Wir möchten Drs danken. Ed und Callaway Marty Usrey dafür, dass wir das Gewebe als Teil einer früheren Studie und Libby Fairless und Shiyuan Liu für die Hilfe bei der neuronalen Rekonstruktionen vorbereitet zu verwenden. und der Whitehall-Stiftung: Diese Arbeit wurde durch die NIH (EY018683 NEI) gefördert.

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Neuroanatomische Studien haben eine Säule der Neurowissenschaft und aktuelle Interesse an connectomics und Struktur-Funktionsbeziehungen blieb die Begeisterung für detaillierte morphologische Charakterisierung von selektiven neuronalen Populationen erneuert. Traditionell haben die neuroanatomische Studien über qualitative Einstufungen von Neuronen in morphologisch unterschiedliche Klassen von Neuronen, die durch Experten Neuroanatomen definiert verlassen. Mit den Fortschritten in den Techniken für Neuronen zu rekonstruieren und morphologischen Daten zu extrahieren, ist es nun möglich, komplexere und quantitative Methoden der Datenanalyse zu nutzen morphologisch unterschiedliche neuronale Klassen in unvoreingenommen zu klassifizieren. In dieser Studie wurde die Schritt-für-Schritt-Verfahren werden für 1) selektives Markieren Hunderte von einzelnen Neuronen unter Verwendung von Virus-vermittelten retrograden Markierungsverfahren skizziert; 2) systematisch zu rekonstruieren Hunderte von einzelnen Neuronen zu bilden, eine umfassende und damit repräsentative Stichprobe von Neuronen innerhalb einer<html> selektive Bevölkerung; und 3) unabhängigen Clusteranalysen mit statistischer Auswertung optimal Cluster von Neuronen in einem selektiven Population zu bestimmen, basierend auf morphologischen Messdaten. Diese Analyseverfahren werden durch die Anwendung unterschiedlicher Clusterverfahren zu einem vorhandenen Datensatz von TRN Neuronen überprüft und wir demonstrieren anhand von drei verschiedenen Bewertungsmethoden, die TRN Neuronen sind optimal in drei morphologisch unterschiedliche Subpopulationen gruppierten. Ein wesentlicher Vorteil der in dieser Studie beschriebenen Protokollen ist ihre Flexibilität. Die G-gelöscht Tollwut-Virus hat sich in Fahr EGFP-Expression in Hunderten von retrograden markierten Neuronen nach der Injektion in eine Zielstruktur wirksam. Das gleiche Tollwut - Virus - Stamm ist ähnlich wirksam in mehreren Arten , darunter Makaken 5, 9, Frettchen (Hasse &amp; Briggs, in Revision) und Nagetiere 7,&quot;&gt; 8. Dementsprechend kann modifizierte Tollwutvirus selektiv genutzt werden , um die vollständige dendritischen arborization Muster jeder Population von Neuronen nach der Injektion in eine Zielstruktur kennzeichnen. Antikörper - Färbung gegen GFP von DAB / Peroxid - Reaktion gefolgt wird empfohlen , da dies verursacht dauerhafte Färbung von markierten Neuronen und ermöglicht Gewebeschnitte unter einem Mikroskop ohne die Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden (die mit längeren Belichtungs fluoreszierende Markierung bleicht). jedoch sind alternative Färbemethoden erhältlich und / oder Fluoreszenz direkt sichtbar gemacht werden kann, falls gewünscht. ein Vorteil des Messens raw Fluoreszenz besteht darin, dass verschiedene Viren Expression verschiedener fluoreszierender Moleküle Antriebs können kombiniert werden, beispielsweise um zu bestimmen, ob Neuronen in mehrere Zielhirnstrukturen projizieren. Darüber hinaus können die oben beschriebenen Schritte auf alle verfügbaren morphologischen Daten angewendet werden kann (beispielsweise Axonen und Dendriten) zu ermöglichen, zunehmend robuster morphologische Klassifizierung von Neuronen. Es ist auch wichtig, dass kleinere Mengen des Tollwutvirus zu beachten, kann auch, um spärlicher retrograden Markierung zu erzeugen, injiziert werden, die für die Rekonstruktion von Axonen neben Dendriten vorteilhaft sein könnte. Ein zusätzlicher Vorteil der Analyseverfahren in dieser Studie umrissen ist, dass mehrere verschiedene clustering Ansätze verwendet und verglichen werden können. Bei jedem Schritt in der Clusteranalyse sind verschiedene Optionen verfügbar between-neuron Distanzen im Parameterraum sowie verschiedene Algorithmen zu berechnen Clustern zu erzeugen. Darüber hinaus sind mehrere Bewertungsmethoden zur Verfügung. Letzteres ist besonders nützlich als ein Mittel optimal clustering zu verifizieren, wie in der repräsentativen Abschnitt Ergebnisse aufgeführt. Zweifellos zusätzliche Algorithmen für Cluster und zur Bewertung der optimalen Clustering Erzeugung zur Verfügung stehen werden, wie das Feld nach vorne bewegt. Gemeinsam werden diese Analyseverfahren zu verbes sernve quantitative Ansätze im Bereich der Neuroanatomie und die Robustheit der Ergebnisse zu verbessern. Es ist in der Automatisierung von neuronalen Rekonstruktionen denn durch Hand Rekonstruktionen einzelner markierten Neuronen sind zeitaufwendig, erfordert Ausbildung und Erfahrung und sind immer noch etwas subjektiv zunehmendes Interesse. Da computergestützte automatische neuronale Rekonstruktionen noch fehleranfällig, Elektronenmikroskopie-basierten neuroanatomischen Daten sind immer noch von Menschen (siehe zum Beispiel 17) analysiert. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass automatisierte neuronale Wiederaufbau in naher Zukunft zur Verfügung stehen wird. Automatisierte neuronale Rekonstruktion erfordert noch mehr Kontrolle über die Datenanalyse Ende, damit die Clusteranalysen und Bewertungsmethoden skizziert hier wird noch wichtiger als das Feld technologisch weiter voran.

Neuroanatomie ist eine der Grundlagen der Neurowissenschaften 1 und aktuelle Interesse an der &quot;connectomics&quot; Begeisterung für das Verständnis der morphologischen Vielfalt neuronaler Populationen und die Verbindungen zwischen bestimmten Neuronen 2 erneuert. Verfahren zur Markierung und Rekonstruktion Neuronen stark mit den jüngsten Innovationen verbessert, einschließlich der genetischen und Virus-vermittelte Schaltung Tracing nähert 3, 4 und ermöglicht umfassendere morphologische Untersuchungen neuronaler Populationen 5. Neben Verbesserungen bei der Markierung einzelner Neuronen wurden quantitative Datenanalysetechniken entstanden auch , dass ermöglichen unabhängige und unvoreingenommene Klassifizierung von Neuronen in verschiedene Subpopulationen basierend auf morphologischen Daten 5, 6. Diese unvoreingenommene Techniken sind eine Verbesserung auf mehr traditional qualitative Klassifikationsverfahren, die den Standard im Bereich gewesen sind seit mehr als einem Jahrhundert. Das Ziel dieser Studie zu skizzieren ist, Schritt-für-Schritt wird die Kombination von virusvermittelten Kennzeichnung von Neuronen in einem selektiven Bevölkerung Groß Rekonstruktionen eines umfassenden Probe dieser Neuronen und quantitative Datenanalyse auf der Grundlage unabhängiger clustering mit statistische Auswertung. Durch die Kombination dieser Methoden beschreiben wir einen neuen Ansatz in Richtung auf die Sammlung und Analyse von Daten neuroanatomischen umfassenden Probenahme und unvoreingenommene Klassifizierung von morphologisch einzigartigen neuronalen Typen innerhalb eines selektiven neuronalen Population zu erleichtern. Als ein Beispiel dieser Methoden beschreiben wir unsere Analyse einer großen Population von Neuronen innerhalb eines einzelnen Sektors des Nucleus reticularis (TRN) des Makaken-Affen. Diese Daten stammen aus einer früheren Studie 7. Verfahren zur selektiven Markierung von Neuronen TRN Projizieren auf die dorsale lateral geniculate Thalamuskern (dCGL) chirurgische Injektion von modifizierten Tollwutvirus mit EGFP kodiert , 4, 8 (siehe Tabelle spezifischer Materialien / Ausrüstung, Zeile 2) skizziert. Dieses modifizierte Tollwutvirus fehlt das Gen, das ein wesentlicher Hüllprotein kodiert, trans-synaptischen Bewegung des Virus zu eliminieren. Sobald das Virus Axonterminalen an der Injektionsstelle eintritt, wirkt es wie ein herkömmlicher retrograder Tracer mit dem wichtigen Vorteil der Fahr EGFP - Expression während der gesamten dendritischen arborization von infizierten Neuronen 5, 9, 10. Dementsprechend wurde dieser G-gelöscht Tollwutvirus selektiv genutzt werden, um zu infizieren und alle neuronalen Population beschriften der Injektion und retrograden Transport. Um eine umfassende Analyse eines spezifischen neuronalen Population durchzuführen, ist es wichtig, aus zu probiereneine breite Verteilung von Neuronen in der Bevölkerung. Weil das Virus-vermittelte Markierungstechnik vollständige intrazellulär produziert &quot;, Golgi-like&quot; füllt vieler Neuronen mit Neuriten bei dem Virus Injektionsstelle ist es möglich, eine sehr große Stichprobe von Neuronen innerhalb des vollen Ausmaß einer Hirnstruktur zu rekonstruieren. Darüber hinaus, da das modifizierte Tollwutvirus zu infizieren und Beschriften große Anzahl von Neuronen, so wirksam ist, ist es möglich, Hunderte von Neuronen pro Tier zu rekonstruieren. Verfahren zur Probenahme 160 Neuronen im gesamten visuellen Sektor der TRN 11, um eine umfassende Stichprobe von dCGL ragende TRN Neuronen zu erzeugen , werden skizziert. Der Prozess einzelnen Neuronen der Rekonstruktion eines Neurons Rekonstruktionssystem mit einem Mikroskop, Kamera und Rekonstruktionssoftware beschrieben. Ebenfalls beschrieben sind Verfahren Positionen einzelner Neuronen innerhalb einer Hirnstruktur (in diesem Fall innerhalb des TRN) zu bestimmen, und der Virusinjektion sit zu überprüfene und ihren Standort innerhalb einer Struktur (in diesem Fall innerhalb der dCGL) Volumenkontur Rekonstruktionen. Schritte morphologischen Daten zu exportieren und unabhängige Cluster Durchführung von Analysen auf Basis von morphologischen Metriken für jedes Neuron gemessen beschrieben werden. Es gibt Einschränkungen Clusterverfahren und es gibt auch eine Vielzahl von verschiedenen Clustering-Algorithmen zur Verfügung. Dementsprechend diese Optionen und die Vorteile einiger der häufiger verwendeten Algorithmen werden beschrieben. Die Clusteranalyse liefert keine statistische Überprüfung der Eindeutigkeit von Clustern. Daher sind zusätzliche Schritte skizziert sowie optimale Clustering, um zu überprüfen, wie die Beziehungen zwischen den morphologischen Daten innerhalb und zwischen den Clustern. Statistische Methoden für die Cluster für die TRN-Datensatz bewerten, die TRN Neuronen zu bestätigen sind in drei einzigartige Cluster basierend auf 10 unabhängige morphologische Metriken beschrieben werden. Somit wird durch Schritte zum selektiven Kennzeichnung umreißt, Rekonstruktion und morphologischen Daten aus einer bestimmten neuronalen Population zu analysieren, beschreiben wir Methoden für die innerhalb einer Population morphologische Unterschiede zwischen den Neuronen zu quantifizieren. Vor Ergebnisse verschiedener neuronaler Typen innerhalb des visuellen Bereichs des Makaken TRN mit separaten statistischen Auswertungsverfahren bestätigt. Gemeinsam hoffen wir, diese Techniken zu neuroanatomischen Datensätze breit anwendbar sein und dazu beitragen, quantitative Klassifizierung der Vielfalt neuronaler Populationen durch das Gehirn etablieren.

<table><tbody><tr><td>SAD&amp;Delta;G-EGFP</td><td>E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute</td><td></td><td>Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core</td></tr><tr><td>Recording electrode: platinum/iridium or tungsten</td><td>FHC</td><td>UEPSGGSE1N2M</td><td>Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummod Scientific</td><td>3-000-204, 110V</td><td>Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe</td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5905-50TAB</td><td>3,3&#039;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen - must be bleached before discarding</td></tr><tr><td>Cytochrome C</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2037-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldich</td><td>C9322-5G</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life Technologies/Thermo Fisher</td><td>#A-11122&amp;nbsp;</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit</td><td>Vector Laboratories</td><td>#BA-1000</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Neurolucida System&amp;nbsp;</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida</td></tr><tr><td>Neurolucida Explorer</td><td>MicroBrightField</td><td></td><td>Data export software</td></tr><tr><td>Microfire Camera&amp;nbsp;</td><td>Optronics</td><td></td><td>2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf</td></tr><tr><td>Nikon E800 Microscope</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com</td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Spreadsheet program</td></tr></tbody></table>

large-scale reconstructions and independent, unbiased clustering based on morphological metrics to classify neurons in selective populations

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion von Neuronen, die mit der Verwendung von unabhängigen und unvoreingenommenen Clustering kombiniert Analysen einen umfassenden Überblick über die morphologischen Merkmale unter einer selektiven neuronalen Population beobachtet zu schaffen. Die Kombination dieser Techniken stellt einen neuartigen Ansatz für die Sammlung und Analyse von Daten neuroanatomischen. Gemeinsam ermöglichen diese Techniken in großem Maßstab, und damit umfassendere, Probenahme selektiver neuronaler Populationen und unvoreingenommene quantitative Methoden etablieren zur Beschreibung morphologisch eindeutige neuronale Klassen innerhalb einer Population. Das Protokoll beschreibt die Verwendung von modifizierten Tollwutvirus, selektiv Neuronen etikettieren. G-gelöscht Tollwut-Virus wirkt wie ein retrograden Tracers folgende stereotaktische Injektion in eine Zielgehirnstruktur von Interesse und dient als Vehikel für die Lieferung und die Expression von EGFP in Neuronen. Eine große Anzahl von Neuronen verwenden diese infiziertTechnik und Express GFP während ihrer Dendriten &quot;Golgi-like&quot; vollständige Füllungen von einzelnen Neuronen zu erzeugen. Dementsprechend verbessert sich die Virus-vermittelte retrograden Tracing Verfahren auf traditionelle farbstoffbasierte Rückverfolgungstechniken durch vollständige intrazelluläre Füllungen erzeugen. Einzelne gut isolierte Neuronen quer durch alle Regionen des Gehirns untersuchten Bereich sind für den Wiederaufbau, um eine repräsentative Stichprobe von Neuronen zu erhalten ausgewählt. Das Protokoll beschreibt Verfahren Zellkörper zu rekonstruieren und dendritischen arborization Muster von markierten Neuronen über mehrere Gewebeschnitte vollenden. Morphologische Daten, einschließlich der Positionen jedes Neuron in der Gehirnstruktur, werden zur weiteren Analyse extrahiert. Standard-Programmierfunktionen wurden verwendet, um unabhängige Cluster Analysen durchzuführen und Cluster-Auswertungen auf Basis von morphologischen Metriken. Um die Nützlichkeit dieser Analysen statistische Auswertung einer Clusteranalyse perfo verifizierenRMED auf 160 Neuronen im Nucleus reticularis des Thalamus (TRN) von Makaken rekonstruiert wurde gemacht. Sowohl die ursprünglichen Cluster-Analyse und die statistischen Auswertungen hier durchgeführt zeigen, dass TRN Neuronen in drei Subpopulationen getrennt werden, jede mit einzigartigen morphologischen Eigenschaften.

Wir haben zuvor gezeigt , dass große Rekonstruktionen von Neuronen in einem selektiven Population ist durchführbar nach der Injektion von modifizierten Tollwutvirus in den dCGL 5. Vor kurzem wurde das gleiche Gewebe 160 Neuronen im visuellen Bereich des TRN zu rekonstruieren verwendet (Bragg et al, Revue;. 2A-B) nach den detaillierten Verfahrensschritte oben beschrieben wurde . In der TRN-Studie, drei einzigartige Cluster von TRN Neuronen wurden auf unabhängige Cluster-Analyse von 10 morphologischen Metriken identifiziert basierend: Zellkörperbereich, Zellkörper Rundheit, medial-laterale Position relativ zum Zentrum des TRN, dorsalen-ventralen Position innerhalb des TRN , die Anzahl der dendritischen Bäume, mittlere dendritische Abstand zu den Knoten, die durchschnittliche Länge der 3. und höherer Ordnung Dendriten, mittleren Winkel von 1. Ordnung Dendriten, mittlere Phasenwinkel der gesamten dendritischen arborization und Winkelabweichung von der zutal dendritischen arborization. TRN Neuronen wurden in äquivalenter Weise in diesen drei Clustern (Abbildung 2C) verteilt. Separate statistische Vergleiche aller 10 morphologischen Metriken über Neuronen in den drei Clustern ergab statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Clustern für alle bis auf zwei der morphologischen Metriken in der ursprünglichen Cluster-Analyse einbezogen. Somit basiert auf dem hierarchischen Baum Dendrogramm aus der Clusteranalyse erzeugt (2C) und der separaten statistische Vergleiche der morphologischen Messdaten über Clustern TRN Neuronen aus drei separaten Gruppen klassifiziert. In dieser Studie wollten wir speziell statistische Methoden anzuwenden, um separat Clustern mit Clusteranalyse bestimmt bewerten. Der TRN-Datenmenge aus dem Stand der Studie wurde untersucht, um zu bestimmen, ob die drei beobachteten Cluster waren optimal. Separate zusätzliche Cluster-Analysen, nämlich PCA und GMM clustrier, wurden durchgeführt , um die vorherigen Clusterverfahren (Abbildung 1) zu überprüfen. Drei wichtige Ergebnisse separat überprüfen Sie die vorherigen Clusteranalyse. Erstens, wenn die ursprüngliche Methode der Clusteranalyse ausgewertet wurde mit der &#39;evalclusters&#39; Funktion , um die &quot;Verknüpfung&quot; Funktion Angabe Cluster zu erzeugen, war die optimale Anzahl von Cluster 3, die ursprüngliche Schlussfolgerung auf der hierarchischen Baum dendrogram (2C) auf der Basis entsprechen. Zweitens PCA wurde für 160 TRN Neuronen als alternatives Mittel auf der ursprünglichen Datenmatrix von 10 morphologischen Metriken ausgeführt Neuronen der Gruppierung auf den Beiträgen von morphologischen Metriken. Drei GVM erzeugt wurden, TRN vorausgesetzt Neuronen gruppiert wurden in 1, 2, oder 3 einzigartige Cluster. Die negative Log - Likelihood (NLL) und Akaike Information Criterion (AIC) ergab die niedrigste, und daher sehr informativ, Werte und beide Werte waren optimal , wenn der GMM 3 Cluster verwendet TRN morphologische Daten (Figur zu beschreibene 3). Drittens wurde die GMM-basierten Clustern getrennt ausgewertet unter Verwendung der &#39;evalclusters&#39; Funktion und die optimale Anzahl von Clustern war 3. So Beobachtungen der hierarchischen Baum dendrogram, statistische Vergleiche von morphologischen Metriken über Neuronen getrennt in den drei Clustern, PCA und GMM- basiertes Clustern und separate Auswertungen der einzelnen Clusterverfahren (Verknüpfung und GMM) ergaben alle das gleiche Ergebnis, dass TRN Neuronen optimal in 3 Cluster auf Basis getrennt werden auf den 10 morphologischen Metriken verwendet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55133/55133fig1.jpg" /> Abbildung 1: Datenformat. Beispiel Datenmatrix mit n Zeilen mit der Anzahl von Neuronen entspricht, und m = 5 Spalten auf die Gesamtzahl der unabhängigen Variablen entspricht, in der Clusteranalyse umfassen (enthalten keine Headern in Datenmatrix). Abbildung 2: Unabhängige Clustering von 160 TRN Neurons. A. Linke, Foto einzelner koronalen Schnitt durch die dCGL eines Tieres, gefärbt Aktivität Cytochromoxydase dCGL Schichten und gegen GFP zu visualisieren , um Virusinjektion zu visualisieren. Der Pfeil zeigt die Regionen dichter retrograden markierten TRN Neuronen. § Ausrichtung folgt der dorsalen-ventralen / medial-lateral (DV / ML) Kompass unten und Maßstabsbalken repräsentiert 500 &amp; mgr; m für alle Platten in A. Zweiter von links, Kontur umreißt von dCGL (rot) und TRN (kastanienbraun) für alle Abschnitte der Virusinjektion, die (schwarzen Konturen). Gelbe Sterne zeigen Injektionsstelle Zentren. Orientierung und Maßstabsbalken wie in A. Dritte von links, 3-D - Renderings von Konturen und der Injektionsstelle, Orientierung und Maßstabsbalken wie in A. Richtig, Karten der Standorte der rekonstruierten<html> TRN Neuronen, farbcodiert nach Cluster - Zuordnung (C) innerhalb eines einzigen Aggregat TRN Kontur (kastanienbraun). Orientierung und Maßstabsbalken wie in A. B. Links, aggregieren Konturen TRN (schwarz) und dCGL (grau) mit 5 rekonstruiert TRN Neuronen gefärbt warmen abkühlen entsprechend ihrer medial-lateralen Position innerhalb des TRN. Orientierung nach dem DV / ML Kompass in A, repräsentiert Maßstab 500 &amp; mgr; m. Rechts, Fotos von den gleichen 5 TRN Neuronen mit farblich abgestimmten Maßstabsbalken auf die 100 &amp; mgr; m. C. Hierarchischen Baum dendrogram folgende Clusteranalyse zeigt, Verknüpfung Entfernungen zwischen 160 rekonstruiert TRN Neuronen basierend auf 10 unabhängige morphologische Metriken. Drei Cluster dargestellt in blau, grün und rot. Alle Teile dieser Figur sind aus Zahlen enthalten in Bragg angepasst et al. (In Überprüfung).Lank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55133/55133fig3.jpg" /> Abbildung 3: Cluster - Bewertung. Plot von zwei verschiedenen Kriteriumswerte negative Log-Likelihood (NLL, rot) und Akaike Information Criterion (AIC, blau) erzeugt aus drei GVM unter der Annahme, 1, 2, oder 3-Clustern. GVM mit 3 Cluster bieten die niedrigsten Werte Kriterium. Ergänzenden Code Datei: Beispiel - Code in einer Matlab-kompatiblen Sprache geschrieben, Clusteranalyse auf einem Beispiel Datenmatrix , gefolgt von Cluster - Auswertung mit PCA und GMM Ansätze auszuführen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55133/Briggs&amp;BraggSupplementaryCodeFile.m" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55133/Briggs&amp;BraggSupplementaryCodeFile.m" target="_blank">diese Datei herunterzuladen.</a>

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Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.

Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

large-scale-reconstructions-independent-unbiased-clustering-based-on

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.9K Aufrufe.  Geisel School of Medicine at Dartmouth.  Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen. 

Serie: Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Forschung

Neurowissenschaften

Morphology-Based Distinction Between Healthy and Pathological Cells Utilizing Fourier Transforms and Self-Organizing Maps

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to the site of inflammation and are activated to prevent a further spreading of the invasion. This is also reflected by changes in the behavior and the morphological appearance of the immune cells. In cancerous tissue, similar morphokinetic changes have been observed in the behavior of microglial cells: intra-tumoral microglia have less complex 3-dimensional shapes, having less-branched cellular processes, and move more rapidly than those in healthy tissue. The examination of such morphokinetic properties requires complex 3D microscopy techniques, which can be extremely challenging when executed longitudinally. Therefore, the recording of a static 3D shape of a cell is much simpler, because this does not require intravital measurements and can be performed on excised tissue as well. However, it is essential to possess analysis tools that allow the fast and precise description of the 3D shapes and allows the diagnostic classification of healthy and pathogenic tissue samples based solely on static, shape-related information. Here, we present a toolkit that analyzes the discrete Fourier components of the outline of a set of 2D projections of the 3D cell surfaces via Self-Organizing Maps. The application of artificial intelligence methods allows our framework to learn about various cell shapes as it is applied to more and more tissue samples, whilst the workflow remains simple.

Here, we provide a workflow that allows the identification of healthy and pathological cells based on their 3-dimensional shape. We describe the process of using 2D projection outlines based on the 3D surfaces to train a Self-Organizing Map that will provide objective clustering of the investigated cell populations.

Morphologie-basierte Unterscheidung zwischen gesunden und pathologischen Zellen mittels Fourier-Transformationen und Self-Organizing Maps

The appearance and the movements of immune cells are driven by their environment. As a reaction to a pathogen invasion, the immune cells are recruited to ...

Krebsforschung

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritischer Morphologie in Spalten und Schichten

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described here identifies the basic building blocks of this circuitry. The in-depth studies of cortical regions will ultimately provide other scientists with the circuit components needed for an understanding of how the brain acquires, processes and stores information and what goes wrong in disease, while the electrophysiological and morphological data are widely used by computational neuroscientists in the construction of model networks that explore information processing. The protocol outlined here describes how biocytin-filled cells recorded in the CA2 region of the hippocampus are recovered and then reconstructed in&#160;3D. Additionally, the protocol describes the demonstration of calcium binding protein or peptide content in recorded interneurons.

The protocol outlined here describes the immunofluorescence analysis, biocytin recovery and high-quality reconstructions of hippocampal CA2 interneurons following the intracellular electrophysiological recordings in vitro, allowing neuronal characterization and ultimately fine neuronal anatomy to be studied.

Biocytin Erholung und 3D-Rekonstruktionen der gefüllten Hippocampal CA2 Interneuronen

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

A Method for 3D Reconstruction and Virtual Reality Analysis of Glial and Neuronal Cells

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction of high-resolution imaged stacks to reveal ultrastructural patterns that could not be resolved using 2D images. Indeed, the latter might lead to a misinterpretation of morphologies, like in the case of mitochondria; the use of 3D models is, therefore, more and more common and applied to the formulation of morphology-based functional hypotheses. To date, the use of 3D models generated from light or electron image stacks makes qualitative, visual assessments, as well as quantification, more convenient to be performed directly in 3D. As these models are often extremely complex, a virtual reality environment is also important to be set up to overcome occlusion and to take full advantage of the 3D structure. Here, a step-by-step guide from image segmentation to reconstruction and analysis is described in detail.

The described pipeline is designed for the segmentation of electron microscopy datasets larger than gigabytes, to extract whole-cell morphologies. Once the cells are reconstructed in 3D, customized software designed around individual needs can be used to perform a qualitative and quantitative analysis directly in 3D, also using virtual reality to overcome view occlusion.

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Serial sectioning and subsequent high-resolution imaging of biological tissue using electron microscopy (EM) allow for the segmentation and reconstruction ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Automatic Identification of Dendritic Branches and their Orientation

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology of dendrites is essential for a better understanding of neuronal function. However, the complexity of dendritic trees, both when isolated and especially when located within neuronal networks, has not been completely understood. We developed a new computational tool, SOA (Segmentation and Orientation Analysis), which allows automatic measurement of the orientation of dendritic branches from fluorescence images of 2D neuronal cultures. SOA, written in Python, uses segmentation to distinguish dendritic branches from the image background and accumulates a database on the spatial direction of each branch. The database is then used to calculate morphological parameters such as the directional distribution of dendritic branches in a network and the prevalence of parallel dendritic branch growth. The data obtained can be used to detect structural changes in dendrites in response to neuronal activity and to biological and pharmacological stimuli.

Presented is a computational tool that allows simple and direct automatic measurement of orientations of neuronal dendritic branches from 2D fluorescence images.

Automatische Identifizierung von dendritischen Ästen und deren Orientierung

The structure of neuronal dendritic trees plays a key role in the integration of synaptic inputs in neurons. Therefore, characterization of the morphology ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...