة. تم تحديد قطرات الدهون التي تراكمت النفط الأحمر يا تلطيخ (الشكل 3A)، وكان يستخدم في تحليل الدهون الكمي في وقت لاحق لقياس مستويات الدهون الثلاثية والكولسترول في خلايا الكبد (الشكل 3B). بناء على هذاالنموذج، وآثار التعديل الوراثي أو العلاج الدوائى على توازن الدهون في خلايا الكبد يمكن أن يتم التحقيق بطريقة فعالة وسريعة. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig1.jpg" /> الشكل 1. عالية من الدهون، واتباع نظام غذائي عالية السكروز (HFHS) يزيد السمنة وتشحم الكبد في الفئران. C57BL الذكور من العمر ثمانية أسابيع / غذيت 6 الفئران على طعام أو HFHS النظام الغذائي لمدة 8 أسابيع و 16 أسبوعا، على التوالي. الوزن (A) الجسم من الفئران. تكوين (ب) الجسم من الفئران. (C - D) صورة الممثل الرنين المغناطيسي من الفأرة والكبد. المنطقة البيضاء في الصورة على نطاق والرمادي وتشير الدهون، في حين أن المنطقة الحمراء في الصورة الزائفة اللون تدل على الدهون. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ​​± الخطأ المعياري (SEM)، ن = 5-8. * ف &lt;0.05 مقابل طعام تتغذى غذاء الفئران. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. STATISTICAأجري تحليل ل باستخدام اختبار (ت) لأونبايريد، ثنائي الطرف الطالب. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig2.jpg" /> الشكل 2. تحليل تشحم الكبد في الفئران التي تغذت على نظام غذائي HFHS. C57BL الذكور من العمر ثمانية أسابيع / غذيت 6 الفئران على طعام أو HFHS النظام الغذائي لمدة 8 أسابيع و 16 أسبوعا، على التوالي. (أ) التشكل الإجمالي الممثل من enterocoelia والكبد. (ب) الممثل H &amp; E وزيت الأحمر يا تلطيخ (الحانات نطاق و: 50 ميكرون). النفط الأحمر يا بقع الدهون والدهون محايد، ونقاط حمراء تشير إلى قطرات الدهون المتراكمة في خلايا الكبد. (C) مجموع الدهون الثلاثية والكوليسترول مستويات الاستخراج الدهون في الكبد باستخدام طريقة الكلوروفورم / الميثانول. تم تطبيع البيانات إلى tكان وزن الكبد، وتتمثل كمتوسط ​​± الخطأ المعياري (SEM)، ن = 5-8. * ف &lt;0.05 مقابل الفئران التي أطعمت غذاء طعام. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار (ت) لأونبايريد، ثنائي الطرف الطالب. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55178/55178fig3.jpg" /> هو فعل الشكل 3. كبدي تنكس دهني في خلايا الكبد الماوس الابتدائية تتعرض لارتفاع نسبة الجلوكوز بالإضافة إلى الأنسولين. (A) زيت الأحمر يا تلطيخ للخلايا الكبد الأولية مثقف علاجها بدون أو مع الجلوكوز والأنسولين، كما هو مبين (الحانات نطاق و: 50 ميكرون). وقد تم قياس (ب) مستوى الدهون الثلاثية في خلايا الكبد الأولية وتطبيع تركيز البروتين. يتم تمثيل البيانات مثل ± متوسطالخطأ المعياري (SEM). * ف &lt;0.05 مقابل السيطرة على المجموعة. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام اختبار (ت) لأونبايريد، ثنائي الطرف الطالب. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55178/55178fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis at JoVE.com

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

تحليل الأمثل ل<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; كبدي تشحم

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

15.8K Views.  Chinese Academy of Sciences. Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described. 

Video: Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of the hepatic blood supply is poorly oxygenated portal vein blood derived from the gastrointestinal tract and spleen. Oxygen is delivered to hepatocytes by blood flowing from a terminal branch of the portal vein to a central venule via sinusoids, and this makes an oxygen gradient in hepatic lobules. The oxygen gradient is an important physical parameter that involves the expression of enzymes upstream and downstream in hepatic microcirculation, but the lack of techniques for measuring oxygen consumption in the hepatic microcirculation has delayed the elucidation of mechanisms relating to oxygen metabolism in liver. We therefore used FITC-labeled erythrocytes to visualize the hepatic microcirculation and used laser-assisted phosphorimetry to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels there. Noncontact and continuous optical measurement can quantify blood flow velocities, vessel diameters, and oxygen gradients related to oxygen consumption in the liver. In an acute hepatitis model we made by administering acetaminophen to mice we observed increased oxygen pressure in both portal and central venules but a decreased oxygen gradient in the sinusoids, indicating that hepatocyte necrosis in the pericentral zone could shift the oxygen pressure up and affect enzyme expression in the periportal zone. In conclusion, our optical methods for measuring hepatic hemodynamics and oxygen consumption can reveal mechanisms related to hepatic disease.

An optical system was developed to visualize hepatic microcirculation with FITC-labeled erythrocytes and to measure the partial pressure of oxygen in the microvessels with laser-assisted phosphorimetry. This method can be used to investigate physiological and pathological mechanisms by analyzing microvascular structure, diameter, blood flow velocity, and oxygen tension.

التصور والتحليل من تدفق الدم واستهلاك الأكسجين في دوران الأوعية الدقيقة كبدي: تطبيق نموذج لالتهاب الكبد الحاد

There is a considerable discrepancy between oxygen supply and demand in the liver because hepatic oxygen consumption is relatively high but about 70% of ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

في الجسم الحي 19 F التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع الخليوي

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Measurement of Fatty Acid &#946;-Oxidation in a Suspension of Freshly Isolated Mouse Hepatocytes

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional processes, such as ketogenesis and gluconeogenesis, which are essential to maintain whole-body glucose homeostasis and support extra-hepatic organ function in the fasted state. Fatty acid &#946;-oxidation occurs within the mitochondria and peroxisomes and is regulated through multiple mechanisms, including the uptake and activation of fatty acids, enzyme expression levels, and availability of cofactors such as coenzyme A and NAD+. In assays that measure fatty acid &#946;-oxidation in liver homogenates, cell lysis and the common addition of supraphysiological levels of cofactors mask the effects of these regulatory mechanisms. Furthermore, the integrity of the organelles in the homogenates is hard to control and can vary significantly between preparations. The measurement of fatty acid &#946;-oxidation in intact primary hepatocytes overcomes the above pitfalls. This protocol describes a method for the measurement of fatty acid &#946;-oxidation in a suspension of freshly isolated primary mouse hepatocytes incubated with 14C-labeled palmitic acid. By avoiding hours to days of culture, this method has the advantage of better preserving the protein expression levels and metabolic pathway activity of the original liver, including the activation of fatty acid &#946;-oxidation observed in hepatocytes isolated from fasted mice compared to fed mice.

Fatty acid &#946;-oxidation is an essential metabolic pathway responsible for generating energy in many different cell types, including hepatocytes. Here, we describe a method to measure fatty acid &#946;-oxidation in freshly isolated primary hepatocytes using 14C-labeled palmitic acid.

قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا

Fatty acid &#946;-oxidation is a key metabolic pathway to meet the energy demands of the liver and provide substrates and cofactors for additional ...

Biochemistry

تقييم تنكس دهني كبدي مع 3D مضان إعادة بناء قطرات الدهون

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

تسليط الضوء على المؤلف: تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive fat accumulation leads to non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), &#160;which is potentially reversible and may evolve into non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and eventually cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). The molecular mechanisms linking lipid accumulation in hepatocytes with the progression to NASH, irreversible liver damage, fibrosis, cirrhosis, and even HCC still remains unclear. To this end, several in vitro and in vivo models have been developed to elucidate the pathological processes that cause NAFLD. In the present study, we describe a cellular model for the induction of liver vesicular steatosis that consists of DMSO-differentiated human hepatic HepaRG cells treated with the fatty acid salt sodium oleate. Indeed, sodium oleate-treated HepaRG cells accumulate lipid droplets in the cytoplasm and show typical features of steatosis. This in vitro human model represents a valuable alternative to in vivo mice models as well as to the primary human hepatocytes. We also present a comparison of several methods for the quantification and evaluation of fat accumulation in HepaRG cells, including Oil Red O staining, cytofluorimetric Bodipy measurement, metabolic gene expression analysis by qPCR, and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. CARS imaging combines the chemical specificity of Raman spectroscopy, a chemical analysis technique well-known in materials science applications, with the benefits of high-speed, high-resolution non-linear optical microscopies to allow precise quantification of lipid accumulation and lipid droplet dynamics. The establishment of an efficient in vitro model for the induction of vesicular steatosis, alongside an accurate method for the quantification and characterization of lipid accumulation, could lead to the development of early stage diagnosis of NAFLD via the identification of molecular markers, and to the generation of new treatment strategies.

In this study, we describe a detailed protocol for inducing liver vesicular steatosis in differentiated HepaRG cells with the fatty acid salt sodium oleate and employ methods for detection and quantification of lipid accumulation, including coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy, cytofluorimetric analysis, Oil red O staining, and qPCR.&#160;

تحفيز وتوصيف التسيادي الحويصلي في خلايا HepaRG المتمايزة

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Biology

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver disease worldwide due to its relationship with obesity, diabetes type 2, and dyslipidemia. Hepatic steatosis, the accumulation of lipid droplets in the liver parenchyma, is a key feature of the disease preceding the inflammation observed in steatohepatitis, fibrosis, and end-stage liver disease. Lipid accumulation in hepatocytes might interfere with proper metabolism of xenobiotics and endogenous molecules, as well as to induce cellular processes leading to the advance of the disease. Although the experimental study of steatosis can be performed in vivo, in vitro approaches to the study of steatosis are complementary tools with different advantages. Hepatocyte culture in lipid overload-conditioned medium is an excellent reproducible option for the study of hepatic steatosis allowing the identification of cellular processes related to lipid accumulation, such as oxidative and reticular stresses, autophagia, proliferation, cell death, etcetera, as well as other testing including drug effectiveness, and toxicological testing, among many other possible applications. Here, it was aimed to describe the methodology of hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. HepG2 cells were cultured in RMPI 1640 medium conditioned with sodium palmitate and sodium oleate. Importantly, the ratio of these two lipids is crucial to favor lipid droplet accumulation, while maintaining cell proliferation and a moderate mortality rate, as occurs in the liver during the disease. The methodology, from the preparation of the lipid solution stocks, mixture, addition to the medium, and hepatocyte culture is shown. With this approach, it is possible to identify lipid droplets in the hepatocytes that are readily observable by Oil-red O staining, as well as curves of proliferation/mortality rates.

A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium

This protocol is intended to be a tool to study steatosis and the molecular, biochemical, cellular changes produced by the over exposure of hepatocytes to lipids in vitro.

نموذج من Steatosis التجريبية في المختبر: ثقافة الخلية الكبدية في الدهون الزائد مشروط المتوسطة

Metabolic dysfunction-associated fatty liver disease (MAFLD), previously known as non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), is the most prevalent liver ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.

تحليل الأمثل ل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التصور والتحليل من تدفق الدم واستهلاك الأكسجين في دوران الأوعية الدقيقة كبدي: تطبيق نموذج لالتهاب الكبد الحاد

في الجسم الحي ¹⁹ F التصوير بالرنين المغناطيسي لتتبع الخليوي

قياس الأحماض الدهنية β الأكسدة في تعليق خلايا الكبد الفئران المعزولة حديثا

تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

تحليل قطرات الدهون الملطخة بالفلورسنت مع إعادة بناء 3D لتقييم التنكس الدهني الكبدي

تحفيز وتوصيف التسيادي الحويصلي في خلايا HepaRG المتمايزة

تقرير من أكسدة الأحماض الدهنية وتكون الدهون في خلايا الكبد الفأر الابتدائية

نموذج من Steatosis التجريبية في المختبر: ثقافة الخلية الكبدية في الدهون الزائد مشروط المتوسطة

تقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق الجديدة في الجسم الحي لتقييم تطور مرض الكبد الدهني غير الكحولي