This work was supported by DARPA grant number 84389.01.44908, an NSF CAREER award (DBI-1253293), an NIH exploratory/developmental research grant (CA195709), and NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01), and a New Directions grant from the UCSF resource allocation program.

1. SU8 Ana Fabrikasyon <ol><li> tasarım yazılımı kullanarak üç katmanlı imalat için mikroakışkan yapıları tasarlamak ve 10 mikron çözünürlükte devre kartı film üzerine bir satıcı tarafından basılan tasarımları var. Cihaz tasarımı detayları ekli referans 6&#39;da verilmiştir ve kanal geometrileri, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Katmanlar, her imalat tabaka 8&#39;den özellikleri yan yana koymak yardımcı hizalama işaretleri içermelidir. </li><li> spin kaplayıcı bir ön temizliği 3 inç çaplı silisyum gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 80 um bir tabaka kalınlığına sağlayan 1,750 rpm&#39;de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır. </li><li> gofret çıkarın ve 30 dakika süre ile 135 ° C sıcak plaka üzerinde pişirilir. gofret sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Bir paralel 190 m altında 1. katman maskesine kaplı gofret Açığa3 dakika için LED mil W, 365. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 1 dakika boyunca oda sonra serin bir 135 ° C sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin. </li><li> Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. 40 um&#39;lik bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka ile sonuçlanan, 5,000 rpm&#39;de daha sonra, 30 saniye, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde SU8-3050 1 ml uygulanır. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın. </li><li> 1.3 desenli geometri üzerine 2. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 4 dakika 30 saniye boyunca 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin. </li><li> Spin lak gofret yerleştirin ve aynasının bunu tutturmak için vakum açın. daha sonra, 500 rpm&#39;de 20 saniye boyunca gofret ve spin merkezinde 30 SU8-3050 1 ml uygulamasan 1000 rpm&#39;de, 100 um bir ek kalınlık sağlayan bir tabaka elde edilir. </li><li> Bir sonraki adıma geçmeden önce, 30 dakika boyunca 135 ° C sıcak plaka üzerinde oda sıcaklığına daha sonra soğuk gofret ve fırında çıkarın. </li><li> 1.3 desenli geometri üzerine 3. katman maskesi hizalayın ve 3 dakika boyunca LED nm bir paralel 190 mW, 365 kaplanmış gofret maruz bırakmaktadır. maruz kaldıktan sonra, bir sonraki aşamaya geçmeden önce, 9 dakika süreyle 135 ° C ocak üzerinde RT sonra serin yerleştirin. </li><li> 30 dakika boyunca, propilen glikol monometil eter asetat içinde karıştırılan bir banyoda daldırarak maskeleri geliştirir. 1 dakika için 135 ° C bir sıcak plaka üzerindeki izopropanol ve fırında gofret yıkayın. polidimetilsiloksan (PDMS) kalıplama için 100 mm Petri kabındaki geliştirilen usta yerleştirin. </li></ol> 2. PDMS Cihaz İmalatı <ol><li> plastik bir kap içinde sertleştirici 5 g silikon taban 50 g birleştirerek 1 PDMS: 10 hazırlayın. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir döner aracı ile içeriğini karıştırın. deg30 dakika boyunca bir desikatör içinde karışım olarak veya tüm hava kabarcıkları bertaraf kadar devam eder. </li><li> Master üzerinde 3 mm kalınlığında vermek ve daha fazla gaz alma için desikatörde geri yerleştirmek için PDMS dökün. Bir kez tüm kabarcıklar kaldırılır, 80 dakika boyunca 80 ° C &#39;de cihaz fırında. </li><li> desenli tarafı ile temiz bir yüzey üzerinde bir neşter ve yer kullanarak kalıp cihazı kesin ve 0.75 mm&#39;lik biyopsi yumruk ile akışkan giriş ve çıkış yumruk. 120 mikron ve 220 mikron boyunda geometrileri cihazın yan erişilebilir, böylece cihaz kesmek gerekir. </li><li> Plazma 300 W plazma temizleyici 20 saniye boyunca 1 mbar O 2 plazmada 3 inç cam slayt tarafından önceden temizlenmiş 2 inç ile birlikte yukarı özelliği tarafı, cihazı davranın. cam slayt plazma ile işlenmiş yüzüne PDMS cihazın desenli tarafını yerleştirerek PDMS cihaz Bond. 80 ° C sıcaklıkta fırında Cihazı ve 40 dakika boyunca monte edilmiş cihazın fırında. </li><li> kanal Renderflorlanmış bir yüzey işleme sıvısı ile cihaz temizlemek için bir şırınga kullanılarak hidrofobik. 10 dakika çözücünün buharlaşması için hemen 80 ° C&#39;de cihazı fırında. </li></ol> Optik Bileşenleri 3. hazırlanması <ol><li> 105 mikron çekirdek, 125 mikron kaplama son 5 mm yalıtımı kaldırarak lazer uyarma lif hazırlayın, NA 0.22 fiber optik =. </li><li> Bir 2. özdeş elyaf için 3.1 tekrarlayarak 2. renkli lazer uyarma fiber hazırlayın. </li><li> 200 mikron çekirdek, 225 mikron kaplama için 3.1 yineleyerek floresan sinyalini toplamak için fiber hazırlayın, NA 0.39 fiber optik =. </li><li> ipuçları düz bir yüzeye sona yoksa, bir lif çubukla uçları yeniden tutunmaya - tüm liflerin ipuçlarını inceleyin. </li><li> 50 mW, 405 nm lazer lazer fiber bağlayıcı takın ve lazer 105 mikron çekirdek liflerinin birini ekleyin. Lazer gücünün sensörüne elimden ucunu yönlendirinmetre ve lazer gücünü maksimize etmek lazer coupler ince ayar kullanın. </li><li> 50 mW, 473 nm lazer için 3.5 tekrarlayın. </li><li> Lazer ışığı bloke ve yayılan floresan iletmek için objektif tüpleri kullanarak PMT bir 446/510/581/703 nm dört band geçiren filtreler monte edin. o ışık PMT isabet önce filtreler üzerinden geçecek, böylece fiber kuplörünü takın. </li><li> 3.7 toplandı birimine 3.3 ile fiber takın. </li></ol> 4. Çevrim karıştırılmış bir emülsiyon Üretim <ol><li> 60 mm x 60 mm delik bir akış odak Mikroakiskan dropmaker cihazı edinin. </li><li> % 2 iyonik fluorosurfactant 9 HFE 7500 yağlar ile 1 ml şırınga doldurun. </li><li> 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM: floresein aşağıdaki birleşimleri (FITC) ve dekstran-konjuge mavi boyalar PBS (CB) 1 ml şırınga bir dizi doldurun CB, ve 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> ters MICROS sahnede dropmaker cihaz montebaş ve şırınga pompalarında sulu ve yağlı şırınga. Çift PE-2 boru kullanan cihazlar için şırınga. </li><li> 500 ul / sulu çözeltiler için bir yağ, 250 ul / saat saat sonra şırınga pompaları çalıştıran, 4.3 çözümler içeren 80 um damlacıkların bir karışım oluşturmak. Sulu örneğin her türü için, çapraz bulaşmayı önlemek için yeni bir dropmaker cihazı kullanın. Boş şırıngaya Her bir boya kombinasyonu emülsiyon ~ 200 ul toplayın. </li><li> 4 damlacıklar türleri tek bir koleksiyon şırınga içinde toplanmıştır sonra, defalarca şırınga çevirerek emülsiyonu karıştırın. </li><li> Tekrar sulu çözeltiler, PBS içinde 0.1, 1, 10 ve 100 nM FITC içeren 4.2-4.6 adımları tekrarlayın. </li></ol> 5. Fiber Optik Ekleme <ol><li> &lt;100 mikro-saniye deklanşör hızları yeteneğine sahip dijital kamera ile birleştiğinde ters bir mikroskop sahnede 2. adımda imal mikroakışkan çip yerleştirin. </li><li> yan, INSE dikkatle ÇalışmaAna akış kanalı aracılığıyla ponksiyon özen uzak yukarı 120 mikron kanalı içine 473 nm lazer bağlanmış lif rt. </li><li> , Uzak aşağı 120 mikron yüksek yan kanalı içine 405 nm lazer bağlanmış lif eklemek 300 mikron fiber boşluk sağlar. </li><li> iki lazer uyarım lifleri normal 220 mikron boyunda kanala PMT-birleştiğinde lif yerleştirin. </li></ol> Karışık Emülsiyonlar 6. Floresan Algılama <ol><li> PE-2 boru ile bir algılama cihazı aralayıcı yağı girişine% 2 iyonik fluorosurfactant HFE 7500 dolu bir 5 ml şırıngaya monte edin. </li><li> PE-2 boru kullanılarak cihazın damlacık reenjeksiyon girişine bir dikey olarak yönlendirilmiş şırınga pompa ve çift karışık FITC / CB emülsiyonu içeren şırınga monte edin. atık konteynerine cihaz çıkışından PE-2 boru uzunluğu bağlayın. </li><li> Her iki kadar 1.000 ul / saatte pompaların her çalıştırarak Başbakan cihazYağ ve damlacıkları düzenli cihazda birleştiren ve aşağı akan görülmektedir. </li><li> algılama bölgeye seyahat damlacıklar arasında önemli bir boşluk sağlar boşluk yağı 6.000 ul / saat hızında çalışır şekilde debileri ve 100 ul / saatte damlacıklarını ayarlayın. </li><li> , Lazerler açmak veri toplama programını başlatın ve bazal gürültü zemin 100x daha vardır sinyalleri sağlamak için PMT kazancı ayarlayın. duble zirveleri tek bir doğrusal ölçekli timetrace üzerinde açıkça görülebilir şekilde lazer gücünü ayarlayın. </li><li> en az 20 kHz PMT gerilim timetrace 60 saniye kazanır. Böyle Matlab olarak bilgisayar programına veri almak ve özel bilgisayar programı komut kullanılarak kaydedilen çifti zirvelerinden yükseklikleri ölçülür. Not: Bu ilave bilgi olarak verilmektedir. </li><li> Tekrarlayın 405 nm lazer kapalı olan, 4,7 oluşturulan FITC sadece karışık emülsiyon kullanılarak 6.2-6.7 adımları. </li></ol>

<ol>
	<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidics.">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics.">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li><li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li><li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution.">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004 (2010).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR.">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li><li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics.">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li><li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+droplet-based,+optofluidic+device+for+high-throughput,+quantitative+bioanalysis.">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li><li>. Lithography Available from: <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015)</li><li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis:+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants.">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li><li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution.">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882 (2012).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops.">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li><li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer.">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li><li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis.">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li><li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides.">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li><li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching.">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Fiber optik algılama akışkan kanal ile ilgili olarak, optik fiberlerin hizalanmasını gerektirir. Bizim cihaz çok tabakalı fotolitografiyle imal kılavuz kanalları kullandığından, birbirlerine göre olan maske yerleştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Fiber kılavuz kanallar sıvı kanala çok yakın ise, sıvı sızması için bir potansiyel var; kılavuz kanallar çok uzakta bulunan ya da hizadan ise, algılama fiber tarafından toplanan floresan sinyali önemli ölçüde azalabilir. Tam hizalama fotoğraf desen sırasında birlikte bulunduğu için maskeler bu tür konsantrik daireler olarak hizalama işaretlerini, tasarlayarak destekli olabilir. Ayrıca, cihazın içine fiber optik manuel yerleştirme kullanılamaz onları render cihaz içinde liflerin ipuçları kırmaya potansiyeline sahip hassas bir süreçtir. Mikroskop ile gözlemlerken tuşları olan PDMS cihazına bağlanmış cam slayt karşı lif kısıtlama ve yavaş yavaş lifleri ekleyerek SUCC içinessful lif ekleme. önceden oluşturulmuş emülsiyonların Son yeniden enjeksiyon işleme minimum gerçekleşmelidir. emülsiyon hazırlanmadan ve boş şırınga içine doğrudan bırakıldığı, bir kez damlacık tekrar enjeksiyon için kullanılan kadar İdeal olarak, bu transfer olmamalıdır. Çok renkli algılama sinyal duble içinde zirveleri birbirlerinden ve ardışık damlacıkların gelen sinyaller üst üste olmadığını farklı olmasını gerektirir. Burada kullanımı algılama ayarları uyarım bölgeler arasında ~ 175 um ışıksız bölge temin 300 um bir merkez-merkez mesafede ayrılan 125 um, optik elyafın bir çift kullanır. Bu 80 um damla aynı anda yalnızca tek bir ışık kaynağı tarafından uyarılan sağlar ve dubletin piklerin her sadece lazer uyarma bir tipinin bir sonucu olduğunu garanti eder. uyarma bölgeler arasındaki ayrım damlacık çapı benzer Tasarımlar emisyon tepe çiftleri üst üste sorunlu sinyallerini veriyor. To çiftli final uyarma bölgesini içinde ~ 500 mikron mesafe bırakmak için zaman damlacık arka kenarını ilk uyarım bölgeleri girmek için bir damlacık ön kenarına için gereken süre ilişkilendirir bir sinyalin genişliği cihaz biz tarif. Bitişik tespit damlacıkların farklılığı korumak için, sinyal ikili sinyal duble en az kadar geniş bir düşük sinyal bölgeye göre aralıklı olması gerekir. Burada açıklanan yapılandırma için, 80 mikron damlacıkları birbirinden en az 1 mm aralıklı. Tek bir fotodetektör ile çok renkli algılama maliyet ve standart tekniklere göre karmaşıklık açısından önemli tasarruflar için izin verse yayılan ışık dalga boyu tarafından filtre değil çünkü, sağlamlık bazı kaybı vardır. floresan kaynağı ayırt edilemez, çünkü aynı dalga boylarında heyecanlandırmak birden fluorophores ihtiva damlacıklar tespit ettiğinde bu sorunlu olabilir. Bu sınırlamalar overc olabilirörtüşmeyen uyarma profilleri ile deneyler yaparak, ya da hassas bir tahlil yapılmaktadır bir &quot;kanal&quot; olarak oluşmaz üzerinde kanamaya spektral deneyleri tasarlayarak ome. Bu parlak bir arka boyası bir damlacık varlığını belirtmek için kullanılan bir çok damlacık mikroakışkan algılama uygulamaları ile uyumlu, ve bir ikinci fluorofor moleküler biyoloji tahlilinde 10,11 sonucunu bildirmek için kullanılır. 1) mekansal kayıtlı uyarma bölgeleri karmaşık ışık filtreleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve fiber optik 2) kullanımı doğrudan ışığa mikroskop ve optik donanım ihtiyaçlarını kaldırır: standart tekniklere göre, bizim yaklaşımımız iki ana avantajı vardır. Biz mikroakışkan algılama sistemleri ile ortak teknik kaygılarını, çünkü daha önceki araştırmacılar benzer endişeleri gidermek için yöntemler geliştirmişlerdir. Örneğin, Martini ve ark. Frekans kodlamak çok renkli floresan kaydedildibenzersiz desenli &quot;barkod&quot; aracılığıyla bir uyarım kaynağı yansıtarak, tek bir detektör ile 12 filtreler. fiber optik dizinin Bizim kullanılması raf bileşenleri kapalı standardını kullanarak benzer bir zamansal kodlama şemasının kullanımı, izin verir. Literatür daha biz tarif basit lif ekleme kontrollü optik sayıda optik bağlantı teknikleri gösterir. Uyarma ışık 14 ve Vishnubhatla ark sunmak için erimiş silika yüzeyler kazınmış Bliss ve ark. Martinez Vasquez ve arkadaşları belirli mikrokanal yerleri 13, ışık titizlikle kontrol dağıtımı ve toplanması için sıvı dolu optik dalga kılavuzları kullanın. Kullanın dalgakılavuzları lazer. Vardır tam 15 gravür, lazer ışınlama ve kimyasal bir arada kullanarak elyaf ekleme kanalları imal etmek mümkün. Bu tekniklerin her biri, bir microfl taban akışkan mimarisi imal etmek için kullanılan ötesinde ek adımlar gerektirmezuidic çip. Bu üretim işlemleri çok hassas algılama uygulamaları için gerekli olmakla birlikte, bir kalıplanmış PDMS kanalı içine elyaf ekleme laboratuarımızda, günlük uygulama için en uygun olduğunu bulduk. algılama sistemi ~ 17.000 florofor moleküllerinin tespiti kabaca eşdeğer, 80 mikron damlacıklar halinde 100 pm&#39;den aşağı FITC konsantrasyonlarını tespit etmeyi başardı. Bu duyarlılık, şu anda 10 6 florofor moleküllerinin 11 eşdeğeri içeren tahlil pozitif damlacıkların hücre sıralama PCR aktif hale En yaygın olan bir Epifloresans tabanlı bir sistem kullanılarak laboratuvarımızda en algılama uygulamaları için yeterlidir. Algılama hassasiyeti yakın zamanda diğer fiber optik tabanlı sistemlerin hassasiyetlerini bildirilen olumlu karşılaştırır - örneğin, o&gt; 100 mikron damlacıklar 7 rapor Alexa Fluor 488 20 nM algılama sınırından daha 200x daha duyarlıdır. We daha pahalı, karmaşık ve hantal Epifloresans mikroskop tabanlı sistemlerine alternatif olarak kompakt ve modüler damlacık mikroakışkan çok renkli algılama düzeni sundu. Burada kullanılan gerekli algılama bileşenleri (lazerler, lifler, lif adaptörler, filtre ve PMT) çoklu algılama istasyonları göze bireysel araştırmacılara araştırmacılar çok sayıda çoklu renk damlacık algılama erişilebilir hale ve izin &lt;10.000 $ için satın alınabilir bir laboratuarda. yakınlık derecesi bir Epifloresans mikroskop ile birlikte serbest uzay optik sistemleri hizalamak için gerekli olan sistem aynı zamanda, giriş bazı uzmanlık tabanlı engelleri kaldırmak. Ayrıca tespitler kurulum küçük ayak izi bu ideal taşınabilir ve teşhis uygulamaları için uygun hale getirir.

Damlacık Mikroakiskan bir taşıyıcı yağ 1 içinde süspansiyon haline sulu damlacıkların çok sayıda deney bölümlere yüksek verimli biyoloji için bir platform sağlar. Damlacıklar tek bir hücre analizi 2, dijital polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) 3 gibi çeşitli uygulamalarda kullanılan ve evrim 4 enzim edilmiştir. Parlak sinyaller ve hızlı zaman yanıtı kilohertz oranlarında alt nanoliter damlacık hacimleri tespit uyumlu olarak Floresan tahlilleri, damlacık Mikroakiskan için algılama standart modu bulunmaktadır. Birçok uygulama, aynı anda en az iki renk için floresans algılama gerektirir. Örneğin, bizim laboratuar yaygın bir tahlil sonucu için bir algılama kanalı kullanmak damlacık sıralama deneyleri PCR aktive gerçekleştirir ve 5 tahlil negatif damlacık sayılabilir yapmak için ikincil bir arka plan boya kullanır. damlacık Mikroakiskan için tipik algılama istasyonları ba vardırEpifloresans mikroskoplar üzerinde sed ve numune odaklı olmak mikroskop içine boş alan lazerler uyarma ışık tanıtmak için ışık manipülasyonlar düzenleri karmaşık gerektirir. floresan bir damlacık yayılan sonra her algılama kanalı dalgaboyu bandında merkezli bir photomultiplier tüp (PMT) kullanır, böylece yayılan fluoresced ışık süzülür. Epifloresans mikroskop tabanlı optik algılama sistemleri nedeniyle gider, karmaşıklık girişine bir bariyer sağlar ve bakım gereklidir. Optik fiberler fiberler elle ayna tabanlı ışık yönlendirme ihtiyacını ortadan kaldırarak, ve ışık yolları fiber optik konnektörleri kullanarak arabirim sağlayan mikroakışkan cihazlar eklenebilir çünkü araçlar, basitleştirilmiş ve sağlam algılama düzeni inşa etmek sağlarlar. Bu yazıda, optik fiberler An bir dizi kullanarak çok renkli floresan algılama gerçekleştirmek için kompakt ve modüler bir düzeni montaj ve doğrulama tarifda tek fotodetektör 6. Optik fiberler bağımsız lazer bağlanır ve düzenli mekansal uzaklıklar bir L şeklinde bir akış kanalına dik yerleştirilir. Bir flüoresan toplama fiber uyarım bölgelerine paralel yönlendirilmiş olan ve tek bir PMT bağlanır. Bir damlacık farklı zamanlarda lazer ışınları geçer, çünkü PMT tarafından kaydedilen veriler zamansal kullanıcı damlacık her ayrı lazer ışını tarafından heyecan sonra yayılan floresan ayırt sağlar ofset gösterir. Bu zamansal kayma dikroik aynalar ve bant geçiren filtreler bir dizi kullanarak ayrı Proje Yönetim Ekipleri yayılan ışık ayırmak için gereksinimini ortadan kaldırır. Dedektörün etkinliğini doğrulamak için, biz farklı renk ve konsantrasyon boyalar encapsulating damlacık popülasyonlarında floresan ölçmek. sistemin duyarlılığı tek renkli floresan saptama için incelenmiş, ve 0.1 nM bir 200x hassasiyet göstr kadar konsantrasyonlarda damlacıklar tespit edilebildiğini gösterirLiteratürde 7 bildirilen son elyaf bazlı yaklaşımlar karşılaştırıldığında ovement.

<table><tbody><tr><td>Photomasks</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3&quot; silicon wafers, P type, virgin test grade</td><td>University Wafers</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 gaugue needles</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 polyethylene tubing</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Commonly knowns as HFE 7500</td></tr><tr><td>Ionic Krytox Surfactant</td><td></td><td></td><td>Synthesis instructions in ref #10</td></tr><tr><td>Dextran-conjugated cascade blue dye</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Quad bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Fiber port</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>lens tube</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Patch cable with 200 &amp;#956;m core / 225 &amp;#956;m cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Patch cable with 105 &amp;#956;m core / 125 &amp;#956;m cladding optical fiber with one stripped end and one FC/PC connector</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &amp;#956;m fiber stripping tool</td><td>Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &amp;#956;m fiber stripping tool</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>laser fiber adapter</td><td>OptoEngine</td><td>FC/PC Adapter</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser at 50&amp;nbsp;mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distributor for CNI lasers</td></tr><tr><td>473 nm CW laser at 50&amp;nbsp;mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolor fluorescence detection for droplet microfluidics using optical fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Optik fiberlerin yerleştirilmesi için izin veren bir PDMS cihazın imalatı değişen yükseklik (Şekil 1) kanalları oluşturmak için çok adımlı bir fotolitografi prosedürü gerektirir. İlk olarak, SU-8 80 um boyunda tabaka silikon yonga üzerine bükülmüş ve akışkan geometrisini oluşturmak için bir maske kullanılarak şekillendirilmiştir. Sonraki, SU-8 ek 40 mikron katman gofret üzerine bükülmüş ve 120 mikron boyunda lazer fiber ekleme kanalları oluşturacak özellikleri oluşturmak için ikinci bir maske kullanılarak desenli. Son 100 mikron daha SU-8 gofret üzerine bükülmüş ve 220 mikron boyunda algılama fiber ekleme kanalları vermek için desenli. Ana gelişmiş ve bu da cam bir slayta yapıştırılmış olan bir PDMS cihaz, kalıp için kullanılır. Nihai imalat yan aracılığıyla erişilen cihaz ve 120 um ve 220 mikron boyunda fiber optik kanalları üst açılmış delikler üzerinden erişilen, 80 mikron boyunda akış geometri içerircihazı. Tespiti için kullanılan cihazın geometrisi Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Harici olarak oluşturulan 80 um emülsiyonlar bir damla yeniden enjeksiyon portuna yeniden enjekte edildiği ve bir L şekli algılama kanalına akış önce boşluk yağı ile aralanmıştır. 120 mikron boyunda kanallar akış kanalında ayrı uzaysal noktada uyarılmaya sağlamak içine iki lazer birleştiğinde lifler eklenir. bu kanallar içine yerleştirilir modlu fiberler, bir 125 mikron dış çapa ve 105 um&#39;lik bir çekirdek çapa sahip olduğundan, akış kanalının toplam enine kesiti lazer ışığı ile aydınlatılır. Bizim cihazda algılama akış kanalı yayılan floresan algılamak için kullanılan bir 225 mikron OD elyaf yakın optik erişim oluşturmak için son lazer uyarma bölgesinden sonra ani bir 90 derecelik dönüş yapar. Büyük lif nedeniyle standart bir mikroskop objektif benzer yüksek sayısal açıklık (NA = 0.39), kullanılır. Algılama kanalı boyunca akan bir damlacık lazer bağlanmış optik fiberlerin (Şekil 3A), her birinin önünde ayrı uyarı bölgeleri karşılaşır. Tek PMT haritaları uyarım kaynağına zamansal değişimi ile floresan yayılan algılama fiber kayıtlarına birleştiğinde. 473 nm&#39;de (Şekil 3A&#39;da bölge &quot;1&quot;) de ve 405 nm&#39;de (Şekil 3B&#39;de bölge &quot;2&quot;) de tahrik boyaları içeren bir damlacık için, elde edilen PMT sinyali ile korele tepe ayrılması sahip bir sinyal dublet içeren kez bir uyarım bölgeden diğerine taşımak için bir damlacık alır. Geçici olarak bu şekilde spektral veri kodlama ile, bundan başka bir ışık filtreleme ve her bir flüorofor renk için ayrı Proje Yönetim Ekipleri ihtiyacı ortadan kalkar. Şekil 3B, farklı boya kombinasyonları ile 4 damlacıkların bir tren sinyal çiftleri göstermektedir. çift ​​tekabül ilk zirve&quot;1&quot; Bölgede 473 nm lazer ve ikinci zirve ile uyarma sonrasında yayılan floresan s &quot;2&quot; Bölgede 405 nm lazer ile uyarma sonrasında yayılan floresan gelir. algılama düzeni etkinliği 405 nm&#39;de (dekstran-bağlı, mavi, CB) olarak tahrik ve 473 nm&#39;de (florosein FITC) de boyalar içeren damlacıkların bir karıştırılmış bir emülsiyon tespit test edilmiştir. Damlacıklar kabaca 50 Hz&#39;de algılama bölgelerine akan ve veriler daha sonra bir bilgisayar programı komut post-işlenmiş 60 saniye, kaydedildi. Veri Şekil 4&#39;te çizilen ve dört yeniden enjekte damlacık türleri arasındaki net bir ayrım gösterir. algılama sistemi yayılan ışığın farklı renklerde arasında ayrım yapmaz, çünkü her damlacık 2 (pik 2) (tepe 1) bölge &quot;1&quot; de heyecanlı kaldıktan sonra ve bölgedeki maksimum toplam floresan tarif edilmektedir. (Şekil 5) 405 nm lazer kapatarak ve floresan damlacıklar ihtiva eden bir emülsiyonun floresan ölçüm incelenmiştir. Veriler aynı algılama ayarları ile tek bir dedektör 0.1 ila 100 nM FITC değişir boya konsantrasyonu tespit yeteneğini gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig1.jpg" /> 1. Çok katmanlı fotolitografi rakam. mikroakışkan cihaz üç farklı özellik yükseklikleri ile bir master oluşturarak imal edilir. İlk olarak, SU-8 bir 80 mikron boyunda tabaka üzerinde bükülmüş ve sıvı kanallar için bir maske kullanılarak desenli. Sonraki 40 mikron daha SU-8 bükülmüş ve 120 mikron boyunda özellikler 125 mikron boyunda optik fiberler karşılamak için geometri elde etmek için SU-8 tabakadan hem aracılığıyla 2 ile desenli nd maske vardır. Bundan sonra, 100 mikron daha SU-8 bükülmüş ve 225 mikron boyunda özellikleri elde etmek için bir 3. maskesi ile desenli. Cam, PDMS döküm ve plazma yapıştırma geliştirdikten sonra, ortaya çıkan cihaz standart kapalı akışkan kanallarına ek olarak, lif yerleştirilmesi için taraftan erişilebilir büyük kanalları içerir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54010/54010fig2.jpg" /> Şekil 2. Aygıt tasarımı ve optik düzen. Cihazın akışkan bölümleri, bir L-şekilli kanala birleştirilmiş bir damlacık reinjector ve bir yağ ayırıcı, oluşmaktadır. Bireysel lazerler bağlanmış lifler akış yönüne dik yerleştirilir. Bir algılama fiber flüoresan ışığı toplamak üzere bir lazer liflerine dik yerleştirilir. Bu ışık ab ile süzülürandpass filtre, tek bir PMT tarafından tespit edilmeden önce. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54010/54010fig3.jpg" /> Çok renkli bilgilerin 3. Geçici kodlama rakam. (A), damlalar yayılan ışığın belirlenmesini sağlar zaman değişimi sağlayan, farklı zamanlarda uyarım bölgeleri &quot;1&quot; ve &quot;2&quot; akar. Algılama kanalından akan 4 farklı damlacıkların bir tren (B) veri. Her ikilisinin ilk zirve &quot;1&quot; Bölgedeki uyarma ve &quot;2&quot; Bölgede uyarım sonrasında yayılan floresan her çift tekabül ikinci zirve sonrasında yayılan floresan karşılık gelir. damlacık dorukları yüksekliği de boya heyecanlı miktarını orantılıdırspektral kanama uyarma spektrumları örtüşen boyaların kullanımı nedeniyle meydana dışında, dalga boyu verilen. Piklerin genişliği bir uyarım bölgeyi çapraz bir damlacık geçen süre miktarına göre belirlenir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54010/54010fig4.jpg" /> Karışık damlacık nüfusun 4. Multicolor algılama rakam. Bir 473 nm lazer (pik 1) ile uyarma ve emisyon sonra karışık bir damlacık nüfus için maksimum damlacık yoğunlukları gösteren dağılım çizim ve 405 nm lazer (pik 2). Damlacıkları nM konsantrasyonlarda floresein (FITC) ve kaskad mavi (CB) kombinasyonlarını içermektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig4large.jpg" target="_blank">Bu büyük halini görmek için tıklayınız</a>rakam. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54010/54010fig5.jpg" /> Çok çeşitli damlacık nüfus 5. Tek renk algılama rakam. Bir 473 nm lazer ile uyarma sonra floresein 0.1-100 nM içeren karışık bir damlacık nüfus tarafından emisyonların histogram. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54010/54010fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers at JoVE.com

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

multicolor-fluorescence-detection-for-droplet-microfluidics-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.4K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Video: Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. This approach to colorimetric DNA detection was based on the hybridization-mediated growth of gold nanoparticle probes (AuNP probes). The growth size and configuration of the AuNP are dominated by the number of DNA samples hybridized with the probes. Based on the specific size- and shape-dependent optical properties of the nanoparticles, the number of mismatches in a sample DNA fragment to the probes is able to be discriminated. The tests were conducted via droplets containing reagents and DNA samples respectively, and were transported and mixed on the pneumatic platform with the controlled pneumatic suction of the flexible PDMS-based superhydrophobic membrane. Droplets can be delivered simultaneously and precisely on an open-surface on the proposed pneumatic platform that is highly biocompatible with no side effect of DNA samples inside the droplets. Combining the two proposed methods, the multi-nucleotide polymorphism can be detected at sight on the pneumatic droplet manipulation platform; no additional instrument is required. The procedure from installing the droplets on the platform to the final result takes less than 5 min, much less than with existing methods. Moreover, this combined MNP detection approach requires a sample volume of only 10 &#181;l in each operation, which is remarkably less than that of a macro system.

This work presents a simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphisms on a pneumatic droplet manipulation platform. With the proposed method, the entire experiment, including droplet manipulation and detection of multi-nucleotide polymorphisms, can be performed near 23 &#176;C without the aid of advanced instruments.

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Genetik

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Refraktometrik Algılama Floresan çekirdekli mikro kavitasyonlar sentezi ve İşletilmesi

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Mühendislik

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Biyomühendislik

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Biyokimya

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the main trend in the advanced development of flow cytometry. Notably, adding high-resolution imaging capabilities allows for the complex morphological analysis of cellular/sub-cellular structures. This is not possible with standard flow cytometers. However, it is valuable for advancing our knowledge of cellular functions and can benefit life science research, clinical diagnostics, and environmental monitoring. Incorporating imaging capabilities into flow cytometry compromises the assay throughput, primarily due to the limitations on speed and sensitivity in the camera technologies. To overcome this speed or throughput challenge facing imaging flow cytometry while preserving the image quality, asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) has been demonstrated to enable high-contrast, single-cell imaging with sub-cellular resolution, at an imaging throughput as high as 100,000 cells/s. Based on the imaging concept of conventional time-stretch imaging, which relies on all-optical image encoding and retrieval through the use of ultrafast broadband laser pulses, ATOM further advances imaging performance by enhancing the image contrast of unlabeled/unstained cells. This is achieved by accessing the phase-gradient information of the cells, which is spectrally encoded into single-shot broadband pulses. Hence, ATOM is particularly advantageous in high-throughput measurements of single-cell morphology and texture &#8211; information indicative of cell types, states, and even functions. Ultimately, this could become a powerful imaging flow cytometry platform for the biophysical phenotyping of cells, complementing the current state-of-the-art biochemical-marker-based cellular assay. This work describes a protocol to establish the key modules of an ATOM system (from optical frontend to data processing and visualization backend), as well as the workflow of imaging flow cytometry based on ATOM, using human cells and micro-algae as the examples.

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

This protocol describes the implementation of an asymmetric-detection time-stretch optical microscopy system for single-cell imaging in ultrafast microfluidic flow and its applications in imaging flow cytometry.

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Tek Hücreli Sitokin Sekresyon Analizi için Mikroakışkan Damlacık Testi

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Gündemi: Bağışıklık Tepkilerinde Çok İşlevlilik ve Heterojenliğin Ortaya Çıkarılması

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

Damlacık Mikroakiskan için renkli Floresan Algılama Optik Elyaf kullanma

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Pnömatik Damlacık Manipülasyon Platformu Multi-nükleotid Polimorfizmlerinin Görsel Kolorimetrik Tespiti

Refraktometrik Algılama Floresan çekirdekli mikro kavitasyonlar sentezi ve İşletilmesi

Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım

Bireysel Çok Fonksiyonlu Hücrelerin Eşzamanlı ve Ardışık Sitokin Sekresyonunu Çözmek için Mikroakışkan Yaklaşım