Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Wir danken dem späten Rudy Limburg für die Kardan Armumfang Herstellung, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, und Raju Metherate uns Ausrüstung für die Kreditvergabe, und Almut Kelber und Kentaro Arikawa, für Ermutigung. Diese Arbeit wurde von einem National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship an KJM und NSF Zuschuss IOS-1257627 ADB unterstützt

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die intrazelluläre Aufnahme kann eine schwierige Technik, aufgrund der vielen technischen Schritte zu meistern beteiligt. Für eine erfolgreiche Experimente müssen einige wichtige Punkte berücksichtigt werden. Erstens ist es wichtig, eine richtig schwingungsisolierten Tisch zu haben, an dem das Experiment durchgeführt wird. Viele Forscher verwenden Luft-Tabellen, die vollständig die Tischplatte von der Basis trennen, überlegene Schwingungsisolierung zu geben. Unser Setup beinhaltet einen dicken Marmortisch mit einem Sandkasten auf, in die platziert wird, um die Mikromanipulator / Elektrodenhalter / Probentischgerät. Dies ist eine effektive und kostengünstige Alternative zu einem Lufttisch, vor allem, wenn der Zugang zu in-house Gas oder Druckluft ist eine Einschränkung. Zusätzliche vibrationsdämpfende Maßnahmen wie passive Luftfederung getroffen werden können, oder die Zugabe von Dämpfungselementen an den Tischbeinen (zB geöffnet Tennisbälle, Fahrradschläuche, dicke Gel - Pads). Darüber hinaus ist es wichtig, dass der experimentelle Aufbau im Inneren sein,Faraday-Käfig mit allem, was richtig geerdet ist. Der Faraday-Käfig sollte ein Metall-Mesh-Sieb in der Vorderseite haben, die entfernt werden kann, wenn einfach in den Käfig und ersetzt arbeiten bei der Aufnahme. Selbst eine kleine Menge an Umgebungs elektrisches Rauschen (insbesondere 50 Hz Lärm von der Hauptstromversorgung AC) kann eine ansonsten gute Aufnahme unbrauchbar machen. Wenn die Probe vorbereitet, Hämolymphe und Pigmentschichten die Ommatidien umgibt, kann erfolgreiche Aufnahmen verhindern. Wenn das Loch in der Hornhaut geschnitten wird, zu groß, normale Pumpen von Hämolymphe im Körper bewirkt, dass die Flüssigkeitsoberfläche an der Schnitt Seite nach oben und unten, in einer instabilen Aufnahme führt. Sobald das Loch geschnitten wird, Hämolymphe und Oberflächenpigmentschichten wird schnell zu einem undurchdringlichen Schorf gerinnen selbst wenn sie mit Vaseline verschlossen, so ist es wichtig, die Elektrode in das Auge so schnell wie möglich zu bekommen. Ringer-Lösung kann auch anstelle von Vaseline verwendet werden. Die Erdungselektrode kann in die eingeführt werdenMundwerkzeuge oder in den Stumpf eines geschnittenen Antenne. Zusätzlich ist es oft hilfreich, um das Tier zu halten, wie dunkeladaptierten wie möglich. Für dieses Verfahren umfassen halten Schritte, um den Aufnahmeraum sehr dunkel, Streulicht von der Xenon-Lampe Blockierung vom Eintritt in den Faraday-Käfig, kurzer Dauer Stimulus blinkt (30-50 ms), und eine ausreichend niedrige Frequenz zwischen den Blitzen (0,5 oder höher). Wenn ein visuelles Pigment ein Photon absorbiert, schaltet das Chromophor in Rhodopsin von 11- cis - 3-hydroxyretinal zu all - trans - Retinal, die Konformationsänderung des Opsin - Protein zu induzieren, und den gesamten Komplex als Metarhodopsin Aktivierung, die das G - Protein initiiert Kaskade. Photo-Bleich tritt auf, wenn Licht mit hoher Intensität den Chromophor verursacht von dem Opsin-Protein physisch zu trennen. Es ist ein limitierender Faktor bei diesem Versuch, da die Elektrode nur stabil Antworten aufzeichnen wird von innerhalb der Zelle für eine bestimmte Zeitdauer, bevor es aus fälltoder die Membran beschädigt ist. Aus diesem Grund brechen wir nicht die Zelle, sich zu erholen, aber wir haben einen Blitzdauer und Frequenz verwenden, die wir gefunden haben, nicht die Zelle die Reaktion im Laufe der Zeit verschlechtern. Es ist wichtig, sowohl die Frequenz und die Intensität des Lichts zu verringern, wenn Photobleaching auftritt. Während der Aufnahme eine große Elektrodenspitze oder große Bewegung durch die Elektrode kann die Zelle beschädigen, wenn die Membran zu durchdringen. Nur feine Spitzen (mindestens ~ 100 M &amp; Omega;) und kleine Bewegungen verwendet werden sollte, wenn eine Zelle zur Aufnahme nähert. Wenn die intrazelluläre Aufnahme auf andere Anwendungen angewendet wird, wie Gehirnaufnahmen, extrem feine, stabile Elektroden können unter Verwendung von Quarzglas gezogen, aber ein Fach puller muss für diese Elektroden verwendet werden. Wenn zuerst eine Elektrode ziehen Programm machen, überprüften wir Spitze Widerstand durch die Elektrode Verfüllung, es an den Elektrodenhalter in einem Mock-Setup zu sichern, und die Spitze und Masseelektrode in Salzlösung setzt. Next rechneten wir mit einem aktuellen Änderung der Spannung auf dem Oszilloskop zu messen. So verschieben wir die Elektrodenspitze eine manuelle Mikromanipulator verwenden, die entlang zweier Achsen bewegt. Andere Manipulatoren bestehen einschließlich digitaler diejenigen, die Bewegung entlang allen drei Achsen ermöglichen, und diese können für diese oder komplexere Anwendungen verwendet werden. Es gibt viele Möglichkeiten, eine Stufe zur Aufzeichnung zu bauen, und es gibt viele verschiedene Arten von Hardware und Software in die Aufnahme verwendet und die beobachteten Daten zu analysieren. Unser Setup stellt eine einfache, einfache und kostengünstige Einrichtung der Aufnahme rig. Bei der Konstruktion des VlogI Kurve entwickelte Funktionen , die von Naka und Rushton 33 und andere , 34,35 - Konto für die nichtlinearen Bereiche der aufgetragenen Antworten. Verschiedene Verfahren werden verwendet , diese Kurve an die Daten anzupassen, und wir geplottet die Ergebnisse eines solchen Verfahrens , das nicht Kurvenanpassungs - Software erfordert, obwohl auch andere Verfahren geeignet sind 36,37 ( <strong&gt; Abbildung 7). Es kann auch nützlich sein, um spektrale Empfindlichkeiten auf Modelle von Rhodopsin Absorption bei einer gegebenen Spitzenwellenlänge zu vergleichen. Mehreren veröffentlichten Modelle zielen 38,39 Rhodopsin Absorptionsspektren zu reproduzieren. Eine genauere Vorstellung von dem Absorptionsspektrum des visuellen Pigment in einer Insektenzelle exprimiert Photorezeptor kann durch Berücksichtigung Ommatidien Eigenschaften wie Filterpigmente modelliert werden, aber dies erfordert die Messung von zusätzlichen physiologischen und anatomischen Parametern 11,40. Eine Beschränkung des Verfahrens besteht darin, dass, wenn die Studie Organismus mehr als einer genetisch ähnlichen Opsin in das Auge drückt, es schwierig sein kann, zu identifizieren, welche Opsin mRNA entspricht wahrscheinlich die spektralen Klasse von Photorezeptorzellen. Um dieses Problem zu überwinden, hat dieses Verfahren mit Farbstoffinjektionen kombiniert worden und in situ - Hybridisierung oder Immunhistochemie , um erfolgreich die Opsinen identifizieren ausgedrückt in 10 aufgezeichnet Zellen. Unsere Methode ist einfach und zugänglich für Forscher nicht vertraut mit visuellen Elektrophysiologie. Diese Technik ist weit verbreitet in den Neurowissenschaften, aber spezifische und klare Methoden sind in der Literatur nicht vorhanden, so dass dieses Verfahren nur schwer zu reproduzieren. Obwohl viele Variationen dieser Technik vorhanden sind, bieten wir eine einfache Möglichkeit, die spektrale Empfindlichkeit in der Verbindung Auge zu messen. Die physiologischen Daten ist ein wichtiges Beweisstück in Geschichten der visuellen Ökologie und Evolution 41. Opsin Sequenzvariation ist eng mit der Empfindlichkeit einer Photorezeptorzelle verbunden sind, diese Methode ideal für Studien machen die genetische Grundlage für phänotypische Veränderungen zu untersuchen. Die Messung der Sehzellen Empfindlichkeiten können auch mit Verhaltensfarbunterscheidungstests gepaart werden, die physiologische Grundlage für wichtige Unterscheidungsschwellen in Vision Farbe zeigt 42-46. In genetischen oder therapeutische Manipulationen in Drosophila zum Beispiel, dieses Technik kann ein guter Weg sein , die richtige physiologische Funktion des Auges oder des Gehirns als auch 47,48 zu messen. Obwohl uns nicht die erste oder die komplexeste Methode der intrazellulären Aufnahme in das Auge, unsere Hoffnung ist, dass wir diese Methode für die Wiedergabe und die Integration mehr machen können außerhalb der formalen Neurowissenschaften in Forschungsprogramme leicht zugänglich sind.

Die elektrischen Eigenschaften von Zellen, wie Neuronen werden durch Messen Ionenfluss durch die Zellmembranen als Änderung der Spannung oder des Stroms beobachtet. Eine Vielzahl von elektrophysiologischen Techniken entwickelt worden bioelektrischen Ereignisse in Zellen zu messen. Neurone in den Augen von Tieren zugänglich sind und ihre Schaltungsanordnung ist oft weniger komplex als im Gehirn, diese Zellen gute Kandidaten für eine elektrophysiologische Untersuchung zu machen. Gängige Anwendungen von Elektro im Auge umfassen Elektroretinogramm (ERG) 1,2 und Mikroelektroden intrazelluläre Aufnahme. ERG beinhaltet in oder auf dem Auge eines Tieres eine Elektrode platziert, ein Lichtreiz Anwendung und Messung der Änderung der Spannung als Summe der Antworten aller Zellen in der Nähe 3-6. Wenn man bei der Charakterisierung von spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen speziell interessiert ist, oft mehrere Zelltypen gleichzeitig an verschiedenen Stärken auf einen bestimmten Reiz reagieren; somitschwierig sein kann, die Empfindlichkeiten von spezifischen Zelltypen aus ERG-Daten zu bestimmen, insbesondere dann, wenn verschiedene Arten von spektral ähnlichen Sehzellen im Auge sind. Eine mögliche Lösung ist transgene Drosophila mit dem Photorezeptor (Opsin) Gen von Interesse in den meisten R1-6 Zellen im Auge ausgedrückt zu schaffen und führen Sie dann ERG 7. Mögliche Nachteile dieser Methode sind nicht zu niedrig Expression des Proteins Photorezeptor 8, und die lange Zeitrahmen für die Erzeugung und das Screening von transgenen Tieren. Für Augen mit weniger Arten von spektral unterschiedlichen Photorezeptoren, die Anpassung des Auges mit farbigen Filter können mit Absenken der Beitrag einiger Zelltypen zu dem ERG, wodurch Schätzung der spektralen Empfindlichkeitsmaxima 9 helfen. Die intrazelluläre Aufnahme ist eine weitere Technik, wo eine feine Elektrode, die eine Zelle und ein Stimulus spießt angewendet wird. Die Elektrodenaufzeichnungen nur, dass indivIdual Zelle Antwort , so dass von der Aufnahme und mehreren einzelnen Zellen 10-14 spezifischen Empfindlichkeiten von physiologisch unterschiedlichen Zelltypen zu analysieren ergeben. Obwohl unser Protokoll auf der Analyse der spektralen Empfindlichkeit konzentriert, sind die grundlegenden Prinzipien der intrazellulären Aufnahme mit scharfen Elektroden für andere Anwendungen modifizierbar. Mit einer anderen Vorbereitung einer Probe, zum Beispiel, und mit scharfen Quarzelektroden kann man aus tiefer in den optischen Loben oder anderen Regionen im Gehirn, die sich an der Frage abhängig gefragt. Zum Beispiel Antwortzeiten einzelner Sehzellen 15, Zell - Aktivität in den optischen Loben 16 (Lamina, Medulla oder Lobula 17), Gehirn 18 oder andere Ganglien 19 kann auch mit ähnlichen Techniken aufgezeichnet werden, oder Farbreize mit Polarisation ersetzt werden könnte 20 -22 oder Bewegungsreize 23,24. Phototransduktion, das Verfahren, mit dem LichtEnergie absorbiert und in ein elektrochemisches Signal, ist ein altes Merkmal gemeinsam fast alle heutigen Tierstämme 25. Die visuelle Pigment gefunden in Sehzellen und verantwortlich für Phototransduktion Einleitung ist Rhodopsin. Rhodopsine in allen Tieren sind aus einem Opsin - Protein, einem Mitglied der 7 transmembranen G - Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie und ein zugehöriges Chromophor hergestellt , das aus der Netzhaut oder ein ähnliches Molekül 26,27 ableitet. Opsin Aminosäuresequenz und chromophore Struktur beeinflussen die Absorption von auf verschiedene Wellenlängen von Licht Rhodopsin. Wenn ein Photon durch den Chromophor absorbiert wird das Rhodopsin aktiviert wird, einen G-Protein - Kaskade in der Zelle initiiert, die an der Öffnung der membrangebundenen Ionenkanäle 28 schließlich führt. Anders als die meisten Neuronen unterziehen Sehzellen abgestufter Potentialänderungen, die Lichtreizes als relative Änderung der Reaktionsamplitude mit wechselnden gemessen werden kann. Typischerweise eine gegebenePhotorezeptortyp drückt nur ein Opsin - Gen (obwohl Ausnahmen existieren 8,10,29-31). Anspruchsvolle Farbsehen, wie sie in vielen Wirbeltieren und Gliederfüßern gefunden wird, wird mit einem komplexen Auge von Hunderten oder Tausenden von Sehzellen erreicht jeweils ein oder gelegentlich mehr Rhodopsin Arten ausdrücken. Visuelle Information wird durch den Vergleich Antworten, die über dem Fotoaufnehmer Mosaik über komplexe nachgeschalteten neuronalen Signalisierung im Auge und Gehirn erfasst, was in der Wahrnehmung eines Bildes komplett mit Farbe und Bewegung. die rohen Antworten eines Sehzellen auf unterschiedliche Wellenlängen des Lichts über die intrazelluläre Aufnahme Nach der Messung ist es möglich, seine spektrale Empfindlichkeit zu berechnen. Diese Berechnung basiert auf dem Prinzip der Univariance, die besagt , dass eine Reaktion der Photorezeptorzelle auf der Zahl der Photonen abhängig ist, aber nicht auf die besonderen Eigenschaften der Photonen absorbiert es 32 absorbiert. Jedes Photon, das abso istrbed von Rhodopsin wird die gleiche Art von Reaktion induzieren. In der Praxis bedeutet dies , dass eine rohe Reaktionsamplitude der Zelle entweder aufgrund einer Erhöhung der Lichtintensität (mehr Photonen zu absorbieren) zu erhöhen, oder zu einer Verschiebung der Wellenlänge in Richtung auf seine maximale Empfindlichkeit (höhere Wahrscheinlichkeit von Rhodopsin , dass die Wellenlänge absorbieren). Wir nutzen dieses Prinzip in Bezug zellulären Reaktionen bei bekannter Intensität und der gleichen Wellenlänge zu Reaktionen bei unterschiedlichen Wellenlängen und der gleichen Intensität, aber unbekannten relative Empfindlichkeit. Zelltypen werden oft von der Wellenlänge, bei der ihre Empfindlichkeit Peaks identifiziert. Hier zeigen wir eine Methode für die intrazelluläre Aufnahme und Analyse der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptoren im Auge eines Schmetterlings, mit einem Fokus auf machen diese Methode besser zugänglich zu der weiteren Forschung. Obwohl die intrazelluläre Aufnahme in der Literatur häufig bleibt, vor allem in Bezug auf das Farbsehen bei Insekten, haben wir gefunden, that Beschreibungen der Materialien und Verfahren sind in der Regel zu kurz für die Wiedergabe der Technik zu ermöglichen. Wir präsentieren diese Methode im Video-Format mit dem Ziel, die leichter Replikation ermöglicht. Wir beschreiben auch die Technik leicht erhältlich und preisgünstige Ausrüstung. Wir wenden uns an gemeinsamen Vorbehalte, die oft nicht gemeldet werden, die Forschung verlangsamen, wenn eine neue und komplexe Technik zu optimieren.

<table><tbody><tr><td>Butterfly pupae</td><td></td><td></td><td>Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits</td></tr><tr><td>Large plastic cylinder</td><td></td><td></td><td>Any chamber that remains humidified will work</td></tr><tr><td>Insect pins, size 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe&#039;s</td><td></td><td>Any honey or sucrose solution will work</td></tr><tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Small (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 &amp;amp; 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Condenser lens assembly</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Convex silica lens, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Six Position Filter Wheel, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filter Wheel Mount Hub</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Concave silica lens, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Collimator holder</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Collimating beam probe</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>600 &amp;mu;m diameter UV-vis fiber obtic cable</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Shutter with drive unit</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 300 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 310 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 320 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 330 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 340 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 350 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 360 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 370 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 380 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 390 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 400 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 410 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 420 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 430 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 440 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 450 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 460 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 470 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 480 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 492 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 500 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 510 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 520 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 532 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 540 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 550 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 560 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 570 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 580 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 589 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 600 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 610 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 620 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 632 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 640 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 650 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 660 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 671 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 680 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 690 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 700 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td>Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Any Stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Microscope stand with swinging arm and heavy base</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>Any heavy base with arm will do</td></tr><tr><td>Cardan arm</td><td></td><td></td><td>Custom built, See &lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fiber-lite high intensity illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>For lighting specimen</td></tr><tr><td>Fiber-lite goose-neck light guide</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Any goose-neck light guide will do</td></tr><tr><td>Marble table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raised wooden table</td><td></td><td></td><td>Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath</td></tr><tr><td>Wooden box filled with sand</td><td></td><td></td><td>custom built, any box with sand</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specimen stage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alligator clip wires for grounding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulated copper wire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire, 0.125 mm diameter</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC cables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplifier with headstage</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Noise reducer</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart software</td><td>ADI instruments</td><td>Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz Pulse Generator</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate glass capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slotted plastic tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting temperature wax</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platform with ball-and-socket magnetic base</td><td>Hama photo and video</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double edge carbon steel, breakable razor blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

Intrazellulärer Aufnahme ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um zu bestimmen, wie eine einzelne Zelle auf einen gegebenen Reiz reagieren. In einer Vision Forschung, hat die intrazelluläre Aufnahme war in der Vergangenheit eine übliche Technik zu studieren Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen auf verschiedene Lichtreize verwendet, die noch heute verwendet wird. Es bleibt jedoch ein Mangel an detaillierten Methodik in der Literatur für die Forscher die intrazelluläre Aufnahme Experimente im Auge zu replizieren wollen. Hier präsentieren wir das Insekt als Modell für die Untersuchung Augenphysiologie allgemeiner. Insekten Sehzellen sind in der Nähe der Oberfläche des Auges angeordnet und sind daher leicht zu erreichen, und viele der Mechanismen in der Vision beteiligt sind, über Tierphyla konserviert. Wir beschreiben das grundlegende Verfahren für in vivo intrazelluläre Aufnahme von Sehzellen im Auge eines Schmetterlings, mit dem Ziel, diese Technik für Forscher mit wenig Erfahrung in electrophysiology. Wir stellen die Grundausstattung benötigt, wie ein Live-Schmetterling zur Vorbereitung der Aufnahme, wie ein Glas-Mikroelektrode in eine einzelne Zelle einfügen, und schließlich die Aufnahmeverfahren selbst. Wir erklären auch die grundlegende Analyse der rohen Reaktionsdaten für die spektrale Empfindlichkeit der einzelnen Zelltypen zu bestimmen. Obwohl unser Protokoll über die Bestimmung spektraler Empfindlichkeit konzentriert, andere Reize (zB polarisiertes Licht) und Variationen des Verfahrens sind zu diesem Setup anwendbar.

Für viele Elemente der Aufnahme - Setup, eine schriftliche Beschreibung liefert nicht genügend Detail. 1 ist eine schematische Darstellung der Komponenten in der gesamten Aufnahme - Setup beteiligt. In Figur 2 Spektren werden für weißes Licht und jeden Interferenzfilter ein Gefühl dafür , warum ein Korrekturfaktor benötigt wird, aufgetragen , und was benötigt wird , um diese Korrektur zu berechnen. 3 zeigt Bilder und ein Diagramm des Cardan Arm , die für diese verwendet wird , Experimente. 4 ist ein zusammengesetztes Bild der Aufzeichnungsstufe und Mikromanipulator zeigt, Fig . 5 verschiedene Schritte bei der Herstellung eines Schmetterlings für das Experiment zeigt. Sobald eine Aufzeichnung beginnt, bedeutet eine negative Änderung der Spannung in Reaktion auf einen Lichtblitz , daß die Elektrode außerhalb einer Zelle ist, wie in 6a. Die Stärke der Reaktion hängt von der Nähe der ElektrodeSpitze auf eine Photorezeptorzelle und dem Einfallswinkel des Lichtblitzes. Die Antwort sollte groß sein (&gt; 30 mV) , bevor die Spitze in eine Zelle nahe genug ist aufzuspießen. 6b zeigt eine klare depolarisierende Reaktion auf einen Lichtreiz, bedeutet den Eintritt in eine Sehzellen. Das Ruhepotential sollte stabil sein, und die Antwortamplitude sollte groß (mindestens 40 mV) sein, obwohl die absolute Amplitude beträchtlich variieren. Wir messen die relative Reaktion, so ist es wichtig, dass das Signal-Rausch-Verhältnis hoch ist. Wenn das Potential stark ändert ruht, sieht die Antwortwellenform ungewöhnlich, oder die maximale Reaktion zu niedrig ist, dann vergleicht relativen Reaktionen über alle Interferenzfilter unmöglich wird. Beispiele für unbrauchbare Aufnahmen sind in Figur 6c, 6d dargestellt. Nach einer erfolgreichen Aufnahme abgeschlossen, müssen die ND - Antworten und die Naka-Rushton Gleichung aufgetragen werden sollte , 33 an die Daten angepasst werden, shown in Abbildung 7. Diese Zahl wird aufgetragen ohne Interferenzfilter den ND - Filter Serie. Wenn die Aufzeichnung stabil ist, sollten die Daten aus dem ND-Filterserie vor und nach dem Experiment ähnlich sein. Spektrale Empfindlichkeit wird durch Anpassung der Naka-Rushton Gleichung auf die VlogI Plot in Abbildung 7, dann die Lösung für (I) für jede Antwort (V) bei einer bestimmten Wellenlänge bestimmt, wie in den Berechnungen des § 6 des Protokolls erklärt. Ein repräsentatives Beispiel für die spektrale Empfindlichkeit von einer einzigen Aufnahme abgeleitet ist in 8a (bitte beachten Sie dieses Beispiel zeigt reale berechneten Daten, aber die Spitze verschoben wurde als dieses Ergebnis nicht veröffentlicht) aufgetragen. Zelltypen können durch Spitzenempfindlichkeit bei einer ähnlichen Wellenlänge und Gesamtform des Empfindlichkeitsspektrum klassifiziert werden. Ähnliche Zelltypen werden dann gemittelt und die mittlere Empfindlichkeit wird mit Standardfehlerbalken bei jeder Wellenlänge in Figu geplottetre 8b. Spektralen Empfindlichkeiten der drei typische Zelltypen in einem Insekt gefunden werden in 8c gezeigt (Größe und Fehlerbalken sind aus realen Daten berechnet, aber die Peaks verschoben). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Abb . 1: Schematische Darstellung der Aufnahmekomponenten Komponenten des Lichtweges, Probenaufbau und Aufnahme - Hardware angezeigt. Optische Spur sitzt auf der Holzbank außerhalb des Faradayschen Käfigs. Xe, Xenonbogenlampe, Cd, Kondensator Montage, Lx, konvexe Linse, ND, Neutraldichtefilter Rad, Cf, Interferenzfilter, S, Shutter, Lc, konkave Linse, Co , kollimierende Strahlsonde, Fo, Glasfaserkabel. Der Faraday-Käfig sitzt auf demHolzbank um die Probe. Die Holzbank sitzt oben, aber nicht der Schwingrührvorrichtung isoliert Marmortisch unter berühren. Aufzeichnen (Rc) und Referenz (Rf) Elektroden sind mit dem heads (Hs) angebracht ist . Rc in das Auge eingeführt wird , (E) und Rf in einen anderen Teil des Körpers eingeführt wird . Der heads ist Teil des Vorverstärkers (Pa) Einrichtung außerhalb des Faradayschen Käfigs. Das Signal wird von dem Vorverstärker durch das Humbug Rauschreduzierer (Hb) und in das Oszilloskop (Os) geleitet. Vom Oszilloskop wird das Signal durch die Powerlab Hardware (PLB) und in den Laptop - Computer (CPU) geführt , wo sie durch die LabChart Software gelesen wird. Der Verschluss wird durch einen Funktionsgenerator (FG) gesteuert , die durch einen zweiten Kanal auf dem Oszilloskop übergeben wird, und auch durch einen zweiten Kanal auf der Powerlab Hardware geleitet werden kann , wenn dieses Signal als auch aufgezeichnet werden wird. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Abbildung 2:. White Light und Interferenzfilter Spectra Gebrauchte Korrekturfaktoren zur Berechnung der gemessenen Spektren in Schritt 2.5 des Protokolls von 300 bis 700 nm gezeigt, für weißes Licht sowie jede der 41 Interferenzfiltern. Jedes Interferenzfilter Spektrum wird mit nur diesen Filter im Lichtweg gemessen. T 520 entspricht der Fläche unter dem Spektrum für den Peak - Filter mit 520 nm und 520 s entspricht der Intensität des weißen Lichts bei Spitzenwellenlänge des Filters, 520 nm. Diese Werte werden bei der Berechnung der Korrekturfaktoren für jeden Filter (in diesem Fall 520 nm) verwendet, wie im Schritt 2.6 in dem Protokoll beschrieben. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Abbildung 3:. Beschreibung des Perimeter Kardan Arm Verwendet in den Experimenten Der Kardan Arm hält das Glasfaserkabel und ermöglicht die volle sphärische Rotation und Winkeleinstellung , so dass Licht kann bei der richtigen Einfallswinkel in die Zelle aufgenommen wird geliefert werden. (A) Top - down - Ansicht. (B) Blick von der Seite in einem Winkel. Die Zahlen entsprechen dem gleichen Teil in allen Panels. (1) Die Bodenplatte ermöglicht eine vollständige Kreis Drehung in der horizontalen Ebene. (2) Die vertikale Platte ermöglicht die volle Kreisrotation des Arms in einer vertikalen Ebene. (3) Dieser Zylinder hält den Metallarm mit dem faseroptischen Kabel an dem Ende, und es erlaubt eine zweite vertikale Ebene der kreisförmigen Drehung senkrecht zu (2). (4) Das Glasfaserkabel wird i gehaltenn am Ende des Arms, und Licht wird in der Versuchsanordnung in Richtung der Position der Probe gerichtet. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> Abbildung 4:. Die Komponenten der Aufnahme - Einrichtung (A) Kunststoffrohr verwendet , um die Probe zu halten. (B) Draufsicht auf die Plattform , auf der die Probe und das Rohr montiert sind. (C) Seitenansicht von Kugel- und gemeinsame Plattform mit Magnetfuß (1). Referenzelektrode gehalten immobile mit Leim und Wachs auf der Seite der Plattform (2). Die Referenzelektrode um Krokodilklemme gewickelt und dort verlötet, einen Befestigungsbereich, in der der headsReferenzElektrode Clip (3). (D) Elektrodenspitze unter 20 - facher Vergrößerung. Maßstabsbalken, 25 &amp; mgr; m. (E) Bühne, Elektrodenhalter und Mikromanipulator - Setup. Die heads (1) oberhalb der Vorrichtung mit der festenSilber Aufzeichnungsdraht (2), und die Referenzelektrode mit Krokodilklemme (3) befestigt ist. Der Elektrodenhalter (4) mit einer manuellen Mikromanipulators befestigt (5) mit einem Beitrag unter dem mit einem Knopf für eine vertikale Bewegung eingestellt werden kann oder für eine horizontale Bewegung des Elektrodenhalters geschoben oder gezogen werden. Die magnetische Plattform mit Probe sitzt auf der Bühne (6) direkt unter dem Elektrodenhalter. (F) Der Faraday - Käfig umgibt die Aufnahme - Setup mit einem Bildschirm, oder unten in der Vorderseite nach oben gezogen werden kann. Aluminiumfolie wird unter allen Geräten mit Gummi-Pads auf der Oberseite platziert. Das faseroptische Kabel (1) führt in den Käfig von der optischen Spur außen und wird durch die Cardan Arm (2) in Richtung auf die Stufe (3) gerichtet ist. Die Aufnahmestufe und Manipulator Vorrichtung in einem Sandkasten (4) ruht auf einem Marmortisch unter dem Setup platziert. Alle anderen Geräten beruht auf der Holzbank oben, die nicht den Marmortisch berührt. Der Sandkasten sitzt oben auf dem Marmortisch in einem Lochgeschnitten aus dem Holztisch, so dass die Probe vollständig vibrierend von der Ausrüstung auf der hölzernen Tischplatte isoliert ist. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> Abbildung 5:. Schmetterlings - Prep (A) Der Schmetterling in das Rohr eingeführt wird und der Kopf, Flügel und Antennen werden mit heißem Wachs immobilisiert. Die indifferente Elektrode wird in die Mundwerkzeuge (1) eingesetzt, ein Stück trockenes Wachs wird verwendet, um den Bauch zu halten, nach unten (2), und ein nasses Gewebe hinter der Probe angeordnet. (B) Nahaufnahme des Kopfes gewachst nach unten. Das Auge aufgezeichnet werden aus (1) klar aus Wachs oder Schmutz gehalten, und die Referenzelektrode (2) in die Mundwerkzeuge eingesetzt und heißem Wachs wird schnell geschmolzen über um es in Position zu halten.(C) Ein Loch geschnitten in das Auge , wo die rosa-weiß Sehzellen Schicht zu sehen ist. Schwarzpigment und Gelb Hämolymphe fehlen. (D) Seitenansicht der Probe mit einem Glas Aufzeichnungselektrode (1) in das Auge eingesetzt, und der indifferenten Elektrode (2) an der Kopfstufe befestigt, die eine Schaltung vervollständigen sollte wie auf dem Oszilloskop zu sehen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier um zu sehen eine größere Version dieser Figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> Abb . 6: Raw Antworten von Sample - Aufnahmen Jede Antwort entspricht einem einzelnen Lichtblitz von 50 ms Dauer (schwarze Balken). (A) Ein Beispiel für die große negative Spannungsänderung , die gerade betrachtet werden solltebevor eine Zelle eingeben. (B) Eine saubere Aufzeichnung sollte wenig Hintergrundrauschen und eine große depolarisierenden Reaktion, typischerweise von mindestens 40 mV. (C) Ein Beispiel für eine schlechte Aufnahme aufgrund des negativen Potentialänderung nach dem Hauptpeak (Pfeilspitzen). (D) Ein weiteres Beispiel für eine schlechte Aufnahme. Das Ruhepotential wird derzeit große Schwankungen (roter Balken) und die große Menge an Hintergrundrauschen kann die Amplitude des Ansprechens (Pfeilspitze) verdunkeln. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> Abbildung 7:. Antwort-Intensity Log-lineare Funktion Füllte Kreise zeigen die gemessenen Reaktionen einer Zelle 3,5-0 OD, für diesen Versuchsaufbau. Die Lichtintensität ist auf einer logarithmischen Skala. Bei sehr hohen Intensitäten wird die Reaktion gesättigt ist, und bei sehr geringen Intensitäten eine kleine Antwort andauert statt entlang der Linie auf Null fällt. Ter Naka-Rushton Gleichung 33 ist auf diese nicht-lineare Form (gepunktete Linie) ausgestattet. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> Abb . 8: Spektrale Empfindlichkeit Beispiele (A) eine einzige repräsentative Antworten der Zelle wurden aufgezeichnet und die relative spektrale Empfindlichkeit wurde berechnet. Der Höhepunkt dieser Zelle ist bei 440 nm, was bedeutet, es am besten auf blaues Licht reagiert. Einzelzellendaten aussehen kann laut (Peak bei 380 nm). (B) Zellen , die mit der gleichen relativen Peak und Form zusammen gemittelt und Standardfehlerbalken werden hinzugefügt. Hier sieben blaue Zellen, die aus sieben Personen wurden starke Beweise gemittelt wird, dass ein Zelltyp in dieser Spezies bei 440 nm maximal empfindlich auf Licht vorhanden ist. (C) Dieser Prozess kann für alle Zelltypen wiederholt werden gefunden, und aufgetragen zusammen. Insekt Augen sind sehr unterschiedlich in ihrer spektralen Empfindlichkeiten aber eine typische insect können Spitzen hier bei 370 nm, 440 nm und 510 nm gezeigt haben. Beachten Sie, dass diese spektralen Empfindlichkeiten sind alle berechneten realen Daten verwendet, aber die Spitzen haben sich verschoben worden, weil die Daten noch nicht für diese Art veröffentlicht wird.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Die elektrophysiologische Technik der intrazellulären Aufnahme wird gezeigt, und verwendet, um spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen in der Verbindung Auge eines Schmetterlings bestimmen.

Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus<em&gt; In Vivo</em&gt; Intrazellulärer Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

determination-photoreceptor-cell-spectral-sensitivity-an-insect-model

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.4K Aufrufe.  University of California, Irvine.  Die elektrophysiologische Technik der intrazellulären Aufnahme wird gezeigt, und verwendet, um spektralen Empfindlichkeiten einzelner Sehzellen in der Verbindung Auge eines Schmetterlings bestimmen. 

Serie: Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Single-Einheit In-vivo- Aufnahmen aus dem Chiasma der Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

Desensitisierung und Wiederherstellung von Krebse Photorezeptoren nach der Lieferung eines leichten Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

In Vivo Intracellular Recording of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in a Butterfly

Source: McCulloch, K. J., et al.. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53829">Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly and determining the spectral sensitivity of individual cell types. This technique enables the study of sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli.

In vivo Intrazelluläre Aufzeichnung der spektralen Empfindlichkeit von Photorezeptorzellen bei einem Schmetterling

1. Specimen Prep and Recording Procedure

	Prepare the Specimen
	
		Affix an individual butterfly inside a small plastic tube with hot wax so the head is ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Elektrophysiologische Aufzeichnung der Spannungsantworten von retinalen Photorezeptoren der Drosophila auf Lichtreize

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

Bestimmung der Sehzellen Spektrale Empfindlichkeit in einem Insekt Modell aus

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video