Die Autoren möchten die National Institutes of Health-NHLBI für das Programm Projektstipendium über die Rolle der Eosinophilen in Atemwegsentzündung und Remodeling zu bestätigen: P01HL088584 (PI: N. Jarjour) und der University of Wisconsin Carbone Cancer Center und Department of Medicine für intra-Finanzierung. Wir danken Douglas Annis für die vier STAT3 Varianten klonen.

HINWEIS: Das periphere Blut Eosinophilen empfangen wurden, ohne mit einem Protokoll genehmigt (# 2013-1570) von der University of Wisconsin-Madison Zentrum für Gesundheitswissenschaften Institutional Review Board Informationen in Übereinstimmung zu identifizieren. Signed informierte Zustimmung von dem Spender wurde für die Verwendung von jeder Probe in der Forschung erhalten. 1. Erstellen von Plasmiden als Vorlage Standards <ol><li> Erstellen Primer für eine Amplicon über beide STAT3 - Spleißstellen, mit 5 &#39;KpnI und NheI Restriktionsstellen (und 5&#39;-Erweiterungen) gemäß Tabelle 1a. HINWEIS: KpnI und NheI - Stellen wurden ausgewählt , um Einsätze ermöglichen , mit Kanamycinresistenz 25,26 ligiert in einen modifizierten pET-28a Vektor werden KpnI - Stelle wurden in die multiple Klonierungsstelle eingefügt.. </li><li> Verwendung von frisch gespendeten Eosinophilen, bereiten Doppelproben von 2,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium). Inkubieren für 1 Stunde bei 37 ° C unter 5% CO 2 und 10% Luftfeuchtigkeit. <ol><li> Bereiten komplementären (c) DNA aus Proben (mindestens 1 x 10 6 Zellen pro Zubereitung) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der RNA - Extraktion und cDNA - Synthese - Kits. </li></ol></li><li> Aus Vorlage cDNA in Schritt 1.2.1 vorbereitet, verstärken STAT3 Splice - Varianten Amplifikation unter Verwendung von PCR gemäß Tabelle 2a. </li><li> Resolve Amplikons in 2% igen Tris-Acetat-Ethylendiamintetraacetat (TAE) Gel 27. Excise Banden aus dem Gel und reinigen nach Gel Exzision Kit Anweisungen. </li><li> Cut Amplicons und Plasmid mit geeigneten Restriktionsenzymen (Übersicht von Restriktions in Referenz 27), unter Verwendung von Mengen, Inkubationszeiten und Temperaturen durch Enzym Anbieter empfohlen; und zu reinigen, wie in Schritt 1.4. Ligieren beschränkt Amplikons in das Plasmid unter provider empfohlenen Bedingungen. </li><li> Bereiten Sie einen negativen Fortsetzungrol (restricted Plasmid-DNA ohne Einsatz aber mit Ligase) und eine positive Kontrolle (frei Plasmid mit Kanamycin-Resistenz). Führen Sie Standard - Plasmid - Transformationen von kompetenten E. coli DH5a 28 unter Verwendung Ligasierungsgemische 27. </li><li> Inkubieren transformierte E. coli in 1 ml Luria-Broth (LB) -Medium (hergestellt wie instruiert 27) bei 37 ° C für 1 h Schütteln. Spread-Transformanten auf LB-Platten, die 50 ug / ml Kanamycin und über Nacht bei 37 ° C inkubiert. </li><li> Wählen Sie mehrere Kolonien aus den STAT3 α und β STAT3 Platten mit sterilen Zahnstochern 27. Übertragen Sie jeweils 2 ml LB. Wachsen Kulturen über Nacht bei 37 ° C in einem Schüttelinkubator. </li><li> Reinige Plasmide aus Bakterienkulturen durch folgenden Anweisungen in einem DNA-Reinigungs-Kits zur Verfügung gestellt. Shop Plasmide bei -20 oder -80 ° C. </li><li> Sequence-Plasmide aus mehreren Kolonien, die durch 20 &amp; mgr; l Reaktionen, Sequenzierung vorbereitet. Pipette 3ul-Sequenzierungsreaktionspuffer, 2 ul-Sequenzierungsreaktionsmischung, 12 &amp; mgr; l Reinstwasser, 1 &amp; mgr; l Plasmid als Matrize und 2 ul Sequenzierungsprimer. HINWEIS: Wenn pET-28a Vektor, verwenden Sequenzierungsprimer 5&#39;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 &#39;. <ol><li> Beurteilen Sie Elektrophoretogrammen der Plasmide kodieren , jede Variante: Sα, Sβ, ΔSα und ΔSβ 25. </li></ol></li><li> Messen Konzentration reiner Plasmid-DNA in ng / ul. Wenn die Absorption bei 260 nm Lesen mit einem Spektralphotometer, DNA - Konzentration mit dem Beer-Lambert - Gesetz 29 berechnen: <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq1.jpg" /> Wobei c = Konzentration, A = Absorbanz, ε (Extinktionskoeffizient) = 0,02 (&amp; mgr; g / ml) -1 cm -1 für doppelsträngige DNA und L = Weglänge von Licht (üblicherweise 1 cm). </li><li> Mit Hilfe der Molekulargewichte von STAT3 Spleißvariante cDNA Uhrplicons und der Vektor, berechnen die Kopienzahl pro ul. HINWEIS: Das Molekulargewicht pro Basenpaar (bp) als 650 Da geschätzt. <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq2.jpg" /></li></ol> 2. Analysieren Primer Spezifität für Absolute qPCR <ol><li> Vorbereitung 1 in 10 Verdünnungsreihe von STAT3 Plasmiden mit ~ 10. August-10. März Kopien pro &amp; mgr; l (20 &amp; mgr; l) unter Verwendung von Reinstwasser. Messen Konzentration der meisten konzentriert (~ 10 8 Kopien pro ul finden Sie in Schritt 1.11). </li><li> Verwenden verdünnt Plasmide vier &quot;non-target&quot; Mixe vorzubereiten (dh., STAT3 ΔSβ negative Kontrolle , die gleiche Konzentrationen von STAT3 Sα, ΔSα, Sβ aber keine ΔSβ) bei 10 6 Kopien pro ul jeder. Bereiten Sie ein &quot;Ziel&quot; Mischung mit gleichen Konzentrationen aller vier Vorlagen jeweils bei 10 6 Kopien pro ul. </li><li> Bereiten Primerpaar Lösungs für jede Splice - Variante ( siehe Tabelle 1b und siehe Abbildung 1) , indem ~ 60 ul Primer jeweils bei einer 7 &amp; mgr; M - Konzentration (Endkonzentration in der Probe werden 560 nM sein). </li><li> Verdünnen DNA - Polymerase / dsDNA-bindenden Farbstoff - Mix 7: 5 mit reinem H 2 O. </li><li> Richten Sie Assay 1 in einer 96-Well - PCR - Platte wie in Vorlage (Tabelle 3) gezeigt. <ol><li> In 21 ul verdünnte DNA - Polymerase / dsDNA-bindenden Farbstoff - Mix, dann 2 ul Primer - Mix und 2 ul - Vorlage (gemäß Tabelle 2b). Statt Vorlage, fügen Sie 2 ul gefiltert H 2 O auf die keine Vorlage Kontrolle (NTC) gut. Richten Sie Reaktionen in doppelter Ausfertigung zu bewerten Wiederholbarkeit 30. </li></ol></li><li> Seal qPCR Platte mit Klebstoffabdeckung und Zentrifuge für 5 min bei 1200 × g bei 12 ° C. </li><li> Bei der Verwendung von Software , die auf Materialien aufgeführt, setzen Sie up - Experiment , wie beschrieben. <ol><li> Schalten Sie qPCR Maschine und Einsatz abgedichtet qPCR Platte. Klicken Sie auf Datei &amp;# 62; Neu&gt; Weiter&gt; Wählen Sie &quot;Neu-Detektor&quot;, wählen Sie Reporter, Löscher und Namen angeben. Setzen Sie einen &quot;neuen Detektor&quot; für jede Splice-Variante auf. </li><li> Klicken Sie auf Weiter und einrichten Standards wie aufgefordert auf dem Set Up Probenplatte Seite, um sicherzustellen, Mengen werden in die Tabelle eingetragen und entsprechende Detektoren ausgewählt sind. Klicken Sie auf Finish. </li><li> Radfahren gemäß Tabelle 2b ein. Stellen Sie sicher , dass die Fluoreszenz zu lesen (zu bestimmen Ct) tritt während der 72 ° C Schritt jedes Zyklus. Wählen Sie Ausführen. </li><li> Wenn Lauf abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Registerkarte Ergebnisse&gt; Amplifikationsplot Registerkarte. Bewerten Ausgabe Amplifikationsplot um die Datenqualität zu bewerten (suchen Sie nach einem exponentiellen Plot, wie in Abbildung 2). HINWEIS: Stellen Sie sicher, Verstärkung Plots sind meist exponentiell und dass der Zyklus Schwelle kann bei dem exponentiellen Teil des Grundstücks festgelegt werden. Stellen Sie sicher, NTCs werden nicht verstärkt und andere Standard-Punkte einen niedrigen Ct-Wert mit einem hohen &amp; Delta; Rn demonstrieren. </li><li> export führt zu Tabellenkalkulations-Software, klicken Sie auf Datei&gt; Exportieren&gt; Ergebnisse. </li></ol></li></ol> 3. Bewertung Absolute qPCR Assay Spezifität und Wiederholbarkeit <ol><li> Wiederholbarkeit <ol><li> Verwenden Sie die Daten aus Schritt 2.7.5 Standardabweichung von Ct (Schwellenzyklus für Fluoreszenz) Werte zu berechnen. <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq3.jpg" /> Wobei N = Anzahl der Proben (2 , wenn doppelt durchgeführt), <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq4.jpg" /> = Probe des Ct und <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq5.jpg" /> = Probe Ct bedeuten. Überprüfen Sie, ob die Standardabweichung der Ct - Werte von Duplikaten ≤0.2 ist. Überprüfen Sie, ob Ct - Werte in allen , aber NTC Brunnen sind kleiner als 38. </li><li> Wenn die Wiederholbarkeit ist schlecht optimize Zyklierungsparameter entweder durch Erhöhen oder Verringern Glühzeit. </li></ol></li><li> Plot Logkopie tauber vs Ct - Wert (wie in Schritt 1.12 und hergestellt in Schritt 2.1 bestimmt) eine Standardkurve zu erstellen; wodurch man die folgende Gleichung: <img alt="Gleichung 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq6.jpg" /> Wo y Ct ist, m ist die Steigung, x log (Kopienzahl) und b ist der Schnittwert. HINWEIS: Der R 2 -Wert von der linearen Regression wird ≥0.95 für gute Daten sein. </li><li> Berechnen der Amplifikationseffizienz mit Standardkurve und die Gleichung: <img alt="Gleichung 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq7.jpg" /> HINWEIS: Ziel für Effizienz ≥75%. </li><li> Berechnen Spezifität von qPCR-Assay 1 unter Verwendung von Too-Formel: <img alt="Gleichung 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq8.jpg" /> Wo Δ Ct Too = Ct Ziel - Ct Nicht-Ziel, die Differenz in der Schwellenzykluszahl für spezifische und unspezifische amp beschreibenlification HINWEIS: Die Spezifität sollte vier Größenordnungen übersteigen (dh Spezifität Faktor ≥4.). <ol><li> Wenn Spezifität schlecht ist, zu optimieren, indem Primerkonzentration zu senken. Set up-Assays mit der endgültigen Primerkonzentrationen im Bereich von 100 nm bis 500 nm (wie in den Schritten 2,5-2,7 beschrieben). </li></ol></li></ol> 4. Durchführung Relative qPCR-Assays <ol><li> Behandeln Sie Zellen mit Zytokinen zur Förderung der Transkription. <ol><li> Für frisch gespendeten Eosinophilen, bereiten Doppelproben von 2,5 x 10 6 Zellen / ml in Zellkulturmedium (RPMI 1640 - Medium) und behandle mit 50 ng / ml Interleukin-3 (IL3) und / oder 50 ng / ml Tumornekrosefaktor - α ( TNF &amp; agr;) für die Dauer von 3, 6, 9 und 20 h bei 37 ° C unter 5% CO 2 und 10% Luftfeuchtigkeit. </li></ol></li><li> Bereiten cDNA von Eosinophilen Proben (mindestens 1 x 10 6 Zellen pro Zubereitung) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der RNA - Extraktion und cDNA - Synthese - Kits. </li&gt; <li> Bereiten Sie serielle Verdünnungen von zwei Proben cDNA-Aliquots (Kontrolle oder Ruhe Proben), mit einem Verdünnungsbereich von &quot;1&quot; bis &quot;1 in 1024&quot; Verdünnung. <ol><li> Für die 1: 4-Verdünnung, Pipette 1 ul cDNA und 3 ul Reinstwasser. </li><li> Für die 1 in 16 Verdünnung, Pipette 1 ul der 1 : 4 - Verdünnung und 3 ul Reinstwasser usw. </li></ol></li><li> Richten Sie PCR in 96-Well - Platte mit 25 &amp; mgr; l Reaktionen wie beschrieben Schritte 2,3-2,5 aber mit mehreren Primerkonzentrationen für pan- STAT3 und GUSB (siehe Muster in Tabelle 4). </li><li> Add &quot;neue Detektor&quot; für GUSB und folgen Sie den Schritten 2,6-2,7 unter Verwendung der Zyklusparameter beschrieben in Tabelle 2c. </li><li> Standardkurven erzeugen (siehe Schritte 3.2 und 3.3) zu bestimmen, welche Primer-Konzentrationen in 95-100% Verstärkungseffizienz führen. </li><li> Richten Sie Platte mit vorbereiteten cDNA-Proben (aus Schritt 4.2) und optimierte Primerkonzentrationen(siehe Tabelle 2c für Zyklierungsparameter, Reagenzien und Tabelle 5 96-Well - Platte - Vorlage). </li><li> Führen Sie die Schritte 2,6-2,7. Test wiederholen mindestens einmal und Datenqualität überprüfen. </li><li> Berechnen Sie den durchschnittlichen Ct Wert von Duplikatprobe Cts für beide STAT3 und Housekeeping - Gen GUSB. </li><li> Erhalten Δ Ct - Werte für jede Probe. <img alt="Gleichung 9" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq9.jpg" /></li><li> Bezeichnen Ruhe Probe ( in der Regel niedrigste Konzentration des Transkripts von Interesse hat) als Probe 0 berechnen ΔΔ Ct 31 für jede Probe (hier als Probe X bezeichnet): <img alt="Gleichung 10" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq10.jpg" /></li><li> Berechnen fach-Erhöhung für jede Probe: <img alt="Gleichung 11" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq11.jpg" /></li><li> Reproduzierbarkeit <ol><li> Berechnen Sie den Variationskoeffizienten (CV) der Kopienzahl für pan- STAT3 und GUSB. <img alt="Gleichung 12" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq12.jpg" /> Wobei N = Anzahl der Proben, = Samples berechnet Kopienzahl und = Probe bedeuten. Überprüfen Sie, dass CV jeder Probe (multiple Assays) ist ≤10%. </li></ol></li></ol> 5. Analyse Absolute qPCR Daten für unbekannte Proben <ol><li> Vergleichen Ct - Werte in relativen qPCR erhalten für Housekeeping - Gen GUSB (wie in Schritt 4.9 beschrieben) zu den Proben &quot;cDNA - Konzentrationen in einer Größenordnung sind gewährleisten. <ol><li> Verdünnen cDNA entsprechend (zB wenn die Probe 1 ein Ct - Wert von ~ 17,5 hat, und andere Proben &#39;Ct - Werte sind ~ 21, Probe 1 ist in etwa 2 (21-17,5) = 11 mal konzentrierter Führen Sie eine 1:. 1 - Verdünnung mit Reinstwasser im gleichen Bereich, ohne mehr als nötig verdünnt). HINWEIS: sehr unterschiedlichen Ausgangskonzentrationen wird Bias die lineare Regressionsanalyse (Schritt 4.12). </li></ol></li><li> Richten Sie absolute qPCR-Assay von Proben. Bereiten Assay 2a Vorlage Platte für Sα und Sβ gemäß Tabelle 6; und bereiten Test 2b für ΔSα und ΔSβ gemäß Tabelle 7. Führen Sie Tests wie in den Schritten 2.6-2.7.3 (und Tabelle 2b). Wiederholen Sie Tests mindestens einmal. </li><li> Überprüfen Sie die Datenqualität und Export als 2.7.4-2.7.5 in Schritten beschrieben. </li><li> Richten Sie absolute qPCR 96 - Well - Platte mit 25 &amp; mgr; l - Reaktionen unter Verwendung schwenk- STAT3 - Primer (Primer in Tabelle 1c, Vorlage in Tabelle 8) bei 400 &amp; mgr; M und eine Mischung aus allen vier Plasmiden oder ein einzelnes Plasmid bei aufgelistet Gesamtkonzentrationen. HINWEIS: Effizienz spielt keine Rolle für absolute qPCR, aber die Effizienz dieser Primer Optimierung wichtig für die relative qPCR (Schritt 4). </li><li> Seal qPCR Platte mit Klebstoffabdeckung und Zentrifuge für 5 min bei 1200 × g bei 12 ° C. </li><li> Set up &quot;neue Detektor&quot; für pan- STAT3 wie in den Schritten 2.7.1-2.7.3. </li><li> Richten Sie zum Radfahren Pan- STAT3 gemäß Tabelle 2c (gleiche Bedingungen wie im Verhältnis qPCR). Stellen Sie sicher , dass die Fluoreszenz zu lesen (zu bestimmen Ct) tritt während der 72 ° C Schritt jedes Zyklus. Test wiederholen mindestens einmal Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. </li><li> Überprüfen Sie die Datenqualität und Export (siehe Schritte 2.7.4-2.7.5). <ol><li> Wenn Verstärkung Plots nicht exponentiell sind (siehe Abbildung 2), verdünnte Probe cDNA (1:10) und Test wiederholen , wie beschrieben (Schritt 5.7). </li></ol></li><li> Unter Verwendung der Gleichung der Standardkurve (siehe 3.2, Abbildung 3) und die Ct - Werte von Proben, die Kopienzahl jeder Spleißvariante berechnen und von pan- STAT3 in jeder Probe. <img alt="Gleichung 13" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq13.jpg" /></li><li> Plot log (absolute qPCR Kopienzahl Werte für pan- STAT3 erhalten) vs log (kumulative absolute qPCR Kopienzahl Werte für die STAT3 Splice - Varianten). HINWEIS: Ideal lineare Regression und Neigungswerte würden beide ~ 1. </li><li> Berechnen Wiederholbarkeit (Schritt 3.1) und Reproduzierbarkeit (Schritt 4.13). </li></ol> 6. Zusammenführen von absoluten und relativen qPCR Daten <ol><li> Multiplizieren Sie den Anteil der Variante mit dem Gesamt STAT3 Fold-Anstieg zu berechnen fach-Anstieg jeder Splice - Variante. </li><li> Berechnen Sie die Standardabweichungen (siehe Schritt 3.1.1) der absoluten und relativen Werte zu berücksichtigen, für die Ausbreitung des Fehlers. Bestimmen Sie Standardfehler der Messung (SEM) wie folgt: <img alt="Gleichung 14" src="/files/ftp_upload/54473/54473eq14.jpg" /></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir entwickelten dieses Protokoll, um die Höhe und die Anteile von STAT3 Spleißvariante Transkripte in Eosinophilen und Lymphomzellen und erfahren, ob Zytokinstimulation die Ebenen und Proportionen betroffen zu beurteilen. STAT3 ist von besonderem Interesse wegen seiner pleiotropen und unsicheren Funktionalität mit widersprüchliche Berichte darüber , ob es als ein Onkoprotein oder Tumorsuppressor in Krebs ( beschrieben in Referenz 33). Unterschiede in STAT3 α und β Spleißvariante Funktion zuvor 34,35 und unser Protokoll erleichtert ein Knock-down / re-expression Analyse charakterisiert worden , daß ein Bedarf für ein optimales Verhältnis von S und &amp; Dgr; S Transkripte 19 schlägt. Eine genaue Quantifizierung der unterschiedlichen Splice-Varianten erleichtern weitere Untersuchungen im Zusammenhang heterogenen STAT3 Funktionsvariante Zusammensetzung Spleiß. Das Protokoll integriert absolute und relative qPCR-Daten, die Fähigkeit ab Kombinationsolute qPCR Spleißvariante Proportionen und die relative qPCR zu messen Veränderungen in der Gesamt STAT3 Ausdruck zu berechnen. Dieser Ansatz ermöglicht eine feine Unterschiede in der Sequenz zu unterscheiden und gleichzeitig Splicing-Verhältnisse bei zwei alternativen Spleißstellen mehr als 50 Nukleotide auseinander zu messen. Die Bestimmung der Verhältnisse der Splicingereignisse hätte einzeln nicht die bemerkenswerte Befund ergab , dass ein Co-Splicing - Bias existiert , so dass ΔSβ Spiegel höher als erwartet , wenn Verwendungen der beiden Standorte werden 25 zufällig gespleißt. Entscheidend ist, absolute qPCR mit der Verwendung von Plasmid-Eichkurven wird eine Quantifizierung (bei suboptimaler Wirkungsgrad) von splice Variationen, die in sehr ähnlicher Sequenzen führen. Wir erwarten eine neuartige subtile Spleißen qPCR-Assay sollte etwa zwei Monate in Anspruch nehmen zu optimieren. Die wichtigsten Schritte in der Assay - Entwicklung sind die Schaffung von STAT3 Plasmide bei der Erzeugung von Standardkurven für absolute qPCR verwendet; versuchsweiseBestimmung der optimalen Primersequenzen und Zyklierungsparameter Spezifität und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten; und die Integration der relativen qPCR-Daten, die von der Quantifizierung pan-STAT3-Expression im Vergleich zu GAPDH Ausdruck. Die Korrelation der Kopienzahl quantifiziert durch STAT3 gegen kumulative Quantifizierung Pan- (Sα + ΔSα + Sβ + ΔSβ) zeigt , dass das Protokoll zuverlässige Ergebnisse liefert. Eine Einschränkung der Technik ist die umfassende Validierungsprozess. Es ist notwendig, Intra-Assay-Variabilität (Wiederholbarkeit), Intervariabilität (Reproduzierbarkeit) und Spezifität zu beurteilen. Das Protokoll zeigt Wege numerische Ausgänge für diese Parameter zu erhalten. Wir gelten als Wirkungsgrad ≥75%, Spezifität Faktor ≥4, Variationskoeffizient (Reproduzierbarkeit) ≤10% und Ct Standardabweichung (Wiederholbarkeit) ≤0.2 als geeignete Schwellenwerte 30. Mutationen oder Deletionen in den STAT3-Sequenz Aminosäuren 1-690 nicht discove seinrot durch dieses Protokoll, obwohl sie Splicing Verhältnisse beeinflussen können. Transcript Anteile möglicherweise nicht proportional sein 36 Proportionen proteoform. Da Proben beginnen Mengen an Gesamt-cDNA, absolute qPCR unterschiedliche haben, ist geeignet zum Vergleich Vergleich Kopienzahlen von Splice-Varianten in einer Probe, aber nicht für die Zwischen Probe gekoppelt, es sei denn mit relativ qPCR ein etabliertes Housekeeping-Gen verwendet wird. Das beschriebene Verfahren Konform MIQE qPCR Richtlinien für die Reproduzierbarkeit 30. PCR Zyklusparameter und Primerkonzentrationen müssen möglicherweise geändert werden, reproduzierbare Daten zu erhalten, wenn andere Geräte verwendet wird. Perfekte Spezifität ohne drastisch beeinträchtigen die Effizienz nicht möglich, aber das Ziel amplifiziert effizienter um mehr als vier Grßenordnungen. Lineare DNA ist leichter als Kreis verstärkt. Wenn ein alternatives Plasmid nicht zufriedenstellend Kurven Standard stellt (R 2 &lt;; 0,95), betrachten die Plasmid durch Single-Site-Beschränkung Quantifizierung vor Linearisieren. QPCR Optimierung ist von entscheidender Bedeutung für den Erhalt der Daten von guter Qualität (Abbildung 1). Die meisten qPCR-Protokolle basieren auf zweistufigen Radfahren und Maschinen entsprechend optimiert. Ungleichmäßige Erwärmung des Heizblocks kann in dreistufiger cycling verschlimmert werden, zu einer schlechten Reproduzierbarkeit bei. Die Tests müssen eingerichtet werden unter sterilen Bedingungen mit Filter Pipettenspitzen und Reinstwasser, idealerweise in einem speziellen Laminarströmungsabzug. Da Verunreinigungen zu inkonsistenten Ergebnissen führen können, sollten Tests bis unter sterilen Bedingungen mit Filter Pipettenspitzen und Reinstwasser, idealerweise in einem speziellen Laminarströmungsabzug eingestellt werden. Weitere Informationen über die qPCR - Optimierung finden Sie in Bustin et al. 32 STAT3 Quantifizieren kann in einer Reihe von Zusammenhängen zu mehr Einsicht führen. STAT3 automatisch regelt seine eigenen Ausdruck 37, und die oben beschriebenen Protokoll kann helfenzu klären , ob Verhältnisse von STAT3 Splice - Varianten dazu beitragen , dieses positive Feedback - Schleife zu regulieren. Das Protokoll könnte verwendet werden , Verschiebungen in Spleißvariante Verhältnisse zu untersuchen , wie in Zellen bei unterschiedlichen Dichten 38 oder im Laufe der Entwicklung zu beobachten: es ist bekannt , dass die STAT3 α / β Verhältnis ändert auf der Proteinebene während der Hämatopoese 16. Sundin et al. festgestellt , dass ein Intron single nucleotide polymorphism voreingenommen Spleißen von Exon 12 in STAT3 eines Patienten mit Job-Syndrom 39. Es ist denkbar, dass einer der vielen SNPs, die in den Introns zwischen Exon 21 und 22 oder Exons 22 und 23 können jeweils mit Splicing-Verhältnisse von &amp; Dgr; S / S und α / β beitragen. Der Test könnte dazu verwendet werden , um STAT3 - Transkripte in Krebszellen zu quantifizieren, wo Mutationen oder Veränderungen der Splicing Regulierung Vorspannung an den Splicing 40 einführen kann. Mutationen in Spleißfaktoren (wie SF3B1), wie observed in myelodysplastischen Syndromen 41 kann auch zu Veränderungen führen, die von diesem Protokoll gemessen werden kann. Allgemeiner gesagt, erkennt dieser Ansatz speziell Co-Verband in Spleißen, die mit herkömmlichen RNA-Seq, noch Standard-qPCR nicht möglich ist. Während das Phänomen der sich gegenseitig ausschließe Exon Spleißen Koordination von Spleißen Entscheidungen zeigt, hat sich die Co-Assoziation von anderen Splicingereignisse nicht gut recherchiert. Eine kürzlich beschriebene alternative Verfahren, bei dem RNA-Seq modifiziert wurde , um Volllängen - cDNA zu befragen, schlägt entfernten Spleißereignisse mehr co abhängig sind als bisher 42 gedacht. STAT3 enthält eine Spleißstelle Spender Tandem. Acceptor Tandem - Spleißstellen sind häufiger 43 und die Prinzipien der skizzierten Protokoll als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Assays für die Koinzidenzdetektion von NAGNAG Spleißen und andere Splicingereignisse innerhalb von 200 Nukleotiden dienen könnte. Andere potenliche Anwendungen umfassen die Quantifizierung von Koinzidenz von anderen subtilen Sequenzunterschiede, wie indels oder Doppel / Dreifach - Nukleotid - Polymorphismen 44.

Short-Range (Tandem) alternatives Spleißen, wo alternative Akzeptor oder Spenderstellen in unmittelbarer Nähe zueinander sind, ist häufig bei Säugetieren 1, wirbellose Tiere und Pflanzen 2 3. Es wird geschätzt , dass 20% der Säugetiergenen enthalten alternativen Spleißstellen 2-12 Nucleotide auseinander 4. Viele dieser Seiten sind drei Nukleotide voneinander entfernt und in Ein- oder Ausschluss eines einzelnen Codon führen. Es ist über die Natur der Splicing Regulierung an diesen Stellen 5,6 mit etwas Argumentieren Debatte , dass die Splicing - Motiv Unterschiede so subtil sind , dass die Auswahl stochastischen 7 ist, während andere Regelung ableiten basierend auf Gewebespezifität 8. Tandem Spleißstellenauswahl wurde semi-quantitativ analysiert unter Verwendung modifizierter Kapillarelektrophorese 7 und hochauflösende Gelelektrophorese 8. RNA-Seq (RNA-Sequenzierung) liest, kann verwendet werden, um die Spleiß-Verhältnisse an jeder Spleiß zu quantifizierenStandort. Auf diese Weise RNA-Seq Daten 9 Einblick in die Regulation der Tandem - Spleißstellen vorgesehen. Es wurde auch Vorhersage der erwarteten Splice - Variante Verhältnisse basierend auf Nukleotid Motiv 10 aktiviert. Die meisten der Schwerpunkt auf Spleißen, die ein- bzw. ausschließt ein einziges Codon auf den häufiger vorkommenden Tandem-Akzeptor-Spleißstellen wurde, bekannt als NAGNAGs (wobei N ein beliebiges Nukleotid =). Tandem Spender alternative Spleißstellen mit oder ohne ein einziges Codon (GYNGYN Erkennungsmotiv, wobei Y = Pyrimidin) sind weniger häufig als Tandem in Betracht. Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist ein Schlüssel - Gen unterziehen Tandem Spender alternatives Spleißen 1,11. Die Tandem - Donor - Spleißstellen verbinden Exons 21 und 22 und in der Aufnahme oder Ausschluss des Codons für Serine-701 (S oder &amp; Delta; S jeweils) 1,11 führen. Downstream alternative Akzeptorstellen (40 Nukleotiden voneinander) Verbinden Exons 22 und23a / b Ergebnis bei der Aufnahme entweder der 55 terminalen Reste der Transaktivierungsdomäne (α) oder einer verkürzten Transaktivierungsdomäne mit 7 einzigartigen C-terminalen Reste (β) 11. Daher sind vier Spleißvarianten möglich. STAT3 - Protein ist ein Transkriptionsfaktor und Großsignalintegrator in zahlreichen Zelltypen 12 und wenn sie mutiert seine konstitutive Aktivierung trägt zu mehreren Krebs Phänotypen ( beschrieben in Referenz 13). Job-Syndrom, eine Störung , Immundefizienz durch hohe IgE gekennzeichnet auch durch Mutationen in STAT3 verursacht wird ( beschrieben in Referenz 14). Distinct Rollen für STAT3 α und β - Spleißvariante Proteine wurden zuvor beschrieben 15. Zunächst wurde STAT3 β dachte in einer dominant-negative Art und Weise 16 zu handeln, STAT3 α der Transkriptionsaktivität antagonisieren, aber nachfolgende Arbeit vorgeschlagen es 17 unabhängige Zielgene hat </sup&gt;. Trotz der Subtilität von Tandem Spleißen, gibt es Grund der Abwesenheit oder Anwesenheit von Serine-701 (Ser701) Einflüsse Funktion zu glauben. Nicht nur ist Ser701 in der Nähe von Tyrosin-705 (der Rückstand in STAT3 - Aktivierung 18 phosphoryliert), aber eine aktuelle Studie legt nahe , dass STAT3 S und &amp; Delta; S Splice - Varianten erforderlich sind , sowohl für die Lebensfähigkeit von STAT3-süchtig Diffuse Large B - Zell - Lymphom (DLBLCL) Zellen 19. Die biologische Relevanz bleibt, erkundet zu werden. Da die Spleißvariante Zusammensetzung Funktion beeinflussen können, haben wir versucht, um herauszufinden, ob das Verhältnis von Zytokinstimulation in Eosinophilen gestört wurde. Wir haben versucht , anfänglich unter Verwendung von PCR spezifisch für STAT3 α und β Spleißvarianten, gefolgt von Spaltung der Produkte mit einem Restriktionsenzym spezifisch für die S - Spleißvarianten, AFEI die Verbindung zwischen den beiden Spleißereignisse zu erkunden. Densitometrie der Erzeugnisse muss angegeben Aufnahme von Ser701 war rbeide STAT3 in α und β oughly zehnmal häufiger als seine Auslassung (&amp; Delta; S) (Daten nicht gezeigt). Allerdings ist diese semi-quantitative Ansatz war nicht ausreichend reproduzierbar und nicht effektiv genutzt werden könnten alle vier Splice-Varianten gleichzeitig zu messen. Zu Anteilen von jeder der vier Spleißvarianten zu analysieren, war es notwendig, eine quantitative PCR (qPCR) Protokoll zu schaffen, die tight technischen (mehrere Assays einer gegebenen Probe) ergab repliziert. Relative qPCR beruht auf dem Vergleich eines Gens von Interesse zu einem Standard oder Housekeeping - Gen bekannt bis 20 auf einer bestimmten Ebene ausgedrückt werden und ist geeignet , wenn das Gen von Interesse und Housekeeping - Gen mit ähnlicher Effizienz verstärkt werden. Eine doppelsträngige (ds) DNA-bindenden Fluoreszenz (Cyanin) Farbstoff bindet an PCR - Amplikons 21, und nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen, ausreichende Verstärkung hat Fluoreszenz detektierbar auftrat. Je höher das Ausgangsniveaudes Transkripts, Wert je niedriger die Schwellenzyklus (Ct). Da die Konzentration der cDNA - Präparate unterscheidet, muss man das Transkript der Konzentration mit der Konzentration eines Transkripts auf ein einheitliches Niveau in allen Proben zu exprimierenden bekannt zu vergleichen, wie Glucuronidase-β (GUSB) in Eosinophilen 22. Relative qPCR ist nicht möglich für sehr ähnliche Sequenzen, wie in Spleißvarianten gesehen aus tandem Spleißen. Die strengen Bedingungen erforderlich, um speziell die Splice-Varianten verstärken führen zu einer verminderten Leistungsfähigkeit. Stattdessen muss eine absolute Quantifizierung 23 verwendet werden. Dies führt zu einer Standardkurve mit bekannten Konzentrationen des gespleißten Transkript von Interesse Vorbereitung und Sicherstellung PCR - Bedingungen zu optimieren Spezifität 24. Wie beschrieben, absolute und relative qPCR-Daten für ein bestimmtes Gen kann Verständnis des Gens, das die Expression in einem bestimmten Zelltyp zu informieren, zusammengeführt werden, indieser Fall STAT3 in verschiedentlich angeregt Eosinophilen 25. Hierin wird STAT3 Spleißvariante Quantifizierung mit der Erwartung , beschrieben , dass das Verfahren zur gezielten Studien anderer tandem Spleißereignisse angepasst werden kann. Optimierung war ein langwieriger Prozess, wo mehrere Primerpaare in verschiedenen Konzentrationen und zahlreiche Iterationen der Zyklusparameter wurden im Verlauf von einigen Monaten getestet. Die wichtigsten Merkmale des Protokolls sind die Primer-Spezifität Validierung und Quantifizierung auf Basis von Standardkurven mit bekannten Konzentrationen der Splice-Varianten. Relative qPCR in Verbindung erwies sich als hilfreich für unsere Anwendung ist aber nicht notwendig.

<table><tbody><tr><td>MJ Research PTC-200 Thermal Cycler</td><td>GMI</td><td>N/A</td><td>Used for standard PCR</td></tr><tr><td>7500 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>N/A</td><td>qPCR machine</td></tr><tr><td>GS-6R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>centrifuge for 96-well plates</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 sprectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8758</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>PfuTurbo DNA Polymerase</td><td>Agilent Technologies</td><td>600410</td><td>DNA polymerase for standard PCR</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biosciences</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Qiagen</td><td>330523</td><td>qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNA extraction kit</td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>18080-044</td><td>cDNA synthesis kit</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Integrated DNA Technology</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 1.1</td><td>New England Biosciences</td><td>B7201S</td><td></td></tr><tr><td>GenePure LE Agarose</td><td>ISC BioExpress</td><td>E-3120-500</td><td>component of TAE gel</td></tr><tr><td>Pipettors</td><td>Major lab suppliers (MLS)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filter pipette tips</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10XL, BT20, BT200</td><td></td></tr><tr><td>EU One Piece Thin Wall Plate</td><td>MidSci</td><td>ABI7501</td><td></td></tr><tr><td>ThermalSeal A Sealing Film</td><td>MidSci</td><td>TSA-100</td><td>96 well plate seal</td></tr><tr><td>pET-Elmer (variant of pET-28a)</td><td>Novagen; modified in Mosher lab</td><td>N/A</td><td>Details in PMID: 20947497</td></tr><tr><td>Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system</td><td>Promega</td><td>A1460</td><td>Plasmid purification</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Sequencing kit</td></tr><tr><td>QIAEX II Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td>Amplicon purification</td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; competent cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>available from several providers, see PMID: 2162051</td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Research Products International Corp.</td><td>K22000-5.0</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>component of TAE buffer</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38C-212</td><td>component of TAE buffer</td></tr><tr><td>EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)</td><td>E-5134</td><td>component of TAE buffer</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td>component of Luria Broth</td></tr><tr><td>Bacto Yeast extract, technical</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td>component of Luria Broth</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>component of Luria Broth</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td>component of Luria Broth</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td>component of Luria Broth plate</td></tr><tr><td>Lasergene SeqBuilder</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR)</td></tr></tbody></table>

merging absolute and relative quantitative pcr data to quantify stat3 splice variant transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 nucleotides apart result in either the inclusion (S) or exclusion (&#916;S) of a single residue, Serine-701. Further downstream, splicing at a pair of alternative acceptor splice sites result in transcripts encoding either the 55 terminal residues of the transactivation domain (&#945;) or a truncated transactivation domain with 7 unique residues (&#946;). As outlined in this manuscript, measuring the proportions of STAT3's four spliced transcripts (S&#945;, S&#946;, &#916;S&#945; and &#916;S&#946;) was possible using absolute qPCR (quantitative polymerase chain reaction). The protocol therefore distinguishes and measures highly similar splice variants. Absolute qPCR makes use of calibrator plasmids and thus specificity of detection is not compromised for the sake of efficiency. The protocol necessitates primer validation and optimization of cycling parameters. A combination of absolute qPCR and efficiency-dependent relative qPCR of total STAT3 transcripts allowed a description of the fluctuations of STAT3 splice variants' levels in eosinophils treated with cytokines. The protocol also provided evidence of a co-splicing interdependence between the two STAT3 splicing events. The strategy based on a combination of the two qPCR techniques should be readily adaptable to investigation of co-splicing at other tandem splicing sites.

Gute Qualität qPCR - Daten wird eine S - förmige Amplifikationsplot (Abbildung 2a), was bedeutet , exponentiellen Anstieg der Transkripte im Laufe des Radsports erzeugen. Das Vorhandensein von zu viel Vorlage kann in einem hohen Fluoreszenzhintergrund zur Folge haben, was bedeutet, eine unangemessene Baseline in den ersten paar Zyklen aufgebaut wird. Wenn die Daten nicht bieten eine exponentielle Kurve (2b), eine weitere Optimierung erforderlich ist (umrissen in den Schritten 3.1 und 3.4). Weitere Informationen zur Behandlung von qPCR Ergebnisse finden 32 zu verweisen. Die Standardkurven für die template - Kalibrator Plasmide erzeugt werden , die Effizienz der Amplifikation (Kurve für STAT3 Sα in Figur 3 gezeigt) zeigen. Effizienzen zwischen 83 und 95% wurden unter den beschriebenen Bedingungen beobachtet. Die Gleichung für die Spezifität (Schritt 3.4) geht davon aus gleicher Effizienz, was unwahrscheinlich 25 ist, so die Spezifitätzu sein, ist wahrscheinlich größer als Spezifität Faktor vermuten lässt. Um die Kongruenz der STAT3 Ebenen, die Absolutwerte von jeder der vier Spleißvarianten wurden gemessen , sowie die Höhe der Gesamt STAT3, wobei die letzteren unter Verwendung von Primern Amplifizieren einer Region , die für alle vier Spleißvarianten (Figur 4) zu bewerten. Im Idealfall sollte die lineare Regression (Angabe der Korrelation) und Steigung (Verhältnis von pan- STAT3 zu summierten Splice - Varianten) werden sowohl in der Nähe 1. Die absoluten qPCR - Daten werden dargestellt als Tortendiagramme , die die Anteile der vier Spleißvarianten im Laufe der Zeit nach Stimulation mit Zytokinen (5a) zu zeigen. Ruhen Eosinophilen (0 h) hatte den geringsten Anteil von STAT3 Sα, obwohl diese Variante war immer die häufigste. Multipliziert man den Anteil von STAT3 β Splice - Varianten (S ^6; + ΔSβ) durch den Anteil von STAT3 &amp; Delta; S Splice - Varianten (ΔSα + ΔSβ) ergab durchweg einen Wert , der niedriger als der experimentell aufgezeichneten Wert für ΔSβ. Wenn die Splicingereignisse unabhängig wären, würde man erwarten, dass der Anteil &amp; Delta; S multipliziert Varianten durch den Anteil an β-Varianten würde einen Wert geben, die mit dem experimentell bestimmten Wert übereinstimmt. Höhere ΔSβ als unabhängiger Splicingereignisse erwartet schlägt vor, ein Co-Splicing-Bias existiert. Zusammenführen von absoluten und relativen qPCR - Daten zeigten , dass das Niveau aller STAT3 Splice - Varianten erhöht post-Stimulation mit Zytokinen IL3 und TNFa, mit Ebenen Peaking 6 Stunden nach der Stimulation (5b - e). Für drei der vier Spleißvarianten, Transkript-Spiegel waren in etwa 3-mal höher in IL3 + TNFa behandelten Eosinophilen (6 h), verglichen mit Eosinophilen in Medienzugleich Punkt. waren STAT3 Sα Ebenen 3,5 - mal höher in IL3 + TNFa behandelt Eosinophilen im Vergleich zu Eosinophilen in den Medien zu diesem Zeitpunkt. Die größte Unsicherheit (größten Standardfehler der Messung) wurde in ΔSβ (Figur 5e) zu sehen ist , die die kleinste Bruchteil der gesamten STAT3 in allen Proben umfasst. Dies war nicht überraschend, da geringere Mengen mit höheren Ct - Werten zugeordnet sind. mehr Zyklen erfordert die Schwellenzyklus Unsicherheit wird Verbindung zu erreichen aufgrund Zyklus-zu-Zyklus-Variation in der Effizienz der Amplifikation. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig1.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Primerpaare verwendet qPCR von STAT3 Splice - Varianten und pan-STAT3 auszuführen Primer verwendet , um gezielt jede der STAT3 Splice - Varianten verstärken (Sα, Sβ, ΔSα und ΔSβ beziehungsweise) sind s.hown. Forward - Primer (STAT3 &quot;S&quot; und &quot;&amp; Delta; S&quot;) umfassen den Übergang zwischen den Exons 21 und 22. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig2.jpg" /> Abbildung 2:. Amplification Plots von qPCR - Daten (a) Sigmoidale Verstärkung Plots bedeutet zuverlässige Verstärkung. Diese Daten wurden aus qPCR von zwei seriellen Verdünnungen von Plasmid enthalten STAT3 Sα erhalten, wobei jedes Paar von farbigen Linien , die die Fluoreszenzwerte von doppelten verdünnten Proben im Laufe von 40 Zyklen (x-Achse). Die konzentrierte Probe (grün-grau) wurde vom Zyklus 17 ausreichend verstärkt (mit dsDNA-bindenden Farbstoff proportional zur Fluoreszenz auf der y-Achse gezeigt), um die Fluoreszenzschwellenwert (Baseli überschreitenne als grüner Pfeil dargestellt). Die Ct - Wert wäre 17 (b) Nicht-exponentielle Plots vorschlagen, dass der Hintergrund-Fluoreszenz Schwelle nicht korrekt in den ersten Zyklen gegründet wurde. Dies könnte aufgrund der Anwesenheit eines Inhibitors oder hochkonzentrierte Vorlage oder Primer. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig3.jpg" /> Abbildung 3: Standardkurve des log (Kopienzahl von STAT3 Sα) vs Ct Es besteht eine lineare Beziehung zwischen dem log jedes Zyklus Kopienzahl und der Schwellenwert des STAT3 Spleißvariante (Ct).. Erstellen einer Standardkurve von Plasmid-DNA, die cDNA von Proben Imitate und somitbietet eine bessere Messung als eine Kurve aus verdünnten PCR-Produkte erstellt. Die präsentierten Daten sind Ct - Werte von qPCR von zwei Reihenverdünnungen von Plasmid , das STAT3 Sα erhalten. Aus dieser Kurve kann die Kopienzahl in jeder Probe interpoliert werden, und Verstärkungseffizienz berechnet (83,9%). Obwohl y- fängt weniger reproduzierbar als Steigung sind, schlägt der Schnitt 42,2 Zyklen notwendig wäre derzeit keine Ziel - DNA sicher zu sein , ist. Fehlerbalken zeigen SEM, n = 3. Vergleichbare Kurven wurden für STAT3 Sβ, ΔSα und ΔSβ (nicht dargestellt) ausgebildet ist . <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig4.jpg" /> Abbildung 4: Vergleich der quantifizierten pan- <strong&gt; STAT3 vs kumulative STAT3 Splice - Varianten. Die Regression von zugesetztem STAT3 Spleißvarianten vs insgesamt STAT3 sollte Steigung (Verhältnis von pan- zu kumulativ) und R 2 -Wert (Korrelation) in der Nähe 1. Werte von 17 Proben (Eosinophilen und DLBCL) haben enthalten. Fehlerbalken zeigen SEM von x zu y Bestimmungen, n ≥ 2 für jedes. Abbildung nach Lit. 20. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473fig5.jpg" /> Abb . 5: STAT3 Spleißvariante Ebenen schwankten im Verlauf der Zytokin - Behandlung (a) Kreisdiagramme Prozentsätze jedes STAT3 Spleißvariante anzeigtin Eosinophilen während der Behandlung mit IL3 und TNFa. (B - e) Änderungen in STAT3 Splice - Varianten in Eosinophilen mit verschiedenen Kombinationen von Cytokinen behandelt, gemessen durch die Kombination von relativen und absoluten qPCR Daten STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d) und ΔSβ (e) Ebenen. Zeit nach der Stimulation schwankte über. Levels zunächst erhöht und erreichte 6 Stunden nach der Stimulation. Die IL3 + TNFa Kombination ausgelöst höhere Expression aller vier STAT3 Splice - Varianten als IL3 allein. SEM für jeden Datenpunkt berechnet Bilanzierung für die Ausbreitung des Fehlers. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl1.jpg" /> Tabelle 1:<html> Primer für die Amplifikation verwendet (a), absolut (b) und relativ (c) quantitative PCR. Cloning Primer Restriktionssequenzen und 5&#39;-Erweiterungen für eine effiziente Schneiden. KpnI und NheI Restriktionsstellen sind fett gedruckt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 2" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl2.jpg" /> Tabelle 2. PCR Zyklusparameter (links) und Reagenzienvolumina (rechts) für die Verstärkung (a), bezogen (b), absolut (c) quantitative PCR. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <html> 3 / 54473tbl3.jpg &quot;/&gt; Tabelle 3:. Template für absolute qPCR Plasmid Kalibrierungs Assay Dieser Assay ist notwendig , Reproduzierbarkeit und Effizienz zu bewerten, sowie die Erzeugung von Standardkurven , aus denen Daten zu interpolieren. Die &quot;Nicht-Ziel&quot; Mixes wird eine Schätzung der Spezifität. Die Optimierung kann erforderlich sein , die Konsistenz zu erreichen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 4" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl4.jpg" /> Tabelle 4:. Vorlage für die relative qPCR (pan- STAT3 und Housekeeping - Gen GUSB) Kalibrierung Assay Im Gegensatz zu absoluten qPCR, der Punkt dieses Tests ist es, Bedingungen zu bestimmen , bei der Amplifikationseffizienz ist ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen. <img alt="Tabelle 5" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl5.jpg" /> Tabelle 5:.. Vorlage für die relative qPCR Probe - Test für GUSB schwenk- STAT3 und Housekeeping - Gen Messung Standardkurven werden wiederholt , zusammen mit Proben vergleichbarer Effizienz der Tests zu gewährleisten <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 6" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl6.jpg" /> Tabelle 6: Vorlage für absolute qPCR Probe - Test zur Messung der S - Varianten Standardkurven werden wiederholt , zusammen mit Proben vergleichbar eff zu gewährleisten.<html> izienz der Assays. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl6large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 7" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl7.jpg" /> Tabelle 7:.. Vorlage für absolute qPCR Probe - Test zur Messung von &amp; Delta; S Varianten Standardkurven werden wiederholt , zusammen mit Proben vergleichbarer Effizienz der Tests zu gewährleisten <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54473/54473tbl7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.</a> <img alt="Tabelle 8" src="/files/ftp_upload/54473/54473tbl8.jpg" /> Tabelle 8: Vorlage für absolute qPCR Probe - Test für pan- STAT3 zu messen.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

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Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and &#945;/&#946; C-termini, can be quantified.

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

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14.8K Aufrufe.  University of Wisconsin-Madison. Tandem splicing events occur at sites less than 12 nucleotides apart. Quantifying ratios of such splice variants is feasible using an absolute quantitative PCR approach. This manuscript describes how splice variants of the gene STAT3, in which two splicing events results in Serine-701 inclusion/exclusion and α/β C-termini, can be quantified.

Serie: Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Forschung

Krebsforschung

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Genetik

Adapting 3' Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the traditional method of choice is 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE). Protocols for 3&#39; RACE require the careful design and selection of nested primers within the 3&#39; untranslated region (3&#39; UTR) of the target gene of interest. However, with a few modifications the protocol can be used to include the entire 3&#39; UTR and sequences within the open reading frame (ORF), providing a more comprehensive picture of the relationship between the ORF and the 3&#39; UTR. This is in addition to identification of the polyadenylation signal (PAS), as well as the cleavage and polyadenylation site provided by conventional 3&#39; RACE. Expanded 3&#39; RACE can detect unusual 3&#39; UTRs, including gene fusions within the 3&#39; UTR, and the sequence information can be used to predict potential miRNA binding sites as well as AU rich destabilizing elements that may affect the stability of the transcript.

The two different 3&#39; rapid amplification of cDNA ends (3&#39; RACE) protocols described here make use of two different DNA polymerases to map sequences that include a segment of the open reading frame (ORF), the stop codon, and the entire 3&#39; UTR of a transcript using RNA obtained from different cancer cell lines.

Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Maturation of eukaryotic mRNAs involves 3&#39; end formation, which involves the addition of a poly(A) tail. In order to map the 3&#39; end of a gene, the ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

Quantitative RT-PCR mit hohem Durchsatz in Einzel- und Bulk-C. elegans Proben mit Nanofluidic-Technologie

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides constitutive splicing, alternative mRNA splicing allows the expression of multifunctional proteins from one gene. As interactome studies are generally the first analysis for new or unknown proteins, the association of the bait protein with splicing factors is an indication that it can participate in mRNA splicing process, but to determine in what context or what genes are regulated is an empirical process. A good starting point to evaluate this function is using the classical minigene tool. Here we present the adenoviral E1A minigene usage for evaluating the alternative splicing changes after different cellular stress stimuli. We evaluated the splicing of E1A minigene in HEK293 stably overexpressing Nek4 protein after different stressing treatments. The protocol includes E1A minigene transfection, cell treatment, RNA extraction and cDNA synthesis, followed by PCR and gel analysis and quantification of the E1A spliced variants. The use of this simple and well-established method combined with specific treatments is a reliable starting point to shed light on cellular processes or what genes can be regulated by mRNA splicing.

This protocol presents a rapid and useful tool for evaluating the role of a protein with uncharacterized function in alternative splicing regulation after chemotherapeutic treatment.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. Whether disease-related or functionally selected, many of these mutations have been studied using growth assays in the model organism Saccharomyces cerevisiae (yeast). The splicing-specific copper growth assay, or ACT1-CUP1 assay, provides a comprehensive analysis of mutation at the phenotypic level. The ACT1-CUP1 assay utilizes reporters that confer copper tolerance when correctly spliced. Thus, in the presence of copper, changes in yeast viability correlate to changes in mRNA production through splicing. In a typical experiment, the yeast spliceosome is challenged with different non-consensus splicing reporters and the splicing factor mutation of interest to detect any synergetic or antithetical impact on splicing. Here a full description of copper plate preparation, plating of yeast cells, and data evaluation are given. A selection of complimentary experiments is described, highlighting the versatility of the ACT1-CUP1 reporters. The ACT1-CUP1 assay is a handy tool in the splicing toolbox thanks to the direct read-out of mutational effect(s) and the comparative possibilities from the continuing use in the field.

The ACT1-CUP1 assay, a copper growth assay, provides a quick readout of precursor messenger RNA (pre-mRNA) splicing and the impact mutant splicing factors have on spliceosomal function. This study provides a protocol and highlights the customization possible to address the splicing question of interest.

ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Biochemie

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Biologie

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Zusammenfassung

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Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in