Name: subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
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Ich danke Dr. Vincent Seutin für seine ständige Unterstützung, Telle Gillissen und Laurent Massotte für hervorragende technische Unterstützung, Drs Jean Defourny und Sandra Ormenese für Ratschläge mit dem konfokalen Mikroskop, Dr. Jacques Destiné für das Geschenk des zweiten Axopatch 200B-Verstärker, der GIGA-Imaging Plattform für für kritische Lesen des Manuskripts des konfokalen Mikroskop und Imaris Software und Dr. Stephen Freeman zu teilen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem belgischen FRS unterstützt - FNRS (U.N002.13 und T.N0015.13) und mit Unterstützung der belgischen Universitätsstiftung (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique) veröffentlicht.

Der Autor erklärt , dass er keine konkurrierenden finanziellen Interessen hat.

Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll Dual somatodendritische Ganzzellableitungen und lokale dendritischen Aufnahmen zu implementieren. Es ist nützlich für den Einfluss von Ionenkanälen zu bestimmen (dh I h) auf dem zeitlichen Verlauf der postsynaptischen Potentiale und Abbilden der Verteilung des Ionenkanals (I h) entlang der somatodendritischen Domäne von nigralen DA - Neuronen, respectively. Die resultierenden elektrophysiologischen Messungen kombiniert werden, um hoc histochemistry Post Zellmorphologie zu erholen. Das Verfahren wurde eingesetzt DA Neuronen zu untersuchen, in der Substantia nigra, kann aber für benachbarte nigral GABA-Neuronen verallgemeinert werden, Bereich ventralen tegmental DA Neuronen oder andere midbrain Neuronen. Alle Schritte können auch gefolgt werden , um andere Ionenkanäle untersuchen in Dendriten von nigral Neuronen ohne wesentliche Änderungen zum Ausdruck gebracht. Post - Hoc - Visualisierung ist besonders relevant für Neuronen mit Axon-LagerDendriten, wie nigral Neuronen 25,26, Hippokampus - oriens-alveus Inter 21 oder einigen CA1 Pyramidenneuronen 67. Interessanterweise scheinen Neuronen diese Funktion teilen häufiger zu sein als allgemein 67 gedacht. Morphologische Analyse zeigt auch die genaue Lage der Elektroden und axon. Die Detektion des letzteren können im Axon Anfangssegment (spannungsabhängige Na + -Kanäle oder Ankyrin G) mittels Immunhistochemie 68,69 ausgedrückt durch die Markierung von Proteinen optimiert werden. Die Zuverlässigkeit der Daten mit dendritischen Aufnahmen und anschließender neuronalen Kennzeichnung gesammelt, hängt immer von der Scheibenqualität. Maximale Anstrengung muss daher angewandt werden, um die Lebensfähigkeit von Zellen innerhalb des Gewebes zu erhalten. Dies wird mit schonenden Umgang mit gesunden Tieren, hochwertige Werkzeuge und Reagenzien, ausreichend Sauerstoffversorgung der Gewebe und eiskalten Temperaturen während der gesamten Herstellung von Scheiben erreicht. Stabile Aufzeichnungsbedingungen beruhen auf der Auswahl von gesunden Neuronen. In der whole-cell-Modus sollten Serienwiderstand anfänglich so niedrig wie möglich sein und gewartet werden während des gesamten Experiments konstant. Die Stabilität der Aufnahmen ist weiterhin abhängig von hochwertigen Manipulatoren ohne Drift und Vibrationen. Diese Störungen können durch die Optimierung der Pipette Stabilität reduziert werden: die Verbindung zum Pipettenhalter prüfen und zu heads, Controlling, dass Mikromanipulator Kabel sind schlaff, zu vermeiden plötzliche Änderungen der Temperatur oder Tischbewegung und die Überprüfung der Mechanismus des Manipulators. Für Doppelaufnahmen Methylsulfat- 13,15,21 wurde in der intrazellulären Lösung enthalten, aber Gluconat 9,14,25 können alternativ verwendet werden. Jedoch kann die Haupt Anion das Membranpotential 70,71 und einige spannungsabhängige Ströme 72 verändern. Intrazellulärer Lösung kann mit ATP, GTP und Phosphokreatin zur Erhaltung der Physiolo ergänzt werdengische Funktionen von Neuronen. Zusätzlich einen Fluoreszenzfarbstoff in der Pipettenlösung Zugabe (zB Alexa 594 oder Sulforhodamin 101 41) , um die Dendriten während einer somatischen Aufzeichnung zu visualisieren kann nützlich sein , zum Beispiel eine Druckanwendung zu platzieren (Abbildung 7 in Ref. 41) oder eine elektrische Stimulations Pipette. Die Pipettenlösung für Cell-Attached - Aufnahmen enthält einen hohen K + -Konzentration und keine Na + große I h zu erfassen. Bemerkenswert der Na + / K + Konzentrationsverhältnis beeinflusst die Stromamplitude 10, das Umkehrpotential des Stroms 11 und die Gating von I h 73. Alternativ kann ich h auch außerhalb Outs 10 aufgezeichnet werden. In dieser Aufzeichnungskonfiguration jedoch das intrazelluläre Milieu, in der Nähe der Kanäle gestört werden kann. Folglich Unterschiede in der spannungsabhängige Aktivierung von I &lt;sub&gt; h beobachtet wird beim Vergleich von Strömen mit Cell-Attached - Patches erhalten und außerhalb Outs 10. Anschwellen von Neuronen wird gelegentlich bei der Patch-Clamp - Aufzeichnung auftreten, und stellt sich oft aus verschiedenen Ursachen, wie die geringe Qualität des Wassers, starkes Ungleichgewicht in der Osmolarität oder pH - Wert zwischen dem intra- und extrazellulären Lösungen 39 oder Fehler in der Zusammensetzung der Lösungen. Die Qualität der elektrophysiologischen Ableitungen hat eine direkte Auswirkung auf die Qualität der Morphologie der verwerteten Neuronen. (- 10 MOhm, wie in Refs 6,11. 6) und für einzelne somatische Aufnahmen nach Cell-Attached - Aufnahmen 14 der Verdünnung des intrazellulären Milieu zu minimieren Hohe Beständigkeit somatischen Pipetten werden für Dual - Aufnahmen verwendet. Die Ganzzell-somatischen Aufzeichnung nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung wird deshalb kurz gehalten (&lt;10 min). Outside-out-Patches von sowohl der somatischen und dendritischen Pipetten sind für die ordnungsgemäße Schließen der cell Membran und die anschließende Erholung der Zellmorphologie. Zusätzlich zu der Struktur der Zelle kann der neurochemischen Inhalt für die aufgezeichneten Neuronen 59,74 bestimmt werden. So kann beispielsweise die intrazelluläre Protein - Tyrosin - Hydroxylase immunmarkierten zur eindeutigen Identifizierung von DA - Neuronen 13 werden. DA - Neuronen werden hauptsächlich in der SN pars compacta eingeengt, mit einer viel niedrigeren Dichte in der SN pars reticulata, wo sie sich mit einer höheren Anzahl von GABA - Neuronen 75 miteinander vermischt werden. Während die Zellkörper von DA-Neuronen ist oft größer als der GABA-Neuronen, ist die visuelle Identifizierung dieser Zellen mit IR-Videomikroskopie unsicher und teilweise durch die Opazität der pars compacta behindert. Um diese Einschränkungen, die Vorauswahl von DA - Neuronen umgehen kann durch die Verwendung von transgenen Mäusen , erleichtert werden , um einen Fluoreszenzmarker in einer bestimmten Population von Neuronen (TH 65 oder DAT für DA - Neuronen exprimiert, GADfür GABA-Neuronen) und Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung. Alternativ dazu kann ein Fluoreszenzfarbstoff in der Lösung der somatischen Elektrode eingeschlossen werden, um die Visualisierung von Dendriten zu erleichtern. Verbesserte Auflösung der Fluoreszenzzelle wird durch Nipkow Kreiselscheibenapplikators konfokalen 14,22,30 oder Zwei-Photonen - Mikroskopie 7 kombiniert , um IR-DGC 6 gebracht. Mehrere Vorteile werden DGC im Vergleich zu DIC bezogen. Zunächst wird , wie DIC Prismen nicht erforderlich sind, kann die IR-DGC Bildes mit einem Fluoreszenzbild 49,52,53,76 überlagert werden. Zweitens kann DGC mit Photostimulation kombiniert und Optogenetik 77. Ein Nachteil der Scheibe Vorbereitung ist die Erhaltung der Integrität von Neuronen. DA - Neuronen erweitern ihre Dendriten in den drei Raumebenen 78,79 und damit Verkürzung des dendritischen Fach nicht vollständig in den Scheiben 80 können vermieden werden. Die Wahl der Orientierung der Scheiben (coronal, horizontal oder parasagittal) ist ein Trade-off. Der Ursprung der Innervation und dem experimentellen Design muss berücksichtigt werden, um die richtige Ausrichtung der Scheiben zu wählen. Direkt dendritischen Patching ist die Technik verwendet, um die Verteilung der funktionellen Ionenkanäle in den verschiedenen Kompartimenten von Zellen abzubilden. Darüber hinaus bietet diese Technik die Variabilität in funktionellen Eigenschaften der Kanäle 20 zu bestimmen. Als Ergänzung kann die Position und Dichte von Ionenkanälen ermittelt werden mittels Immunhistochemie an den Licht- und Elektronenmikroskopie Ebenen 17,23. Dieser Ansatz bietet auch die Möglichkeit, die Kanaldichte in kleinkalibrigen Strukturen zu bestimmen, die Patch-Pipetten unzugänglich sind. Jedoch könnten diese Kanäle in einer bestimmten Funktionszustand 24 oder sogar inaktiv im Vergleich zu denen, Patch-Clamp - Techniken aufgenommen werden. Beide Techniken sind daher notwendig, um ein vollständiges Bild von der Lage zu erhalten und die Eigenschaften vonIonenkanäle in einem bestimmten zellularen Bereich 17. Mit der Entwicklung von spannungsempfindlichen Farbstoffen, Spannung Abbildungs verwendet wurde an mehreren Stellen 81 , um die Ausbreitung von APs und EPSPs in Neuronen zu untersuchen. Als Alternative zu Dual-Patch-Clamp-Aufnahmen, kann dieser Ansatz auch für dünne Dendriten implementiert werden, die auf Patch-Pipetten nicht zugänglich sind, aber eine genaue Kalibrierung des Signals und Mitteln erforderlich machen. Während DA-Neuronen im ventral tegmentalen SN und Bereich über somatische Aufnahmen im physiologischen und pathophysiologischen Kontext umfassend untersucht werden, bleibt die funktionellen Eigenschaften ihrer Dendriten in beiden Bedingungen weitgehend unbekannt. Patchen von Dendriten wurde für nigral Dopamin - Neuronen von mehreren Gruppen mit Erfolg 13,25,26 und bleibt die Methode der Wahl zu sezieren erregbar Eigenschaften dieser feinen subzellulärer Strukturen 8 umgesetzt. Dendritische Aufnahmen bieten eine weitere Mögschaft , die Effizienz und die Plastizität der synaptischen Übertragung und die Plastizität der dendritischen Erregbarkeit 82,83 zu prüfen.

Neurone erhalten synaptischen Informationen überwiegend auf ihre Dendriten. Erregenden und hemmenden synaptischen Signale von ihrer Website von Generation zur Integrationsstelle verbreiten, in dem Aktionspotentiale (APs) als Ausgangssignal hervorgerufen werden. Auf ihrem Weg werden synaptische Potentiale beeinflusst sowohl die Struktur der Dendriten und die Wechselwirkung zwischen passiven und aktiven Membraneigenschaften. Die Kombination dieser sehr variablen Parameter erweitert die Rechenleistung von Neuronen 1,2. Jedoch verhindert der geringe Durchmesser von Dendriten jedoch die Untersuchung ihrer elektrischen Eigenschaften. Die kontinuierliche Weiterentwicklung der Patch-Clamp - Technik 3 ist die Optik 4 und Verbesserung von Verfahren zur Schicht Vorbereitung 5 in den letzten Jahrzehnten haben es ermöglicht , Aufnahmen aus sehr dünn (0,7-3 &amp; mgr; m Ø) Dendriten 6,7. Diese Verfahren wurden und werden immer noch verwendet weitgehend die Erregbarkeit von Dendriten in einer Vielzahl zu untersuchen of Neuronen 8. Direkt dendritischen Aufnahmen sind wesentlich die Verteilung 9-19 und Unterschiede in den funktionellen Eigenschaften 20-22 von Ionenkanälen in verschiedenen neuronalen Abteilen zu bestimmen. Diese Daten sind die notwendige Ergänzung der Ionenkanalverteilungen mit Immunhistochemie nachgewiesen kombiniert , um Licht- und Elektronenmikroskopie 23,24. Dual - somatodendritische Aufnahmen wurden implementiert , um die Ausbreitung von Aktionspotentialen 9,13-15,21,22,25-27 und Verbreitung der synaptischen Potentiale 13,16,18 entlang der somatodendritische Domäne von Neuronen zu erforschen, erhalten detaillierte passive Kabelmodelle 28- 30 und die zeitliche Auflösung der neuronalen Integration 31 untersuchen. Die Substantia nigra (SN) ist eine Region, in der Mittelhirns in mehreren Funktionen beteiligt sich beispielsweise die Steuerung der Bewegung, die Codierung von Belohnung und gewohnheitsmäßige Verhalten. Die Abnahme von Dopamin aufgrund der spezifischenVerlust dopaminerger (DA) Neuronen in der SN mit den motorischen Störungen in Patienten , die an Parkinson-Krankheit leiden , beobachtet 32 verbunden. Die nigral Schaltung besteht aus zwei Hauptzelltypen: dopaminergen und GABA-erge Neuronen. Interessanterweise haben diese Neuronen mehrere spezifische Eigenschaften, die sie von anderen Neuronen unterscheiden. Das Axon eines großen Anteils von DA - Neuronen und einigen GABA - Neuronen stammt aus einer dendritischen Ort anzeigt , dass die dendritischen Dorn heterogen ist (Axon-Lager und Axon-fehlt Dendriten) 25,26,33. Die Morphologie dieser Neuronen im Gegensatz daher mit der typischen Organisation von Neuronen in dem die Informationsübertragung das Gesetz der dynamische Polarisation emittiert von Cajal folgt: ausgehend von Dendriten zu soma und schließlich 34 bis Axon. DA - Neuronen sind auch Aktivität zu lösen Dopamin aus ihren Dendriten 35, erzeugen Platzen bekannt 36 und NMDA-Rezeptor Plastizität 37. Die dissection dieser Phänomene ist schwer zu fassen, ohne direkte Aufnahmen von der Stelle, wo sie initiiert werden. Um Einblicke in die Beziehung zwischen den genauen Ort und funktionellen Eigenschaften von Ionenkanälen und ihre Rolle bei der dendritischen Erregbarkeit und Informationstransfer in nigral Neuronen, direkte dendritischen Aufnahmen sind die Methode der Wahl. Dieser Bericht beschreibt ein detailliertes Verfahren , die verwendet werden können Single- und Dual - Patch-Clamp - Aufnahmen von Dendriten nigraler Neuronen und dem entsprechenden Post - hoc - biocytin Kennzeichnung zu erhalten. Die Grundprinzipien für das Patchen der somatischen und die dendritischen Membran sind sehr ähnlich. Praktisch jedoch Aufnahmen von dendritischen Sites erfordern eine gezielte Optimierung im Vergleich zu somatischen Aufnahmen. Erfolgreiche dendritischen Aufnahmen verlassen sich auf die Qualität der Scheiben, eine optimale Anpassung der Optik, sanfte Annäherung der Patch-Pipette und die Stabilität der Aufnahmen.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity &gt;14 M&amp;Omega; cm, ideal 18.2 M&amp;Omega; cm at 25&amp;nbsp;&amp;deg;C, filtered (0.22 &amp;micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilter candles</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Tissue slicer with vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td></tr><tr><td>Tissue slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>cutting parameters: speed 4, frequency 7</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reserve chamber</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;Sekunden Kleber&quot;</td><td>liquid glue</td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Colt&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontic tray wax strips</td></tr><tr><td>Platinum grid</td><td></td><td></td><td>to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>to fire-polish pipette tips</td></tr><tr><td>Potassium methyl sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>high numerical aperture condenser working with oil</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Fourfold-changer</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td>between the camera and the microscope</td></tr><tr><td>Black &amp;amp; white video monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV lines, analog</td></tr><tr><td>Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>to transfer slices from the setup to histology room</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>for the staining of fixed slices</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>mouse anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>working concentration: 1/1,000</td></tr><tr><td>goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>working concentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr></tbody></table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendriten von dopaminergen Neuronen empfangen und vermitteln synaptischen Eingang, Unterstützung Aktionspotential Rückausbreitung und die Freisetzung von Neurotransmittern. Schuppen Licht in diesen Neuronen auf der Informationsübertragung wird diese grundlegenden Funktionen zu verstehen. Dendritische patch-clamp-Aufnahmen bieten die Möglichkeit, direkt auf die elektrischen Eigenschaften von Dendriten und das darunter liegende spannungsgesteuerte Ionenkanäle zu untersuchen. Jedoch sind diese feinen Strukturen nicht leicht zugänglich Patch-Pipetten wegen ihres kleinen Durchmessers. Dieser Bericht beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Verfahren stabile und zuverlässige Aufzeichnungen von den Dendriten von dopaminergen Neuronen in akuten Scheiben zu sammeln. Elektrophysiologische Messungen werden mit Post - hoc - Erholung der Zellmorphologie kombiniert. Erfolgreiche Experimente stützen sich auf eine verbesserte Herstellung von Scheiben, Lösungen und Pipetten, adäquate Einstellung der Optik und Stabilität der Pipette in Kontakt mit der aufgezeichneten Struktur. Standard-Prinzipien somatic Patch-Clamp-Aufzeichnung werden an Dendriten angewendet, sondern mit einem sanfteren Ansatz der Pipette. Diese vielseitigen Techniken können verschiedene Fragen zu den erregbaren Eigenschaften von Dendriten zu adressieren umgesetzt werden.

Das oben beschriebene Protokoll beabsichtigt, die Sammlung von Daten unter Verwendung von dendritischen Patch-Clamp-Aufnahmen zu erleichtern. Diese Technik, kombiniert mit post hoc Histochemie hilft Einblicke in die Mechanismen vieler elektrischer Signale in Dendriten Ursprung oder Ausbreitung zu gewinnen. Direkter Zugriff auf Dendriten mit Patch-Pipetten ist schwierig, aber ein besonderes Augenmerk auf einige methodische Aspekte werden die Erfolgsrate der Aufnahmen zu verbessern. Ein Experimentator ausreichend stabilen somatischen Aufnahme erfahren können damit rechnen, auf die meisten Versuche mit hohem Widerstand (G &amp; Omega;) Dichtungen und vollständige Experimente zu erhalten. Ein bis zwei hochwertige dendritischen Aufnahmen können pro Präparation gesammelt werden. Die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Hirnschnitten mit gesundem somata und Dendriten ist eine Voraussetzung für den Zugriff auf diese feinen Strukturen (Abbildung 1). Die criteriein für diese Neuronen Auswahl sind eine glatte und homogene Oberfläche der ganzen Zelle und einer soma und Dendriten mit geringem Kontrast , wenn sie mit optimal angepasst Optik (1A und 1B) beobachtet. Auswählen von Neuronen zu stark im Allgemeinen führt zu instabilen Aufnahmen (1C und 1C) gegenübergestellt . Daher werden solche Neuronen vermieden werden sollte. Im Vergleich zu anderen Neuronen zeigen nigral DA Neuronen spezifischen morphologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften. Diese Funktionen , die normalerweise mit einem einzelnen somatischen Pipetten beurteilt kann auch in Doppel somatischen (Abbildung 2) und somatodendritischen Aufnahmen (Abbildung 3) beobachtet werden. Lange hyperpolarisierender Strominjektionen induzieren ein Membranpotential Rektifikation genannt &#39;sag&#39; (2B und 5D). Das Axon stammt, in den meisten Fällen auf einer dendritischen Website identifiziert alsVerwendung komplementärer Kriterien 13,25,26, was anzeigt , dass die dendritischen Kompartiment in diesen Neuronen heterogen ist (3A - 3B). Als Folge davon , wo das Fach der AP entspricht beobachtet wird zuerst dem Fach , in dem das Axon (3C - 3D) austritt 13,25,26. Das Axon wird von einem axonalen Bleb verursacht durch eine Schneid des Axons während des Schneidens 64, aber diese Struktur nicht systematisch erfasst im Allgemeinen beendet. Die ausgeprägte sag beobachtet in nigralen DA - Neuronen in Folge der Aktivierung von I h deutet auf eine hohe Expression von HCN - Untereinheiten. Um den Einfluss von I h auf die Integration von synaptischen Signale, synaptic artigen Strom (EPSC) Wellenformen bestimmen wurden über die dendritischen Aufzeichnungselektrode während somatodendritische Dual Aufnahmen 55 (&lt;erzeugt und injiziertstrong&gt; Abbildung 4). Die Kinetik dieser simulierten EPSCs wurden auf den Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des realen spontanen EPSCs basiert. Die sich ergebende aEPSP wurde mit dem somatischen Elektrode aufgezeichnet. Badanwendung der I h blocker ZD 7288 erhöht , um die Dauer der aEPSP, was darauf hinweist , den Beitrag von I h zu den Zeitverlauf der synaptischen Signale (4B). ZD 7288 beseitigt auch das Membranpotential Rektifikation bestätigt , dass die SAG ergibt sich aus der Aktivierung von I h (4C). Die Ergebnisse mit simulierten EPSPe erhalten könnte Experimente korreliert werden unter Verwendung von elektrisch evozierten EPSPe 65. Um die genaue Verteilung des Kanals in der somatodendritische Domäne von DA - Neuronen, Cell-Attached - Aufnahmen Karte implementiert wurden (Abbildung 5). Eine hochohmige Dichtung (&gt;&gt; 1 G &amp; Omega;) ist eine absolute Notwendigkeit für Cell-Attached - Aufnahmen (5B </strong&gt;). In Dendriten von DA - Neuronen aktiviert I h langsam mit langen hyperpolarisierender Spannungsschritten und der Strom im stationären Zustand wird nach Hunderten von ms (5C) erreicht, wie zuvor 66 gezeigt. Diese Beobachtung zeigt , dass HCN - Kanäle in Dendriten von DA - Neuronen haben unterschiedliche Untereinheiten im Vergleich zu denen in pyramidalen Neuronen oder andere Zelltypen exprimiert 10,16,66. Da die Verteilung des Kanals in dem dendritischen Kompartiment inhomogenen sein könnte und als das dendritische Kompartiment selbst heterogen ist, wird die Identität des Dendriten (Axon-Lager oder nonaxon tragenden Dendrit) ergab durch die IR-DGC Bild mit dem konfokalen Bild zu vergleichen nach Biocytin Färbung (3A und B). Wiederherstellung der Zellmorphologie ist daher notwendig, für beide Dual somatodendritische Aufnahmen und für Cell-Attached-Aufnahmen über nachfolgende somatischen Ganzzellableitungen. Abbildung 1. Soma und proximaler Dendriten nigraler dopaminerge Neurone Mit Infrarot - Videomikroskopie sichtbar machen . (A) IR-DGC Bild eines nigral DA Neuron die soma und proximalen Dendriten und beide somatischen und dendritischen Pipetten zeigt. Ein Dual-somatodendritische Aufzeichnung wurde erfolgreich auf diesem gesunden Neuronen durchgeführt. Beachten Sie die niedrigen Kontrast und die glatte Oberfläche der ganzen somatodendritische Domäne der Zelle. (B) Ein weiteres Beispiel für ein gesundes DA Neuron. (C) DA Neuron mit einer raueren und unebenen Oberfläche und einer stärkeren Kontrast. Während ein Doppelaufzeichnung erhalten wurde, war die Stabilität suboptimal und die Aufzeichnungsdauer war kurz (~ 15 min) durch eine allmähliche Zunahme des Zugangswiderstand an beiden Pipetten. (D) zweites Beispiel eines DA Neuron ein stark kontrastierte zeigt soma und proximalen Dendriten. In diesem Fall wurde eine starke Erhöhung der Zugangswiderstand beobachtet kurz nach der Pause in der whole-cell-Modus. Ein Versuch, den Zugangswiderstand durch Unterdruck zu verringern, war nicht erfolgreich. Neurone in Panel C und D können sich während der Schneideverfahren beschädigt wurden und sollte für Versuche vermieden werden. (E) Simultaneous Doppel somatischen Aufzeichnung in einem gesunden DA Neuron zu Beginn der Aufzeichnung. (F) Das gleiche Neuron , wie in Tafel E mit eine geschwollene Zellkörper nach 17 min ~. Notieren Sie sich die vollständige Abwesenheit von Kontrast, die kugelartige Erscheinung des Somas und die Anwesenheit des großen Kern , die nicht offensichtlich in gesunden Neuronen ist. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figur 2. </strong&gt; Simultane Doppel Somatic Aufnehmen von einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild während der Doppel somatischen Aufnahme von einem DA Neuron. (B) hyperpolarisierender und depolarisierende 1 s lang Strominjektionen (-160 bis 80 pA, erhöhen 80 pA) und entsprechenden Spannungsänderungen gleichzeitig mit beiden Patch-Pipetten aufgezeichnet. Beachten Sie das Vorhandensein des Durchhangs in der Spannungsverlauf mit dem langen hyperpolarisierender aktuellen Schritt und die große After-Hyperpolarisation nach dem AP während des depolarisierenden Stromimpuls. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Abbildung 3. Doppel - S omatodendritic Aufnahme in einem DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen dem dendritischen und Somatic Pipette ist 29 &amp; mgr; m. (B) Konfokale Z-Projektionsbild des Neurons in Feld A mit Avidin an Fluoresceinisothiocyanat markiert konjugiert (FITC). Das Neuron wurde während der Aufnahme mit biocytin gefüllt. Das Axon stammt von einem proximalen Dendriten der Nähe des soma , wie durch den Pfeil angezeigt. (C) Simultaneous Dual somatodendritische Ganzzellspannung Aufnahme von dem Neuron in der Abdeckung A. AP im soma (schwarz Spannungsspuren) und Dendriten (rot Spannung aufgezeichnet in Reaktion Spuren) auf eine lange Strominjektions Schritt s 1 über die somatischen (links, schwarz Stromspur) und alternativ dendritischen Pipette (rechts, rot aktuelle Trace) (D) somatische und dendritischen AP in gedehnten Zeitskala angezeigt.. Mit entweder somatischen oder dendritische Strominjektion, die somatische AP (schwarz) voran die dendritische AP (rot). Die Verzögerung zwischen APs in diesem Neuron betrug 120 &amp; mgr; s und 210 &amp; mgr; s mit somatischen und dendritischen Stromeinspeisung sind. Verzögerungenwurden bei AP halb-maximale Amplitude während der Anstiegsphase des AP gemessen. Der AP wird zunächst der Nähe in der Kammer beobachtet , auf die das Axon auftaucht, bestätigt frühere Beobachtungen 25,26. In diesem Fall wird die dendritische Aufnahme von einer Axon-Dendrit fehlt gemacht. Ein Beispiel für eine Aufnahme von einem Axon-Lager Dendriten ist in Ref. 13 (in ihrer Abb. 1). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Ausbreitung von Artificial EPSPe Entlang der somatodendritische Achse des DA Neurone. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron. Der Abstand zwischen der dendritischen und somatische Pipette 45 um. Beide Patch - Pipetten sind in der gesamten Zellenstrom-Clamp - Aufnahmemodus. (B) Strommit der dendritischen Pipette in Current-Clamp aufgezeichnet und verwendet, um die künstliche EPSP (oben) zu erzeugen. (; Τ Zerfalls = 3 ms, Amplitude = 100 pA τ Anstieg = 0,6 ms) über die dendritischen Aufzeichnungspipette 55 wird der Strom durch die Injektion eines EPSC artigen Wellenform erhalten. Am unteren propagierte aEPSPs im SoMa in Kontrollbedingungen (schwarz) aufgezeichnet und nach dem Bad Anwendung des I h - Blocker ZD7288 (30 &amp; mgr; M; rote Kurve). Jede Spannungsverlauf ist der Mittelwert von 40 Einzel fegt. Beachten Sie die große Zunahme der EPSP Dauer in Gegenwart von ZD7288 anzeigt , den Beitrag von I h zu dem zeitlichen Verlauf der EPSPs. (C) Spannungs Spuren von Soma in Kontrollbedingungen aufgezeichnet (schwarz) und nach der Anwendung von 30 uM ZD 7288 ( rot) in Reaktion auf einen langen (30 pA; 1 s) Hyperpolarisieren aktuellen Schritt. Bemerke die Abwesenheit des Membranpotentials Rektifikation (SAG) nach der Blockierung des I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Abbildung 5. Das Vorhandensein von I h in Dendriten von DA Neuron. (A) IR-DGC Bild eines DA Neuron und Pipette auf proximalen Dendriten. (B) Kapazitive und Leckströme während einer 5 mV Spannungsbefehl in Cell-Attached - Konfiguration. Der Dichtungswiderstand betrug 5 GOhm in diesem Beispiel (C) hyperpolarisierender Spannungsstufe. (90 mV; oben) aus einem Membranpotential von 0 mV einen langsam aktivierenden I h induziert. Die aktuelle Spur wurde umgedreht und mit einer einzigen Exponentialfunktion ausgerüstet , der eine Zeitkonstante von τ = 632 ms zu geben. (D) SpannungAntworten der whole-cell aufgezeichnet soma (Panel A) bis 1 s hyper- und depolarisiert Stromimpulse (-160 bis 120 pA, 40 pA Inkrement). Die somatischen Ganzzell Aufnahme wurde nach dem Cell-Attached-Aufzeichnung durchgeführt. Beachten Sie die Abwesenheit von APs durch die extrazelluläre Applikation von TTX und Cd 2+ spontane Zündung während Cell-Attached - Aufzeichnung zu unterdrücken. Diese spannungsgesteuerten Na + und Ca 2+ Strom - Blocker wurden hinzugefügt Aktionsströme zu unterdrücken. Platten A - D von gleichen Neurons (E) IR-DIC Bild eines anderen Neurons DA und einer dendritischen Pipette (F) spannungsabhängig von einem Testimpuls auf 0 mV von einem 50 ms Vorimpuls bei -120 mV aktiviert Ströme.. in einem Outside-out von dem proximalen Dendriten der Neuronen in der Platte E. Haltepotential -80 mV ausgeschnittenen Patch. Notieren Sie sich die zeitabhängige Inaktivierung des Stroms. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um ein</a> , <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">um zu vergrößern</a>Version dieser Figur. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7,305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 1 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 310 mOsmol / L (optimale Reichweite: 314-325 mosmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Artificial Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5,084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137,99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Saccharose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Saccharose-ACSF vorzubereiten Scheiben schneiden. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> für 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3,803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocytin </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 mit KOH eingestellt </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Intrazelluläre Lösung für Dual - Aufnahmen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substanz </td><td> g / mol </td><td> Konzentration </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (Lösung) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mM </td><td> 0,3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarität: ~ 290 mOsmol / l, eingestellt mit D-Glucose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Elektroden Lösung für Cell-Attached - Aufnahmen.

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Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Serie: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Forschung

Biochemie

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Die Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert in Rat Mittelhirn dopaminergen Neuronen Mit der Dynamic-Clamp-Technik

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Neurowissenschaften

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Profiling Voltage-gated Potassium Channel-mRNA Expression in nigralen Neuronen mit Einzel-Zell RT-PCR-Techniken

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Single Cell Messung der Freisetzung von Dopamin mit gleichzeitiger Voltage-Clamp-und Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Einzelne Zelle Multiplex reversen Transkription Polymerase-Kettenreaktion nach Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Ein-Kanal-Cell-Attached-Patch-Clamp-Aufnahme

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biologie

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Patch-Clamp-Aufzeichnungen vom Dendriten eines dopaminergen Neurons in einem Hirnschnitt

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

Perforierte Patch-Clamp-Aufnahmen von sensorischen Neuronenzellkörpern des Innenohrs

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Imaging and Optical Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.