The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

1. Montage und Vortests des Morbidostat Geräte <ol><li> Die Montage des Morbidostat <ol><li> Lochen 3 Löcher auf der Kappe des Kulturfläschchen mit einer 18 G Spritzennadel. Schneiden drei Stück Polyethylenschlauch ~ 7 cm in der Länge. Legen Sie diese drei Stücke aus Polyethylenschlauch auf der Kappe. </li><li> Verwenden Sie Klebeband den Rand der Kappe zu wickeln, wie die Besetzung für das Polydimethylsiloxan (PDMS) Mischung zu dienen. Mischungs 5 ​​g A-Komponente und 0,5 g B-Komponente der PDMS in einem 150 ml Kunststoffbehälter durch manuelles Rühren mit einem Zahnstocher. Laden des Gemischs in eine 10 ml Spritze. <ol><li> Gießen Sie die PDMS-Mischung auf der Kappe mit der Spritze. Backen Sie die gesamte Kappe die PDMS für 8 Stunden im Ofen bei 70 ° C zu heilen. </li></ol></li><li> Löten Sie die LED-Anode mit dem 24-Gauge-Kabel und LED-Kathode mit dem Kohlewiderstand mit einem Lötkolben. Dazu wird ein 680 Ω Kohlewiderstand mit 24 G Draht. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband. </li><li> Damitlder dem Kollektor des Photodetektors mit dem 24 G Draht und dem Emitter des Photodetektors mit einem 100 k &amp; OHgr Kohlewiderstand. Isolieren Sie die Drahtverbindung mit Isolierband. </li><li> Setzen Sie die Leuchtdiode in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie die Leuchtdiode und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Stellen Sie sicher , dass die LED arbeitet mit einer Digitalkamera , die IR (zB ein Handy-Kamera) erkennen kann. </li><li> Setzen Sie den Photodetektor in der Kulturflaschenhalter. Durch Anschluss an das Schaltbild in Abbildung 2 Ergänzungs, schließen Sie den Photodetektor und schalten Sie es mit einer Stromversorgung von 5 V Schließen Sie das Kabel an beiden Seiten der Photowiderstände , die Spannung über die elektronische Steuerkarte zu messen. </li><li> Kleben Sie einen Magneten an der Welle des Lüfters, der als Magnetrührer Einheit dient. Beachten Sie, dass die alignment der Welle des Gebläses zu dem Kulturfläschchen, und der Abstand zwischen der Phiole der Kultur und dem Magneten ist für die ordnungsgemäße Funktion der magnetischen Rühreinheit sehr kritisch. </li><li> Schließen Sie jedes Stück Polyethylenschlauch des Kulturfläschchen in das entsprechende Stück Silikonschlauch für die Mikropumpen, mittlere Flaschen und Abfallflasche. Schalten Sie die Pumpe für 1 Stunde und messen das Gesamtvolumen der Mittelflasche in die Kulturfläschchen, die Pumprate zu bestimmen, gepumpt wird. Beachten Sie, dass die typische Pumprate sollte ~ 4 ml / h, die D = 0,33 h dem Verdünnungsrate entspricht -1 für eine 12 ml Arbeitsvolumen der Kulturfläschchen. </li><li> Legen Sie die gesamte Baugruppe auf einem mittelgroßen (34 cm x 34 cm x 43,5 cm) Schüttelinkubator. </li></ol></li><li> Vortests die Morbidostat <ol><li> Set Versorgungsspannung von kühlem Ventilator bis 5 V seinen Motor zu starten, die magnetischen Rührstab zu testen. Beachten Sie, dass die Rührwirkung visuell inspiziert werden kann. Die Spannung, die fahrens der Lüftermotor wird durch Pulsweitenmodulation (PWM) präzise gesteuert werden. </li><li> Bereiten Sie eine Reihe von Wildtyp E. coli Proben mit optischen Dichten bei 600 nm typischerweise im Bereich von 0,07 bis 0,3 für die Kalibrierung. Legen Sie einen Test E. coli Probe in der Kulturfläschchen und notieren Sie die Photospannung. <ol><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l der gleichen Probe in dem Plattenleser und notieren Sie die optische Dichte. Verwenden Sie die Photospannung gegenüber der optischen Dichtedaten der Eichkurve zu zeichnen. Beachten Sie, dass typischerweise in der optischen Dichte einer Einheitsänderung mit dem Bias-Schema hier verwendet, um ~ 7,6 V Änderung der Photodetektor entspricht. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Ausführen des Morbidostat <ol><li> Vorbereitung vor dem täglichen Experiment starten <ol><li> Bereiten Sie die Kulturfläschchen mit drei extrem chemikalienbeständige Tygon Schläuche mit Innendurchmesser 1/32 Zoll und Außendurchmesser 3/32 Zoll für Einlässe, wie in Abschnitt der Vorrichtung zu bilden1.1 und in Ergänzungs 1. </li><li> Bereiten Sie die M9-Minimalmedium (0,2% Glucose) und Trimethoprim (TMP) Arzneimittel enthaltenden Medium. Sterilisieren des Mediums, das Medium Flasche, das Medikament Mittelflasche, die Abfallflasche, und die Kulturfläschchen in einem Autoklaven bei 121 ° C. HINWEIS: Der TMP ist eine Stammlösung , die später verwendet wird , um die Konzentrationen in Tabelle 1 und das Medikament dem Medium autoklaviert wird enthaltende TMP erreichen nicht. </li></ol></li><li> Das Ausführen des Morbidostat <ol><li> Am ersten Tag des Experiments, tauen 1 ml der gefrorenen Wildtyp E. coli MG1655 - Zellen für 5 min bei Raumtemperatur und Übertragung 120 ul der Zellen zu dem Kultur Durchstechflasche mit ~ 12 ml M9 Nährmedium. Nach dem ersten Tag auftauen 1 ml der gefrorenen E. coli - Zellen aus dem vorherigen Tag für 5 min und Übertragung 120 ul der Zellen zu einer neuen Kultur Fläschchen mit ~ 12 ml M9 Nährmedium. </li><li> Schalten Sie den Schüttelinkubator und stellen Sie die tempe<html> rature bis 30 ° C ohne Schütteln inkubiert. </li><li> Starten Sie die morbidostat Operation durch auf der Mikropumpe dreht, die magnetische Rühreinheit und der optische Dichtemessung. HINWEIS: Während des Betriebs wird ein Rückkopplungs Schwellwert-Algorithmus wird verwendet, um die Arzneimittelinjektion zu steuern. Wenn die gemessene optische Dichte einen voreingestellten Schwellenwert überschreitet, würde die Arzneimittelinjektionspumpe eingeschaltet und der Mittelpumpe ausgeschaltet werden würde. Andernfalls bleibt die Droge Einspritzpumpe ab und die Mittelpumpe eingeschaltet ist. </li><li> Überwachen der Spannung von Zeit zu Zeit, um sicherzustellen, dass das mikrobielle Wachstum ist. Hinweis: Wegen der Frost-Tau - Zyklus, E. coli - Zellen zeigen eine Verzögerung von ca. 4 h während jedes Wachstum des Tages. </li><li> Nach ca. 23 h, stoppen Sie die Mikropumpe durch seine Versorgungsspannung ausgeschaltet und die Kulturfläschchen herausnehmen. Hinzufügen 15% Glycerin in die Kulturfläschchen und gefrier die Probe bei -80 ° C zur Lagerung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.1 bis 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in 96-Well-Format HINWEIS: Führen Sie die Wachstumsrate Messung in einem Plattenlesegerät mit einer 96-Well-Format, um die Antibiotikaresistenz Ebene zu bestimmen. <ol><li> Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und übertragen 15 ul der Zelle in das Kulturfläschchen ~ 15 ml M9-Medium enthält. Es ihnen ermöglichen, bis die optische Dichte bei 600 nm wachsen ~ 0,1 erreicht. Teilen Sie die 15 ml in 1 ml Flaschen und fügen Sie die TMP - Medikament bei diesem Schritt die gewünschten Arzneimittelkonzentrationen zu erhalten , wie in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Nehmen Sie 200 ul der Probe aus Schritt 3.1 und Platz in jede Vertiefung in dem Plattenleser und es ihnen ermöglichen, für 12 Stunden 5 zu wachsen. Die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm wird automatisch während der Messung aufgezeichnet. HINWEIS: Für jeden Datenpunkt werden drei Messungen aufgezeichnet und gemittelt, um die Konsistenz der Daten zu gewährleisten. Die Daten auf der optischen Dichte gegen die Zeit kann be verwendet, um die Wachstumsrate zu erhalten. </li><li> Zeichnen Sie die Wachstumsrate Daten in Abhängigkeit von der Wirkstoffkonzentration IC 50 zu erhalten. Beachten Sie, dass IC 50 als die Arzneimittelkonzentration definiert , bei der die Wachstumsrate fünfzig Prozent der maximalen Wachstumsrate beträgt 5. </li></ol> 4. Einzelzellmorphologie und Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika Messung in Mikrofluidiksysteme <ol><li> Führen Sie die Herstellung der mikrofluidischen Geräte über mehrschichtige weiche Lithographie von PDMS wie an anderer Stelle 15 beschrieben. <ol><li> Verwenden photolithographischen der Photoresistform für die Steuer- und Strömungsschichten zu machen. Beachten Sie, dass für die Steuerschicht, haben negative Photoresist (~ 15 &amp; mgr; m Höhe) und positive Photoresist (~ 8 &amp; mgr; m Höhe) eine Form auf einer blanken Siliziumwafer herzustellen. </li><li> Bereiten PDMS-Mischungen mit Vernetzungsverhältnisse von 5: 1 und 20: 1 für die Steuerschicht und die Strömungsschicht. Setzen Sie die Mischungen in einem Exsikkator unter Vakuum keine Luftblasen zu entfernenFür 1 Std. </li><li> Setzen Sie die Steuerschicht Photoresist Formen auf Siliziumwafer Trimethylchlorsilan (TMCS) Dampf. Sprechen Sie die Kontrollschicht von ca. 6 mm Dicke, die durch die PDMS-Mischung Gießen (mit Vernetzungs Verhältnis 5: 1) auf dem Siliziumwafer auf der Steuerschicht Photoresist-Form. Backen Sie die Steuerschicht für 40 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen. </li><li> Bilden die Strömungsschicht durch Rotationsbeschichtung eines PDMS-Mischung (mit Vernetzungsverhältnis 20: 1, Schleuderdrehzahl 3000 Upm für 60 sec) auf eine Strömungsschicht Photoresistform. Backen Sie die Strömungsschicht für 30 min bei 80 ° C für 1 Stunde in den Ofen. </li><li> Verwenden Sie eine Rasierklinge die Steuerschicht in die gewünschte Chipgröße zu schneiden (in der Regel 3 cm x 2 cm) und abziehen manuell die Steuerschicht. Legen Sie die Steuerschicht auf der Oberseite der Strömungsschicht und richten sie unter einem Stereomikroskop. Cure die ausgerichtete Montage bei 80 ° C im Ofen über Nacht. Danach 5 h die Montage in 250 ml entionisiertem Wasser in einem Kunststoffbehälter tränken das Rest TMCS auflösen. </li><li> Anschließend werden die Einlaßlöcher mit 20 G Nadeln stanzen und das gesamte Elastomer an einem Glasobjektträger mit einer leeren PDMS-Schicht (PDMS Quer Verhältnis Verknüpfung 5: 1, 2,000 Schleuderdrehzahl rpm für 30 sec) beschichtet bonden für 40 sec durch Luftplasmabehandlung bei 1,2 Torr Luftdruck. </li><li> Durchführung umfassende Backen für 36 h bei 80 ° C, um die zytotoxischen Wirkungen von PDMS zu reduzieren. Beachten Sie, dass diese Backschritt kritisch ist die Toxizität für die Bakterienzellen zu minimieren. </li></ol></li><li> On Chip Growth Experiment <ol><li> Bevor in die Mikrofluidik-Vorrichtung geladen wird, spülen Sie es mit entsalztem Wasser für 1 Stunde und M9-Medium für 1 Stunde. </li><li> Auftauen die tägliche gefrorenen Probe bei Raumtemperatur für 5 min und inokulieren Medium ein neues Reagenzglas mit frischem M9. Die Probe wird in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Verdünnen Sie die mikrobielle Probe 10-fach mit M9-Medium und laden Sie es in die Mikrofluidik-Vorrichtung durch die mikrobielle Probenbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Dann laden Sie die TMP-DrogeMedium in den Chip durch das Medikament Mittelbehälter bei 5 psi Druck zu setzen. Führen Sie die Vermischung zwischen der Mikrobe und Drogen durch Betätigung des mikromechanischen Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip für 15 min. </li><li> Platzieren Sie den Mikrofluidik-Chip im Mikroskop-Inkubator auf dem inversen Mikroskop angebracht. Erwerben das Zellbild in der Wachstumskammer auf dem umgekehrten Mikroskop jede hr für 8 h mit der CCD-Kamera angebracht ist. </li><li> Verwenden Sie das benutzerdefinierte Programm Skript , um die Zellzahlen über einen Schwellenwert - Algorithmus auf den Zellenbilddaten 18 zu berechnen. Beachten Sie, dass die Zellzahldaten werden gemittelt, typischerweise über drei mikrofluidischen Kammern. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ein Low-Fußabdruck morbidostat Gerät von Low-Cost-Komponenten demonstriert. Der Anstieg der Widerstandsniveau Medikament vom Gerät registriert sind konsistent mit denen früherer Berichte 5. Entwickelt für evolutionäre Studien der Arzneimittelresistenz ist das Gerät möglicherweise auf viele andere Experimente. Zunächst wird eine umfassende Datenbank von Medikamenten-induzierten Mutationen können für einen großen Satz von klinisch relevanten Antibiotika hergestellt werden. Zum Beispiel kann die evol...

Seit der Einführung des ersten Antibiotikums Penicillin hat mikrobielle Antibiotika - Resistenz in ein Problem der globalen Gesundheit entwickelt 1. Obwohl der Erwerb von Antibiotika - Resistenzen können nachträglich in vivo untersucht werden, werden die Bedingungen dieser Versuche häufig nicht während der gesamten Evolution 2 gesteuert. Alternativ können adaptive gerichtete Evolution offenbaren die molekulare Evolution einer mikrobiellen Spezies unter Umweltbelastungen oder Selektionsdruck aus einem Antibiotikum 3. In jüngster Zeit haben viele gut kontrollierten evolutionäre Experimente von Antibiotika-Resistenzen, die Entstehung von Antibiotika-Resistenzen aufgeklärt. Zum Beispiel zeigte Austin Gruppe rasche Entwicklung in einem richtig entwickelt mikrofluidische compartmented Umwelt 4. Die neu entwickelte morbidostat induziert systematische Mutationen unter Drogenselektionsdruck 5,6. Die morbidostat, eine mikrobielle selecGerät werden , die die Antibiotika - Konzentration kontinuierlich einstellt eine nahezu konstante Bevölkerung zu erhalten, ist ein großer Fortschritt von der Fluktuationstest in der Mikrobiologie verwendeten 7,8. Im Fluktuationstest, ein Antibiotikum Medikament wird in hoher Konzentration injiziert, und die überlebenden Mutanten werden gesiebt und gezählt. Stattdessen Mikroben in einem morbidostat werden ständig in Frage gestellt und mehrere Mutationen erwerben. Die morbidostat arbeitet ähnlich der Chemostat, eine Kulturvorrichtung von Novick und Szliard 1950 erfunden , die Nährstoffe durch kontinuierliche Zufuhr während Verdünnen der Mikrobenpopulation 9 eine konstante Population aufrecht erhält. Seit seiner Einführung hat sich die Chemostat wurde weiterentwickelt und verbessert. Aktuelle mikrofluidischen Chemostate haben Nano- und Einzelzellen-Kapazitäten erreicht. Jedoch sind diese Vorrichtungen nicht für adaptive Evolutionsexperimenten, die eine große Zellpopulation mit vielen Mutationsereignisse 10,11 erfordern. Vor kurzem Mini-Chemostate mit einem Arbeitsvolumen von ca. 10 ml wurden ebenfalls entwickelt in den Spalt zwischen Liter Bioreaktoren und der mikrofluidischen chemostat 12,13 zu füllen. Hier präsentieren wir das Design und die Verwendung eines Low-Cost, automatisierte morbidostat für ein Antibiotikum drug resistance Studie. Das vorgeschlagene Modul kann mit minimalen Hardware-Anforderungen in einem Schüttelinkubator in einem mikrobiologischen Labor eingesetzt werden. Die Open-Source - Firmware auch leicht an spezifische Anwendungen der adaptiven Evolution zugeschnitten, wie Metabolic Engineering 3. Schließlich wird die morbidostat in ein Multiplex - Mikrofluidik - Plattform integriert für die Antibiotika - Resistenzprüfung 14.

<table><tbody><tr><td>Environmental Shaker Incubator</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo board</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Carbon Resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor for LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Carbon resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor for phototransistor</td></tr><tr><td>940 nm light emitting diode</td><td>Bright LED Electronic</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Optical density measurement</td></tr><tr><td>940 nm phototransistor</td><td>Kodenshi&amp;nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Optical density measurement</td></tr><tr><td>Darlington pair IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>this IC drives micropumps and magnetic stirring unit</td></tr><tr><td>5 V DC brushless fan</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spec: 5 V supply voltage and 80&amp;nbsp;mA; available www.jameco.com</td></tr><tr><td>Piezoelectric micropump</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Pressure &gt; 3&amp;nbsp;kPa; Flow rate &gt;5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32&quot; OD: 3/32&quot; L:50&#039;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetic Stir bar</td><td>COWIE</td><td></td><td>tapered shape dim: 10&amp;nbsp;mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Glass scintillation 20 ml vial</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height)</td></tr><tr><td>Culture vial holder</td><td></td><td></td><td>Custom made from Polyformaldehyde&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>used to seal the glass vial</td></tr><tr><td>Medium bottle</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimal salt 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>Cadamino Acid</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bateriological</td><td>Oxoid</td><td></td><td>for agar plate</td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55</td></tr><tr><td>Microscope Incubator</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CU-109</td><td>used for microfluidic measurement</td></tr><tr><td>Solenoidal valves</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normally open 1.3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>USB interface card</td><td>Hobby Engineering</td><td>USBIO24-R Digital I/O Module&amp;nbsp;</td><td>for microfluidics measurement</td></tr><tr><td>Air compressor</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi</td></tr><tr><td>Male luer-lock fittings to 1/8&quot; barb</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>1/8&quot; barb to 10-32 threaded port</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port</td><td>ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&amp;nbsp;V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Tantalum capacitor, 10&amp;nbsp;&amp;mu;F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Andor CCD camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>used for microfluidic on chip imaging</td></tr><tr><td>ELISA plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>two component Silicone&amp;nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>AZ4620 photoresist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>20 Gauge Syringe Needle</td><td>BD</td><td></td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR amplification</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&amp;nbsp;</td><td>antibiotic resistane measurement</td></tr></tbody></table>

design and use of a low cost, automated morbidostat for adaptive evolution of bacteria under antibiotic drug selection

Wir beschreiben eine kostengünstige, konfigurierbar morbidostat für den Evolutionsweges der Antibiotikaresistenz zu charakterisieren. Die morbidostat ist eine bakterielle Kulturvorrichtung, die kontinuierlich das Bakterienwachstum überwacht und reguliert dynamisch die Arzneimittelkonzentration, die Bakterien ständig herausfordern, wie sie Arzneimittelresistenz zu erwerben entwickeln. Das Gerät verfügt über ein Arbeitsvolumen von ca. 10 ml und ist voll automatisiert und mit Messung der optischen Dichte und Mikropumpen für mittlere und Medikamentenabgabe ausgestattet. Um die Plattform zu validieren, maßen wir die schrittweise Übernahme von Trimethoprim Resistenz in Escherichia coli MG 1655 und integriert , um die Vorrichtung mit einer Mikrofluidik - Multiplex - Plattform Zellmorphologie und Antibiotikaempfindlichkeit zu untersuchen. Der Ansatz kann auf Laboruntersuchungen von Antibiotika-Resistenzen hochskaliert werden, und ist verlängerbar Evolution für Stamm Verbesserungen in Metabolic Engineering und andere Bakterienkultur Experimente adaptiv.

Die oben beschriebene morbidostat ist in 1. Die gemeinsamen morbidostat Operationen, einschließlich der experimentellen Entwicklung, antibiotische Empfindlichkeitstest und Zellmorphologie Prüfung, validiert wurden in einem E. schematisierte coli MG1655 Kultur Trimethoprim (TMP) ausgesetzt, ein häufig verwendetes Antibiotikum 5,6. TMP induziert sehr ausgeprägte schrittweise Erhöhungen der Arzneimittelresistenz und die Mutationen sind um d...

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Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

9.6K Aufrufe.  National Tsing Hua University. We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Serie: Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

Verfahren für Adaptive Labor Entwicklung von Mikroorganismen Mit einem Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Forschung

Genetik

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Testen die Rolle des Multicopy Plasmide in der Entwicklung von Antibiotika-Resistenzen

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for more than 35 years and 77,000 bacterial generations. The setup and procedures used in the LTEE epitomize reliable and reproducible methods for studying microbial evolution. In this protocol, we first describe how the LTEE populations are transferred to fresh medium and cultured each day. Then, we describe how the LTEE populations are regularly checked for possible signs of contamination and archived to provide a permanent frozen "fossil record" for later study. Multiple safeguards included in these procedures are designed to prevent contamination, detect various problems when they occur, and recover from disruptions without appreciably setting back the progress of the experiment. One way that the overall tempo and character of evolutionary changes are monitored in the LTEE is by measuring the competitive fitness of populations and strains from the experiment. We describe how co-culture competition assays are conducted and provide both a spreadsheet and an R package (fitnessR) for calculating relative fitness from the results. Over the course of the LTEE, the behaviors of some populations have changed in interesting ways, and new technologies like whole-genome sequencing have provided additional avenues for investigating how the populations have evolved. We end by discussing how the original LTEE procedures have been updated to accommodate or take advantage of these changes. This protocol will be useful for researchers who use the LTEE as a model system for studying connections between evolution and genetics, molecular biology, systems biology, and ecology. More broadly, the LTEE provides a tried-and-true template for those who are beginning their own evolution experiments with new microbes, environments, and questions.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

This protocol describes how to maintain the Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) by performing its daily transfers and periodic freeze-downs and how to conduct competition assays to measure fitness improvements in evolved bacteria. These procedures can serve as a template for researchers starting their own microbial evolution experiments.

Tägliche Transfers, Archivierung von Populationen und Fitnessmessung im Langzeit-Evolutionsexperiment mit Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biologie

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Design und die Verwendung Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

Immunologie und Infektion

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

Zusammenfassung

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