The authors would like to acknowledge Wensheng Liu for invaluable help with cell imaging. This work was supported by grants from the&#160;US National Institutes of Health (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation, and A Sister&#8217;s Hope Foundation.

1. Zellkultur von EMT Induktions Hinweis: EMT kann durch die Behandlung von TGFß oder ektopische Expression von Transkriptionsfaktoren Twist, Schnecke, oder ZEB1 / 2 in Epithelzellen induziert werden. In diesem Protokoll beschrieben ist eine induzierbare EMT-System über die Expression des Twist-ER-Fusionsprotein in verewigt menschlichen Brust Epithelzellen (HMLE / Twist-ER, ein Geschenk von Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Auf 4-Hydroxytamoxifen (TAM) Behandlung transloziert das Fusionsprotein Twist-ER in den Kern, um die Transkription und führt zu einer vollständigen EMT Übergang in 12-14 Tagen 9,11,29 fahren. Zusätzliche EMT induzierbare Systeme, wie HMLE / Snail-ER, HMLE / TGFß und MCF10A / TGFß, finden Sie in unseren früheren Veröffentlichungen 11,30 gefunden werden. <ol><li> Aufrechterhaltung HMLE / Twist-ER Zellen in serumfreiem Brustepithelzellen Zellwachstumsmedium (MEGM) in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2. Durchgang die Zellen alle 2-3 Tage, wenn sie 80% Konfluenz erreichen. Zellen mit 0,15% Trypsin bei 37 ° C für 5-10 min, und anschließend mit Trypsin zu inaktivieren, 5% Kälberserum / DMEM. Spin-down-Zellen und resuspendieren sie in MEGM. Plattenzellen in einer neuen Gewebekulturschale in einem Verhältnis von 1 bis 4 ist. </li><li> TAM in Ethanol auflösen, um eine 200 uM Lösung. TAM schützen vor Licht und bei -20 ° C. Vor Gebrauch frisch TAM in MEGM Medien Hinzufügen bei einer 1: 10.000 Verdünnung auf eine Endkonzentration von 20 nM TAM machen. </li><li> Für die Induktion der EMT, Platte 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in zweifacher Ausfertigung. Kulturzellen mit 20 nM TAM haltigen MEGM Medien. </li><li> Platte 1,6 x 10 6 HMLE / Twist-ER-Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung und Behandlung Zellen mit 0,01% Ethanol als nicht-TAM-behandelten Kontroll. </li><li> Zwei Tage nach der Inkubation, machen Sie Fotos unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung zu morphologischen Veränderungen der Zellen zu erfassen. </li><li> Saugen Sie das Medium aus einem Gericht der Kontrolle oder TAM-behandeltZellen. Waschen Sie die Zellen mit kaltem PBS und Ernte von Zellen Verschrottung Hälfte der Platte in der RNA-Lyse-Puffer für RNA-Isolierung und die andere Hälfte in RIPA-Puffer für die Proteinanalyse. </li><li> Passage-Zellen aus der Steuerung oder TAM-behandelten Gerichten, die von Re-Plattierung 1,6 x 10 6 Zellen in einer 10 cm-Schale in zweifacher Ausfertigung. Kontinuierlich behandeln die Zellen mit 20 nM TAM oder Fahrzeug. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 einmal jeden zweiten Tag bis zum 14. Tag, zu welcher Zeit, TAM-behandelten Twist-ER-Zellen zeigen eine spindelförmige Morphologie mesenchymalen, während Vehikel-behandelten Kontrollzellen pflegen die Kopfsteinpflaster-wie epitheliale Morphologie. </li></ol> 2. Charakterisierung EMT Hinweis: Ein Abschluss der EMT wird angezeigt durch: (1) Handy morphologische Veränderungen von einem pflastersteinartigen epithelialen Morphologie zu einer spindelförmigen Fibroblasten-ähnliche Aussehen; (2) Der Verlust der E-Cadherin-Lokalisation an Zell-Zell-Verbindungen; und (3) Der Schalt Expression von EMT-Marker, die durch den Verlust definiertepithelialen Marker und Verstärkung von mesenchymalen Marker. Zelle morphologische Veränderungen durch Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung im Zeitverlauf der Induktion EMT erfasst, in Abschnitt 1. Immuno-Fluoreszenz-Detektion von E-Cadherin bei Zellen-Übergängen beschrieben, ist in diesem Abschnitt beschrieben. Die Expression von EMT-Marker wird durch Immunoblotting nachgewiesen. Gemeinsamen epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und mesenchymalen Marker umfassen Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin. Allgemeine Vorgänge der Immunoblot werden in Abschnitt 4 beschrieben. <ol><li> Am Tag 12 der Behandlung TAM, Samen 1 x 10 5 Zellen auf einer 12 mm Glaskreisdeckglas in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte gelegt. </li><li> 48 Stunden nach dem Aussäen absaugen mittel-und Wasch Zellen mit vorgewärmter PBS. </li><li> Fix Zellen mit vorgewärmten 4% Paraformaldehyd für 15 min. </li><li> Mit PBS waschen Zellen dreimal. </li><li> Zellen mit 0,2% Triton X-100 in PBS Inkubieren für 15min bei RT. </li><li> Mit PBS waschen Zellen dreimal. </li><li> Zellen in 5% BSA / PBS-Inkubation für 1 h bei RT zu blockieren nichtspezifische Bindung. </li><li> Zellen, die mit dem primären Antikörper E-Cadherin Inkubieren bei 1:50 Verdünnung in 1% BSA / PBS in einer befeuchteten Kammer O / N bei 4 ° C ist. HINWEIS: Der Bereich für primäre Antikörper Verdünnung ist normalerweise zwischen 1:50 und 1: 200, und die optimale Verdünnung für jeden Antikörper sollte experimentell bestimmt werden. </li><li> Dekantiert man die primären Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. </li><li> Zellen mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper inkubieren in einer 1: 500-Verdünnung für 1 h bei RT. Von diesem Schritt auf, schützen die Zellen vor Licht. </li><li> Dekantiert man die sekundären Antikörper und dreimal mit PBS. </li><li> Fleck Zellen mit 0,1-1 g / ml DAPI oder Hoechst für 10 min. </li><li> Spülen Zellen dreimal mit PBS. </li><li> Berg Deckgläschen mit einem Tropfen Eindeckmedium und Deckgläschen Dichtung mit Nagellack. </li><li> Beachten Zellen und nehmenBilder unter einem Fluoreszenzmikroskop 63X. </li></ol> Färbung mit zusätzlichen Antikörpern kann durchgeführt werden, um die EMT-Phänotyp zu bestätigen. Zum Beispiel können N-Cadherin und α-Aktin des glatten Muskels bei einer mesenchymalen Phänotyp 29,31,32 gefärbt werden. Reorganisation des Zytoskeletts Struktur kann durch Anfärben der Zellen mit Phalloidin für F-Actin-11 überwacht werden. Darüber hinaus können Assays auf Zellbeweglichkeit und Zelltod Widerstand durchgeführt werden, um die Eigenschaften des EMT 11 zu prüfen. 3. Nachweis der Splice-Isoformen Mit qRT-PCR-Assays <ol><li> Primer-Design HINWEIS: Primerpaare sollten sorgfältig geplant werden, um unterschiedliche Spleiß-Isoformen zu verstärken. Exon-Skipping, das am häufigsten beobachteten alternatives Spleißen Fall wird hier als Beispiel für die Strategie der Primer-Design veranschaulichen. 1A zeigt einen Vier-Exon-pre-mRNA, wobei das dritte Exon als variable Exon. Einbeziehung von Exon 3 Ergebnisse indie Herstellung eines mehr Spleiß-Isoform, wobei das Exon 3 erzeugt einen kürzeren Spleiß-Isoform. Primer müssen entwickelt, um die Exon-3-Isoform enthalten und Exon-3-Isoform unterscheiden sprungen, und die Gesamt Transkript dieser mRNA zu detektieren. <ol><li> Für den Nachweis von Exons Aufnahme sorgfältig Design eine Vorwärtsprimer innerhalb des variablen Exon 3 und einem Reverse-Primer in der Nähe konstitutive Exon 4, so dass für die spezifische Amplifikation der variablen Exon-Isoform enthalten. Achten Sie darauf, sowohl vorwärts als auch entwerfen und Reverse-Primer innerhalb der gleichen variable Exon, um PCR-Produkte aus genomischer DNA oder pre-mRNA verstärkt zu vermeiden. </li><li> Zur spezifischen Amplifizierung Exon-Skipping-Ereignisse, Design einer der Primer überspannt den Übergang des konstitutiven Exon 2 und Exon 4, die auf andere Weise zerstört würde, wenn variable Exon 3 enthalten sein. Entwerfen der andere Primer in dem konstitutiven Exon 4. Daher werden PCR-Produkte erzeugt, nur wenn der variable Exon 3 excludEd und die konstitutive Exon 2 und Exon 4 werden anschließend miteinander verbunden. </li><li> Um die Gesamt Transkripte des Gens zu erkennen, entwerfen die Primer innerhalb von zwei konstitutiven Exons 1 und 2. So werden PCR-Produkte aus allen Isoformen verstärkt. </li><li> Sicherzustellen, dass die Schmelztemperatur (Tm) für alle Primer in etwa 55 ° C, wobei die Länge jedes Primers etwa 18-22 Nukleotide, und die Größe der PCR-Produkte liegt zwischen 80 und 150 Basenpaaren. </li></ol></li><li> RNA-Extraktion: Auszug RNA mit einer Gesamt-RNA Isolation Kit (siehe Tabelle der Materialien). <ol><li> Sammeln Zellen in 350 ul RNA Lyse-Puffer. </li><li> Fügen Sie 350 ul 70% Ethanol zum Lysat und gründlich mischen. </li><li> Übertragung der Probe auf die Säule zur Reinigung von RNA. </li><li> Zentrifuge bei 10.000 g für 1 min und Durchfluss verwerfen. </li><li> Einmal mit 500 ul Waschpuffer I RNA und RNA zweimal mit Waschpuffer II Die Säule. </li><li> Reste von RNA-WaschpufferII von der Säule durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten. </li><li> Übertragen die Säule in ein neues 1,5-ml-Röhrchen werden 50 ul Nuklease-freies Wasser in der Mitte des Säulenmatrix und Eluieren RNA durch Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit. </li></ol></li><li> Synthese von Erststrang-cDNA <ol><li> Bestimmung der Konzentration und Qualität der RNA durch UV-Absorptionsmessung. HINWEIS: Gute Qualität RNA sollte eine 260 nm / 280 nm Absorptionsverhältnis von etwa 2,0. </li><li> Der reverse Transkriptase (RT)-Reaktionen, die 250 ng Gesamt-RNA, 0,05 ug Zufalls-Hexamer-Primer, 50 pmol MgCl2, 10 pmol dNTP, 2 ul 5 · GoScript Puffer und 1 ul RT-Enzym in einem Endvolumen von 20 ul enthalten eingestellt. </li><li> Führen RT-Reaktionen bei 42 ° C für 1 h, gefolgt von einer Inkubation bei 70 ° C für 5 min, um die RT-Enzym zu inaktivieren. </li></ol></li><li> Echtzeit-PCR <ol><li> Bis 20 ul Reaktionen, die von 10 ul SYBR Green Master Mix bestehen eingestellt,0,1-1,0 ul cDNA-Vorlage, und 5 pmol Vorwärts und Rückwärts-Primer. </li><li> Führen Echtzeit-PCR mit 40 Zyklen der folgenden Schritte: 95 ° C Denaturierung für 10 Sekunden bei 58 ° C Annealing für 10 sec und 60 ° C Extension für 30 Sekunden. Führen PCR-Reaktionen in dreifacher Ausfertigung. </li><li> Überprüfen Dissoziationskurven und stellen Sie sicher, dass ein einzelner Peak ist für jedes Primerpaar beobachtet. </li><li> Erhalten die Werte Quantifizierung Zyklus (CQ) durch die Berechnung der zweiten Ableitung Werte der Verstärkungskurven. </li><li> Berechnen der relativen Menge (RQ) des Ziel-mRNAs in induzierten Proben im Vergleich zu der nicht-induzierten Probe unter Verwendung des &#39;Delta-Delta-Cq (ΔΔCq) &quot;-Methode, wie durch die folgende Formel gezeigt. Verwenden Housekeeping-Gene, wie GAPDH oder TBP, als Referenz. </li></ol></li></ol><img alt="Gleichung 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg" /> Um genauer zu berechnen relativen Werte von Spleiß-Isoformen, ter von mehreren Referenzgenen verwenden sollten berücksichtigt werden. Die Ergebnisse können unter Verwendung eines von Pfaffl et al 33,34 beschriebenen modifizierten Absolutwert Quantifizierungsmethode analysiert werden. 4. Prüfung der Splice-Isoformen auf Proteinebene <ol><li> Sammeln Zellen in 100 ul eiskaltem RIPA-Puffer. </li><li> Stellen Lysate auf Eis für etwa 10 min. </li><li> Zentrifuge bei 14.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln des Überstandes. </li><li> Messung der Proteinkonzentration durch Bradford-Assays. </li><li> Verdünnte Proteinproben in SDS-Beladungspuffer geladen 20-40 ug Proteine ​​in 10% SDS-PAGE-Gelen. </li><li> Führen SDS-PAGE-Gelen bei 20 mA für 1,5 Stunden. </li><li> Transfer-Proteine ​​auf PVDF-Membranen in einer Nasstransfersystem bei 4 ° C für 3 h bei 85 V. Einstellen der Übertragungszeit nach dem Molekulargewicht des Zielproteins. </li><li> Block Membran in 5% fettfreier Milch 30 min bis 1 h bei RT. </li><li> Inkubieren Membran witen einen primären Antikörper bei 4 ° CO / N. Der Bereich für die Primärantikörperverdünnung in der Regel zwischen 1: 200 und 1: 5.000, bestimmen die optimale Verdünnung für jeden Antikörper experimentell. Die Verdünnung der Antikörper in diesem Protokoll verwendet werden, können in &quot;Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte&quot; zu finden. <ol><li> Um Spleiß-Isoformen erkennt, verwenden Sie spezifische Antikörper, die eine bestimmte Isoform zu erkennen. Alternativ können einen Antikörper, der das Epitop im konstitutiven Exon codierenden Region erkennt und erfassen Spleiß-Isoformen gleichzeitig aufgrund ihrer unterschiedlichen Proteingrößen. </li><li> Zur gleichen Zeit, zu überwachen EMT durch Immunoblotting EMT-Marker. Sie können den E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin als epithelialer Marker und Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin als mesenchymalen Marker. </li></ol></li><li> Waschen der Membran dreimal mit TBS-T (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) in einem 5-Minuten-Intervall. </li><li> Inkubieren Membran mit einem HRP-konjugierten sekundären Ameisenibody in einer 1: 10.000-Verdünnung für 1 h bei RT. </li><li> Waschen der Membran dreimal mit TBS-T bei einer 5-min-Intervall. </li><li> Visualisieren Protein mit einem Chemilumineszenz-Detektionssystem und setzen die Membran auf eine Autoradiographiefilm. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht den Nachweis des alternativen Spleißens in einem induzierbaren EMT-Modell. Als solche dynamische Veränderungen der Spleiß-Isoform-Expression im gesamten zeitlichen Verlauf der EMT erfasst werden. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der Verwendung von unterschiedlichen epithelial- oder mesenchymalen-Zelllinien, die für den Vergleich von alternativen Spleißen, weil verschiedene genetische Hintergründe aus un-verwandten Zelllinien konnte mäßig beeinflussen alternative Spleißen. Allerdings muss die erfolgreiche Induktion der EMT sorgfältig bestätigt mit verschiedenen EMT-Marker vor jeder Rückschlüsse auf Veränderungen in alternative Spleißen gezogen werden können. Ferner kann zusätzlich zu dem hier beschriebenen Twist-ER-induzierbare System EMT, EMT andere Systeme wie die von Snail-ER oder TGF induziert werden zur Validierung von experimentellen Befunden 11,30 empfohlen. Das Schalten der Spleiß-Isoformen bei EMT in beiden RNA-und Proteinebene erfasst werden. Splice isoForm-spezifische Antikörper für die Proteinanalyse bevorzugt. Wenn Isoform-spezifischen Antikörper nicht verfügbar sind, können Proteinspiegel von Spleiß-Isoformen auf der Grundlage ihres Molekulargewichts auf SDS-PAGE durch Immunoblotting bestimmt werden. RNA-Ebene von jeder Isoform durch Isoform-spezifischen Primern quantifiziert werden. Mit qRT-PCR-Assays kann die Falte Änderung jeder Isoform sein feinfühlig und präzise bestimmt. Insbesondere wenn experimentellen Materialien beschränkt, wie die Analyse der Expression eines bestimmten Spleiß-Isoform in klinischen Proben liefert qRT-PCR-Analyse, die ein quantitatives Maß für das Fehlen von Isoform-spezifischen Antikörper für die Immunhistochemie kompensieren würde. Das hier beschriebene Verfahren eignet sich zum Nachweis von bekannten Spleiß-Isoform Änderungen während EMT. Darüber hinaus kann dieses Verfahren für die Untersuchung der genomweiten alternativen Spleißen und zur Identifizierung neuer Spleiß-Isoform Schalt während EMT erweitert werden. Um dies zu erreichen,Verwendung eines Großtechnik, wie RNA-Sequenzierung oder tief Spleißen empfindlichen Mikroarray Plattformen könnten unter Verwendung von RNAs, die von der oben beschriebenen induzierbaren EMT Modell isoliert werden. Dennoch ist qRT-PCR Validierung Isoform Veränderungen nach jeder großen Analyse. Zusammenfassend ist das alternative Spleißen dynamisch während EMT, ein Verfahren, die für die embryonale Entwicklung und Tumormetastasierung ist geregelt. In Anbetracht der hohen Frequenz des alternativen Spleißens im menschlichen Genom, ist es wahrscheinlich, dass die Regulierung des alternativen Spleißens spielt eine wichtige Rolle in vielen biologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich der Zelldifferenzierung, Gewebeentwicklung und den programmierten Zelltod 35-41. Die hierin für den Nachweis von Spleiß-Isoformen beschriebenen Protokoll werden für andere Systeme als auch. Zusätzliche experimentelle Modalitäten wie Spleißen Reporter Minigens Assays, BE verwendet werden, um weiter zu untersuchen, die regulatorischen Mechanismen der cis-wirkende Elemente und trans-wirkende Faktoren, die alternative Spleißen 30,42,43 steuern. Weiterhin kann die funktionelle Rolle eines bestimmten Spleiß-Isoform in EMT durch Silencing oder ektopisch die spezifische Isoform exprimieren und Überwachungs EMT Induktion in der beschriebenen EMT-induzierbare System 11 untersucht werden.

Die epitheliale-mesenchymale Transition (EMT) ist ein Entwicklungsprogramm, das Organ Morphogenese und Gewebeumbau während der Embryogenese steuert. Wenn abnorm aktiviert, fördert die EMT Tumormetastasierung und Organfibrose 1,2. Zwingende Studien haben die Bedeutung der transkriptionellen Regulierung während des Prozesses der EMT beschrieben, durch mehrere Transkriptionsfaktoren, wie Verdrehen, Schnecke, und ZEB, die die Expression des Zonula-junction-Protein E-Cadherin-Repression, was zum Verlust eines Pflaster definiert Stein wie epitheliale Morphologie und Verstärkung eines spindelförmigen mesenchymalen Phänotyp 3-8. Jüngste Studien durch genomweiten Analyse von RNAs aufgedeckt, daß es eine Gruppe von Genen, deren Klebemuster entweder mit epithelialen oder mesenchymalen Phänotypen 9,10 zugeordnet. Arbeiten aus unserem Labor alternatives Spleißen und EMT funktionell verbunden. Durch das Studium der Zelloberfläche Adhäsionsmolekül CD44 wir gezeigt, dass CD44 alterntiven Spleißen dicht bei EMT geregelt, und noch wichtiger, dass CD44 Spleiß-Isoform Schalt kausal trägt EMT 11. Alternatives Spleißen ist ein weit verbreitet und konservierten Modell der Genregulation, wie bis zu 95% der menschlichen Multi-Exon-Gene sind alternativ gespleißte 12-14. Durch die Erzeugung von mehreren Protein-Produkte von einem einzigen Gen, stellt alternative Spleißen einen wesentlichen Mechanismus für die Proteinvielfalt, indem eine weitere Schicht von Komplexität des menschlichen Genoms. Als solche könnte eine Fehlregulation von alternativem Spleißen möglicherweise tiefgreifende biologische Wirkungen verursachen Erkrankungen des Menschen führen. Tatsächlich hat abweichende alternative Spleißen in Krankheiten, für mehr als ein Jahrzehnt 15-25 dokumentiert, einschließlich der jüngsten Erkenntnisse, die Mutationen in Genen die Spleißosom Maschinen codieren, werden häufig in myelodysplastischen Syndromen 26-28 gefunden. Daher ist die Entwicklung zuverlässiger Verfahren zum Nachweis von alternativ gespleißten isoforms ist von großer Bedeutung in der Erforschung der vielfältigen biologischen Prozesse, einschließlich EMT. Hier bieten wir ein Protokoll, um Veränderungen in alternative Spleißen unter Verwendung eines induzierbaren EMT-Modell zu erkennen. Die Verfahren zum Entwerfen von PCR-Primern und das Nachweisen Spleiß-Isoformen sind nicht nur für die Untersuchung von alternativem Spleißen während EMT, sondern auch zur Untersuchung des alternativen Spleißens in anderen biologischen Prozessen. Untersuchung alternatives Spleißen während EMT ist zwingend notwendig, um ein besseres Verständnis der Mechanismen der EMT und Metastasierung von Tumoren, so die Entwicklung von Strategien, um die Krebsmetastasen zu behandeln.

<table><tbody><tr><td>4-hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Make stock solution by dissolving 4-hydroxytamoxifen in ethanol to 200 &amp;#956;M. Keep the solution at -20 &amp;#176;C protected from light.</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Total RNA Isolation kit</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>GoScript Reverse Transcription System</td><td>Promega</td><td>A5001</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagent for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td>Equipment for qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>CD44 antibody</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>BBA10</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>E-cadherin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4065</td><td>1:2,500 dilution for immunoblotting; 1:50 dilution for immunofluorescence</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Catenin antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2309</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Occludin antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Fibronectin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5,000 dilution</td></tr><tr><td>N-cadherin antibody</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>1:2,000 dilution</td></tr><tr><td>Vimentin antibody</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>GAPDH antibody</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>1:10,000 dilution</td></tr><tr><td>Amasham ECL Western blotting detection reagent</td><td>GE Health Life Science</td><td>RPN2209</td><td>Chemiluminescence system</td></tr></tbody></table>

detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Die oben beschriebenen Verfahren stellen eine robuste Methode zur alternatives Spleißen während EMT erfassen. Repräsentative Ergebnisse der CD44 splice Isoform Schalt bei Twist-induzierte EMT sind nachfolgend als Beispiel angegeben. Twist-induzierte EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen wurde durch einen Übergang von einem Kopfstein wie epitheliale Phänotyp zu einem länglichen Fibroblasten-Phänotyp (2A), das Fehlen von epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin und die dadurch Hochregulation von mesenchymalen Marker Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin (2B). Weiterhin wurde EMT durch den Verlust der E-Cadherin-Lokalisierung an Zell-Zell-Verbindungen (2C) beurteilt. Die Expression von CD44 schaltet Spleiß-Isoformen während EMT wurde von qRT-PCR und Immunoblot untersucht. Das menschliche CD44-Gen wird von neun variablen Exons besteht. Alternatives Spleißen von CD44 ermöglicht Zellen proDuce CD44-Varianten (CD44v), die mindestens eine variable Exon, und CD44-Standard (CD44s), die frei von allen variablen Exons umfassen. 3A zeigt die Strategie der Primer-Design für den Nachweis von CD44 verschiedenen Spleiß-Isoformen. Für den Nachweis der Exon-übersprungenen Produkt CD44s wird der Vorwärtsprimer in den konstitutiven Exon 5 liegt, während der Rückwärtsprimer überspannt der Verbindung zwischen konstitutive Exons 5 und 6. Für den Nachweis von CD44v Spleiß-Isoformen, die die V5 und V6 variablen Exons, die Vorwärts und Rückwärtsprimer innerhalb des V5 und V6 ausgelegt sind. Primer für den Nachweis von anderen CD44 variable Exon-enthaltenden Isoformen unter Verwendung der gleichen Strategie entworfen werden. Zusätzlich wird die Gesamt CD44 Transkript unter Verwendung von Vorwärts und Rückwärts-Primern, die in der konstitutiven Exon 2 und Exon 3, bzw. (3A) befindet, erfasst wird. Wie in 3B gezeigt, qRT-PCR-Analysen unter Verwendung dieser Primersätze zeigten eine signifikante Abnahme der CD44v-mRNA und der Erhöhung der CD44s mRNA nach 14 Tagen der TAM Behandlung in den Twist-ER-exprimierenden Zellen HMLE. Dagegen ist der Gesamt Transkript von CD44 blieb während EMT (3C) unverändert. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der qRT-PCR, der Proteingehalt von CD44v sank deutlich, während die Expression des Proteins wurde CD44s stark hochreguliert (Abbildung 3D). Daher ist die große Isoform von CD44 wurde von CD44v zu CD44s während der EMT-Prozess verschoben. <img alt="Figur 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1. Primer-Design. Schematische Darstellungen, die Lage der Primer zur Detektion Spleißen Isoformen in einem Exon-Skipping-Modell. Die grauen Kästen stellen konstitutive Exons, die orangefarbenen Kästen stellen variablen Exons, und die dünnen Linien, Kästchen bezeichnen Introns. Die Primer-Standorte sind INDICATed durch Pfeile: schwarze Pfeile deuten Primer-Sets zum Nachweis von Gesamt-mRNA, orange Pfeile zeigen Primer-Sets zur Verstärkung Exon-Isoformen enthalten, und blaue Pfeile zeigen Primer-Sets zum Nachweis von Exon-Skipping-Isoformen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2. Die Induktion der EMT. (A) Phasenkontrastaufnahmen (10x) darstellt morphologischen Veränderungen HMLE / Twist-ER Zellen vor (unbehandelt) und nach 14 Tagen der Behandlung TAM. (B) Immunoblot-Analyse der EMT-Marker in HMLE / Twist-ER Zellen vor (unbehandelt) und nach 14 Tagen der TAM-Behandlung. Nach TAM Behandlung epithelialen Marker E-Cadherin, γ-Catenin und Occludin wurden herunterreguliert, und mesenchymalen Marker Fibronektin, N-Cadherin und Vimentin wurden hochreguliert. (C) Immunfluoreszenzbilder (63X), die den Verlust der E-CadherinLokalisierung an Zell-Zell-Verbindungen nach 14 Tagen der Behandlung TAM. Grüne Färbung zeigt an E-Cadherin-und DAPI-Färbung (blau) zeigt Kernen. Maßstab = 10 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51845/51845fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51845/51845fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Schalten von CD44 Spleiß-Isoformen während EMT. (A) Primer-Design für den Nachweis von CD44-Spleiß-Isoformen. Die grauen Kästen stellen konstitutive Exons, die orangefarbenen Kästen stellen variablen Exons, und die dünnen Linien, Kästchen bezeichnen Introns. Die Primer-Stellen sind durch Pfeile angegeben: schwarzen Pfeile zeigen Primer-Sets zum Nachweis CD44 Gesamt-mRNA, orange Pfeile zeigen Primersätze zum Amplifizieren CD44v5-6 und blaue Pfeile zeigen Primersätze fürErfassen CD44s. (B, C) ​​qRT-PCR-Analyse der Ebenen von CD44-Isoformen in EMT Verwendung von Primern, die spezifisch nachzuweisen CD44v die variable Exon v5 und v6 (v5 / 6) und CD44s (B) und CD44 gesamte mRNA (C) . Relative Expression von mRNA in Tag 14 wurden die Zellen zur entsprechenden Tag 0 Zellen in TAM behandelten und nicht behandelten Gruppen normalisiert. Fehlerbalken zeigen SEM; n = 3. (D) Immunoblot-Analyse von CD44-Isoformen während TAM-induzierten EMT in HMLE / Twist-ER-Zellen. Stufen von E-Cadherin und N-Cadherin wurden überwacht, um den Status EMT identifizieren.

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Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Aufrufe.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Serie: Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Forschung

Krebsforschung

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

Engineering künstliche Faktoren zur Speziellen Manipulation alternativen Spleißen in menschlichen Zellen

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Genetik

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic plasticity drives invasion, dissemination and metastasis. Indeed, while most of the studies of phenotypic plasticity have been in the context of epithelial-derived carcinomas, it turns out sarcomas, which are mesenchymal in origin, also exhibit phenotypic plasticity, with a subset of sarcomas undergoing a phenomenon that resembles a mesenchymal-epithelial transition (MET). Here, we developed a method comprising the miR-200 family and grainyhead-like 2 (GRHL2) to mimic this MET-like phenomenon observed in sarcoma patient samples.We sequentially express GRHL2 and the miR-200 family using cell transduction and transfection, respectively, to better understand the molecular underpinnings of these phenotypic transitions in sarcoma cells. Sarcoma cells expressing miR-200s and GRHL2 demonstrated enhanced epithelial characteristics in cell morphology and alteration of epithelial and mesenchymal biomarkers. Future studies using these methods can be used to better understand the phenotypic consequences of MET-like processes on sarcoma cells, such as migration, invasion, metastatic propensity, and therapy resistance.

We present here a cell culture method for inducing mesenchymal-epithelial transitions (MET) in sarcoma cells based on combined ectopic expression of microRNA-200 family members and grainyhead-like 2 (GRHL2). This method is suitable for better understanding the biological impact of phenotypic plasticity on cancer aggressiveness and treatments.

Die Induktion von mesenchymalen-Epithelial Transitions in Sarcomzellen

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Entwicklungsbiologie

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of TGF-&#946; signaling can lead to breast cancer. TGF-&#946; elicits its effects on proliferation and differentiation via specific cell surface TGF-&#946; type I and type II receptors (i.e., T&#946;RI and T&#946;RII) that contain an intrinsic serine/threonine kinase domain. Upon TGF-&#946;-induced heteromeric complex formation, activated T&#946;RI elicits intracellular signaling by phosphorylating SMAD2 and SMAD3. These activated SMADs form heteromeric complexes with SMAD4 to regulate specific target genes, including plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-1, encoded by the SERPINE1 gene). The induction of epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) allows epithelial cancer cells at the primary site or during colonization at distant sites to gain an invasive phenotype and drive tumor progression. TGF-&#946; acts as a potent inducer of breast cancer invasion by driving EMT. Here, we describe systematic methods to investigate TGF-&#946; signaling and EMT responses using premalignant human MCF10A-RAS (M2) cells and mouse NMuMG epithelial cells as examples. We describe methods to determine TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation by Western blotting, SMAD3/SMAD4-dependent transcriptional activity using luciferase reporter activity and SERPINE1 target gene expression by quantitative real-time-polymerase chain reaction (qRT-PCR). In addition, methods are described to examine TGF-&#946;-induced EMT by measuring changes in morphology, epithelial and mesenchymal marker expression, filamentous actin staining and immunofluorescence staining of E-cadherin. Two selective small molecule TGF-&#946; receptor kinase inhibitors, GW788388 and SB431542, were used to block TGF-&#946;-induced SMAD2 phosphorylation, target genes and changes in EMT marker expression. Moreover, we describe the transdifferentiation of mesenchymal breast Py2T murine epithelial tumor cells into adipocytes. Methods to examine TGF-&#946;-induced signaling and EMT in breast cancer may contribute to new therapeutic approaches for breast cancer.

We describe a systematic workflow to investigate TGF-&#946; signaling and TGF-&#946;-induced EMT by studying the protein and gene expression involved in this signaling pathway. The methods include Western blotting, a luciferase reporter assay, qPCR, and immunofluorescence staining.

Untersuchung von TGF-β Signalisierung und TGF-β-induzierten epitheliaal-mesenchymalen Übergang bei Brustkrebs und normalen Zellen

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides constitutive splicing, alternative mRNA splicing allows the expression of multifunctional proteins from one gene. As interactome studies are generally the first analysis for new or unknown proteins, the association of the bait protein with splicing factors is an indication that it can participate in mRNA splicing process, but to determine in what context or what genes are regulated is an empirical process. A good starting point to evaluate this function is using the classical minigene tool. Here we present the adenoviral E1A minigene usage for evaluating the alternative splicing changes after different cellular stress stimuli. We evaluated the splicing of E1A minigene in HEK293 stably overexpressing Nek4 protein after different stressing treatments. The protocol includes E1A minigene transfection, cell treatment, RNA extraction and cDNA synthesis, followed by PCR and gel analysis and quantification of the E1A spliced variants. The use of this simple and well-established method combined with specific treatments is a reliable starting point to shed light on cellular processes or what genes can be regulated by mRNA splicing.

This protocol presents a rapid and useful tool for evaluating the role of a protein with uncharacterized function in alternative splicing regulation after chemotherapeutic treatment.

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Reporter Based Cellular Assay for Monitoring Splicing Efficiency

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes to join exons and remove introns prior to cytoplasmic export of the mature mRNA. Splicing efficiency can be altered by the presence of mutations at splice sites, the influence of trans-acting splicing factors, or the activity of therapeutics. Here, we describe the protocol for a cellular assay that can be applied for monitoring the splicing efficiency of any given exon. The assay uses an adaptable plasmid encoded 3-exon/2-intron minigene reporter, which can be expressed in mammalian cells by transient transfection. Post-transfection, total cellular RNA is isolated, and the efficiency of exon splicing in the reporter mRNA is determined by either primer extension or semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We describe how the impact of disease associated 5&#8242; splice-site mutations can be determined by introducing them in the reporter; and how the suppression of these mutations can be achieved by co-transfection with U1 small nuclear RNA (snRNA) construct carrying compensatory mutations in its 5&#8242; region that basepairs with the 5&#8242;-splice sites at exon-intron junctions in pre-mRNAs. Thus, the reporter can be used for the design of therapeutic U1 particles to improve recognition of mutant 5&#8242; splice-sites. Insertion of cis-acting&#160;regulatory sites, such as splicing enhancer or silencer sequences, into the reporter can also be used to examine the role of U1 snRNP in regulation mediated by a specific alternative splicing factor. Finally, reporter expressing cells can be incubated with small molecules to determine the effect of potential therapeutics on constitutive pre-mRNA splicing or on exons carrying mutant 5&#8242; splice sites. Overall, the reporter assay can be applied to monitor splicing efficiency in a variety of conditions to study fundamental splicing mechanisms and splicing-associated diseases.

This protocol describes a minigene reporter assay to monitor the impact of 5&#180;-splice site mutations on splicing and develops suppressor U1 snRNA for the rescue of mutation-induced splicing inhibition. The reporter and suppressor U1 snRNA constructs are expressed in HeLa cells, and splicing is analyzed by primer extension or RT-PCR.

Ein reporterbasierter zellulärer Assay zur Überwachung der Spleißeffizienz

During gene expression, the vital step of pre-mRNA splicing involves accurate recognition of splice sites and efficient assembly of spliceosomal complexes ...

Biochemie

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Biologie

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also be utilized to explore other complex regulatory mechanisms at the exon level. Alternative splicing and polyadenylation play a crucial role in the functional diversity of a gene by generating different isoforms to regulate gene expression at the post-transcriptional level, and limiting analyses to the whole gene level can miss this important regulatory layer. Here, we demonstrate detailed step by step analyses for identification and visualization of differential exon and polyadenylation site usage across conditions, using Bioconductor and other packages and functions, including DEXSeq, diffSplice from the Limma package, and rMATS.

Alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA) expand the diversity of transcript isoforms and their products. Here, we describe bioinformatic protocols to analyze bulk RNA-seq and 3' end sequencing assays to detect and visualize AS and APA varying across experimental conditions.

Identifizierung von alternativem Spleißen und Polyadenylierung in RNA-seq-Daten

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

RNA Splicing

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called the primary transcript. The primary transcripts that become mRNAs are called precursor messenger RNAs (pre-mRNAs). Eukaryotic pre-mRNA contains alternating sequences of exons and introns. Exons are nucleotide sequences that code for proteins, whereas introns are the non-coding regions. In RNA splicing, introns are removed and exons are bonded together.
Splicing is Mediated by the Spliceosome
Splicing occurs in the nucleosome and is mediated by a complex of proteins and small RNAs called small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs). snRNPs, together with other proteins, form the spliceosome, which recognizes specific nucleotide sequences at the ends of the exon and intron. First, it binds to a GU-containing sequence at the 5&#39; end of the intron and to a branch point sequence containing an A towards the 3&#39; end of the intron. In a number of carefully-orchestrated steps, other snRNPs then bring the branch point close to the 5&#39; splice site. Subsequently, a chemical reaction cleaves the 5&#39; end of the intron from its upstream exon and attaches it to the branch point, forming a loop called a lariat. To release the lariat, the AG-containing sequence of the intron near the 5&#39; end of the downstream exon reacts with the 3&#39; end of the upstream exon. This reaction patches the two exons together, concluding the splicing process.
Splicing Allows the Expression of Several Proteins from a Single Gene
Typically, exons are joined together in the order in which they appear in a gene. However, during alternative splicing, different combinations of exons in pre-mRNA are combined to form mature mRNA. This produces several different proteins from a single pre-mRNA transcript.
Different patterns of alternative splicing include exon skipping, alternative 5&#39; or 3&#39; splice sites, and intron retention. These patterns are guided by the length of exons or introns and the strength of the splicing signal at the splice sites. Because of this, exons that are shorter than other exons may be overlooked by the spliceosome and omitted from the mature mRNA. In contrast, introns that are significantly shorter than other introns may evade removal by the spliceosome and are retained in the mature mRNA. As a result, alternative splicing generates variants of mature mRNA that were copied from the same stretch of DNA. The RNA sequence variants produce different proteins with additional or fewer amino acids, shifts in the reading frame, or a premature stop codon. These protein isoforms have different biological properties, including function, cellular localization, and interaction with other proteins, thereby playing a vital role in tissue- and environment-specific gene expression.
Abnormal Splicing Can Cause Diseases
Errors in splicing can produce aberrant protein isoforms, which may contribute to diseases, including cancer. For instance, alternative splicing of the BCL2L1 gene generates a long and short protein isoform&#8212;BCL-XL and BCL-XS, respectively&#8212; through the use of alternative 5&#39; splice sites. The longer BCL-XL isoform promotes cell survival and is highly expressed in several types of cancers (e.g., blood, breast, and liver cancers). Expression of the short BCL-XS isoform that promotes cell death is suppressed in cancer.

RNA Splicing, Lariat and the Spliceososme

RNA-Spleißen

Splicing is the process by which eukaryotic RNA is edited before its translation into protein. The RNA strand transcribed from eukaryotic DNA is called ...