Name: encapsulating cytochrome c in silica aerogel nanoarchitectures without metal nanoparticles while retaining gas-phase bioactivity
Uploaded: 2016-03-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
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Unterstützung für diese Arbeit und / oder Veröffentlichung wurde von der Science Institute of Fairfield University College of Arts and Sciences, Fairfield University Faculty Research Grant, ein Cottrell College-Science Award von der Research Corporation für Wissenschaft Förderung, Fairfield University College of Arts &amp; Sciences und fair~~POS=TRUNC field~~POS=HEADCOMP University Chemistry &amp; Biochemistry Department. Wir danken Jean Marie Wallace für viel hilfreiche Einblicke und Ratschläge in Bezug auf diese allgemeinen Forschungsgebiet anzuerkennen. Darüber hinaus erweitern wir ein ganz besonderes Dankeschön an alle vergangenen, gegenwärtigen und zukünftigen Bachelor-Forscher von der Harper-Leatherman Research Lab.

Schutzbrille, Laborkittel und Laborhandschuhe sollten zu jeder Zeit während des Verfahrens zu tragen. Betreiben Sie den kritischen Punkt Trocknungsgerät ohne Schutzbrille. Alle Lösungen enthalten, Tetramethoxysilan, Methanol, Ethanol, Aceton und Ammoniak sollte innerhalb von einem Abzug verarbeitet werden. 1. Stellen Sie Buffer und Cyt. C - Lösungen <ol><li> Zu machen ~ 750 ml pH 7, 40 mM Kaliumphosphatpuffer, bereiten ersten 500 ml von 0,04 M monobasisches Kaliumphosphat durch Auswiegen 2,72 g monobasisches Kaliumphosphat und Auflösen in Wasser unter Verwendung eines 500 ml-Meßkolben. </li><li> Bereiten Sie 500 ml von 0,04 M Kaliumhydrogenphosphat durch Auswiegen 3,48 g Kaliumhydrogenphosphat und Auflösen in Wasser unter Verwendung einer 500-ml-Messkolben. </li><li> Gießen Sie die zweibasige Salzlösung in einen großen Becher mit einem Rührstab und beginnen auf einer Rührplatte die Lösung gerührt wurde. </li><li> Langsam Teile des monobasischen Salz sÖSUNG zur Lösung dibasische Salz während der pH-Wert mit einer pH-Elektrode und Messgerät überwacht wurde, bis der pH-Wert 7,00 ist. Ungefähr 250-300 ml der monobasischen Salzlösung verwendet. </li><li> Man wiegt ca. 0.023 g cyt. C und in Glasszintillationsröhrchen. Hinzufügen 2.000 ul der vorbereiteten Kaliumphosphatpuffer mit einer Mikropipette und dann vorsichtig schwenken der Lösung , bis der gesamte Feststoff, rot cyt zu mischen. C wurde in der Lösung gelöst und keine Partikel bleibt. </li><li> Nehmen Sie 20 ul der hergestellten cyt. C Lösung und fügen Sie zu einem 1 cm Weglänge Plastikküvette. 3 ml vorbereitete Puffer. </li><li> Nehmen UV-Vis-Spektrum von 300 bis 700 nm-Puffer in der Referenzzelle. Verwenden Sie die cyt. C Absorption (A) bei 409 nm, der Extinktionskoeffizient 31 (ε) von 106.100 M -1 cm -1, die Küvette Weglänge (l) und das Beer-Lambert - Gesetz zur Bestimmung der Konzentration (c) der Lösung (A = εlc). </li><li> Zurück zu berechnen, die Konzentration der ursprünglichen hergestellten Lösung. Die 2 ml hergestellt cyt. C Lösung liegt typischerweise zwischen 0,7 bis 0,9 mM Konzentration. </li><li> Verdünnen Sie das Original vorbereitet cyt. C Lösung zu 800 &amp; mgr; l von 0,105 mM durch Pipettieren 117 ul von 0,72 mM hergestellt cyt. C Lösung in ein Szintillationsphiole. Dann fügen Sie das Gleichgewicht der 800 &amp; mgr; l (683 &amp; mgr; l in diesem Fall) vorbereiteter Puffer. Swirl zu mischen. Die genauen Mengen variieren abhängig von der genauen Konzentration des ursprünglichen hergestellt cyt. C Lösung wie das Volumen des cyt. C zu pipettieren als (800 &amp; mgr; l * 0,105 mM) berechnet wird / (original cyt. C - Konzentration in mM). </li><li> Bewahren Original vorbereitet und verdünnt cyt. C Lösungen bei 2-8 ° C im Kühlschrank , bis sie bereit für bis zu zwei Wochen zu verwenden. </li></ol> 2. Synthesize Silica (SiO 2) Sol <ol><li> Beschriften Sie eine Einweg 50 ml Polypropylen-Becher &quot;Beaker A &#39;. Becherglas auf der Pfanne von einer Analysenwaage und mit einem Glas Pasteur Pipette 1,88 g Tetramethoxysilan in den Becher hinzuzufügen. Null das Gleichgewicht und dann 2,88 g Methanol in &#39;Beaker A&#39; Pipette. </li><li> Cover &#39;Beaker A&#39; mit Parafilm. </li><li> Beschriften Sie eine Einweg 50 ml Polypropylen-Becher &quot;Becher B &#39;. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab und auf den Topf mit einer Analysenwaage. Verwenden Sie eine Glaspipette 0,75 g Wasser und 3,00 g Methanol hinzuzufügen. </li><li> Cover &#39;Beaker B&#39; mit Parafilm. </li><li> Beginnen Sie den Inhalt des &#39;Beaker B&#39; Rühren auf einer Rührplatte in einem Dunstabzug, dann eine Spritze verwendet werden 5 ul 28,0-30,0% Ammoniumhydroxidlösung durch die Parafilm in die Mischung bedecken einzufügen unter Rühren. </li><li> Sobald Schritt 2.5 abgeschlossen ist, den Inhalt des &#39;Beaker A&#39; bis &#39;Beaker B&#39; hinzuzufügen. Rühre das Gemisch 20 min, während in Parafilm bedeckt. </li></ol> 3. Bereiten Sie Gel-Formen Hinweis:die Gel-Formen, während das Kieselsol Mischung rührt in Schritt 2.6 ist Zeit zur Vorbereitung. <ol><li> Erwerben 8-9 Polypropylen Szintillationsgefäße (16 mm x 57 mm, Volumengröße 6,5 ml, mit Böden in Scheiben geschnitten aus) und den entsprechenden Kappen. Setzen Sie Plastikfolie über die Kappe Ende des Fläschchens eine ebene Fläche zu schaffen, um das Gel auf zu bilden, und legen Sie die Kappe über sie dafür sorgen, dass die Plastikfolie in der Kappe intakt bleibt. </li><li> Richten Sie die Fläschchen mit Kappe-Ende nach unten auf die Tischplatte und öffnete Böden nach oben zeigt. </li></ol> 4. Bereiten Sie Cyt. C -silica Sol-Gele <ol><li> Nach Beendigung des Sol Mischen (Schritt 2.6), 3 ml der Sol-Mischung zu einem sauberen Einweg 50 ml Polypropylen-Becher. </li><li> Verwenden Pipette ein Glas Pasteur langsam 500 ul der 0,105 mM verdünnt cyt fallen. C - Lösung (hergestellt in Schritt 1.9) in die 3 ml Sol - Mischung im Verlauf von ca. 1 min. Achten Sie darauf , um die Mischung zu leicht schwenken , während die cyt Zugabe. C Bildung von großen zu vermeidenroten Klumpen. Unter der Annahme , die Volumina additiv sind, um 500 ul des 0,105 mM cyt verdünnt. Lösung C bis 3.500 &amp; mgr; l, die cyt. C Konzentration nun in das Sol ist, in der Theorie, 15 uM. </li><li> Pipette 0,5 ml der resultierenden cyt. C Kieselsol in jedes vorbereitete Form. Auch pipettieren 0,5 ml verbleibenden &#39;schlicht&#39; Kieselsol in ein oder zwei Formen als Kontrollproben während der überkritischen Trocknungsprozess zu verwenden. </li><li> Decken Sie die nach oben gerichtete Öffnungen der Formen mit Parafilm und stellen im Kühlschrank (~ 2-8 ° C) über Nacht oder für mindestens 12 Stunden Sol-Gele herzustellen. </li><li> Nehmen Sie die Formen aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie die Parafilm von der Spitze einer Form , die eine cyt enthält , c Sol-Gel. entfernen auch die Kappe und Plastikfolie von der Unterseite. </li><li> etwas Ethanol aus einer Waschflasche in die Form, verwenden Sie die kreisförmige Scheibe Ende eines Spritzenkolben vorsichtig das Gel schieben aus der Form und in einen sauberen 20 ml Glasszintillationsröhrchen cont Nach der Zugabe vonaining etwa 5 ml Ethanol gegeben. </li><li> Wiederholen dieses Gel Entfernungsprozedur (Schritte 4.5 und 4.6) , bis alle der cyt. C Gele werden in das Fläschchen gegeben und alle der Kieselgele werden in einen separaten Glasfläschchen hinzugefügt. Wenn mehr als eine Konzentration von cyt. C Gel gemacht worden ist , sicher sein , wie Gele zu speichern zusammen in separaten Fläschchen. Dann füllen Sie die Fläschchen an die Spitze mit Ethanol, Kappe und Lagerung zwischen 2-8 ° C. </li><li> Alle vier Stunden im Laufe des Tages, entfernen Sie die Gele aus dem Kühlschrank, dekantiert die Ethanol aus den Gelen und ersetzen mit frischem Ethanol. </li><li> Während weitere drei Tage unterzutauchen die nassen Sol-Gele in Aceton, Umfüllen und Zugabe von frischem Aceton dreimal täglich. </li></ol> 5. kritisch Dry Cyt. C -silica Sol-Gele <ol><li> Kühlen Sie einen kritischen Punkt Trocknungsgerät (siehe Abbildung 1) bis 10 ° C , indem die Temperatur eines angeschlossenen Zirkulator auf 8 ° C einstellen. </li><li> Sobald die Vorrichtung reached 10 ° C, führen eine Dichtigkeitsprüfung auf das Gerät durch ein Transfer Boot mit Aceton Füllen und es im Inneren der Vorrichtung abdichtet. <ol><li> Öffnen Sie das Füllventil des Gerätes und fügen Kohlendioxid, bis das Gerät halb voll ist. </li><li> Schließen Sie das Füllventil und hören Sie aufmerksam zu an den Türen zischend und Ventile, wo O-Ringe oder Dichtungen werden verschlechtert werden. </li><li> Ersetzen Sie alle O-Ringe oder Dichtungen, wenn ein Leck gefunden wird. </li></ol></li><li> Nach der Dichtigkeitsprüfung, öffnen Sie das Ablassventil das Aceton und Kohlendioxid in den Abfluss von einer Abzugshaube zu lösen. Entfernen Sie dann aus dem Gerät die Übertragung Boot. </li><li> Nachdem er sich vergewissert, dass die Vorrichtung leckfrei ist, gießen Sie sorgfältig die nassen Gele aus den Szintillationsgefäße, zusammen mit den meisten der Aceton, in den drei der Transfer Boot lange Abschnitte (Probenkörbe oder Gaze Abdeckungen sind nicht erforderlich). Zart schieben und die Gele im Boot mit einer Pinzette zu bewegen, um sicherzustellen, dass alle Gele i vollständig untergetaucht werdenn Aceton. Fügen Sie mehr Aceton benötigt, wenn vor dem Boot innerhalb des Gerätes abgedichtet wird. </li><li> Öffnen des Füllventils der Vorrichtung zu Kohlendioxid hinzu, dann öffnet das Ablassventil freizugeben Aceton für 5 Minuten, sobald das Aceton mit dem Kohlendioxid Mischens beobachtet werden Sinken auf den Boden der Vorrichtung durch die Vorrichtung Fenster. Diese kriechende des Acetons auf den Boden auftritt, bevor die Vorrichtung vollständig mit Kohlendioxid gefüllt ist, so sollte das Füllventil in dem Maße während der Entleerung notwendig offen bleiben, so dass die Vorrichtung selbst zu füllen, wird fortgesetzt, während die Drain geöffnet ist. </li><li> Das Ablassventil schließen. Halten Sie das Füllventil geknackt leicht geöffnet. </li><li> Fünf Minuten später, öffnen Sie das Ablassventil für fünf Minuten wieder und stellen Sie das Füllventil genug geöffnet werden, so dass das Gerät während des gesamten Entleerungszeit voll bleibt. Das Ablassventil schließen, halten Sie das Füllventil offen gebrochen, dann wiederholen Sie diese Trockenlegung Schritt noch einmal fünfMinuten später. </li><li> Nach diesen ersten drei Entwässerungsschritte, öffnen Sie den Ablauf für 5 Minuten in einer Zeit, etwa alle 40 min über den Zeitraum von mindestens sechs Stunden vollständigen Ersatz von Aceton in den Gelen durch flüssiges Kohlendioxid zu gewährleisten. Bei Einstellung des Füllventil offen genug bei jeder Entleerung zu sein, so dass der Flüssigkeitspegel in dem Gerät nie unter der Spitze des Bootes fällt beim Entleeren. </li><li> Sobald Trockenlegung Schritte abgeschlossen sind, schließen Sie das Füllventil, und lassen Sie das flüssige Kohlendioxid, so dass das Niveau knapp oberhalb der Zinken auf dem Boot, indem Sie durch das Gerät Fenster sichtbar bleibt. </li><li> Stellen Sie die Temperatur der Vorrichtung angebracht Zirkulator bis 40 ° C , um sicherzustellen , dass das flüssige Kohlendioxid steigt oberhalb seiner kritischen Temperatur und Druck (T c = 31 ° C; P c = 7,4 MPa). </li><li> Nach ca. 15 min, beobachten den Übergang vom flüssigen in den überkritischen Fluid durch die Vorrichtung Fenster als Flüssigkeit meniscuns über den Zinken des Bootes verschwindet. Sie müssen mindestens 15 min Equilibrierungszeit, dann öffnen Sie das Entlüftungsventil eine kleine Menge zu beginnen, um die überkritische Flüssigkeit zu lösen. </li><li> Im Laufe von etwa 45 min, weiter inkremental das Entlüftungsventil zu öffnen, immer breiter, so daß eine stetige, aber sehr geringe Rauschen des Lösens Fluid gehört werden kann und das Manometer beobachtet wird langsam auf Null zu verringern. </li><li> Nachdem der Druck des Gerätes auf Null gegangen ist, öffnen Sie das Gerät Tür, entfernen Sie das Boot, und Zange verwenden, um die neu getrocknete Aerogele in saubere Glas Szintillationsgefäße zu platzieren. </li></ol> 6. Charakterisieren Cyt. C -silica Aerogele mit UV-Vis und Circulardichroismus (CD) -Spektroskopie <ol><li> Bereiten Sie einen Karton Plattform, um die Aerogelmonolithen in den Strahlengang des UV-VIS Spektrophotometer oder CD-Spektrometer zu halten. <ol><li> Schneiden Sie ein 2,5 cm x 2,5 cm großes Stück aus leichtem Karton (wie Karton aus einer Schachtel Labobor Gewebe), falten Sie es in der Hälfte, schneiden auf halber Höhe auf der Falte, dann falten Sie die beiden Klappen, geschaffen durch Schneiden, zurück. </li><li> Schneiden Sie ein 5 cm x 5 cm großes Stück aus leichtem Karton, mit einem 1,5 cm x 1,5 cm großen quadratischen Loch in der Mitte. Dann mit schwarzem Isolierband um die Größe des Halte auf 0,5 cm x 0,5 cm zu vermindern. </li><li> Kleben Sie die Klappen des gefalteten und geschnittenen Pappe gegen die 5 cm x 5 cm großes Stück Pappe , so dass eine kleine gebogene Oberfläche ist für einen Aerogel Monolith geschaffen zu sitzen direkt vor dem 0,5 cm x 0,5 cm Loch (siehe Abbildung 2) . Dann kleben Sie das hintere Stück Pappe auf die UV-VIS-Spektrophotometer so das Loch im Einklang mit dem Strahlengang ist. </li></ol></li><li> Die Dicke der Gele, die für die Pfadlängen verwendet werden, mit einem Mikrometer. </li><li> Legen Sie ein Gel auf der Karton-Plattform und messen ein Spektrum von 300 bis 800 nm mit Luft im Referenzraum des UV-VIS-Spektrophotometer. </li><li> Setzen Sie ein Polynom, A = a </em&gt; λ n, auf die Wellenlänge (λ) Bereich , in dem die Absorption (A) vor allem auf Hintergrundstreuung zurückzuführen ist, ~ 700-800 nm. Der Koeffizient a ist typischerweise fit auf eine Zahl zwischen ca. 1 x 10 8 und 1 x 10 6 und der n - Koeffizient ist typischerweise fit auf eine Zahl zwischen ~ 2 und 3. </li><li> Berechnen Sie die Streuung bei anderen Wellenlängen, mit dem Koeffizienten, a und n, von der Passform erhalten. </li><li> Subtrahieren diese berechneten Streuhintergrundabsorption aus dem Rohspektrum ein Streu korrigierte Spektrum zu erhalten. </li><li> Den scatter subtrahierten Spektrum mit einer Gauß-Kurve im Bereich von 370 bis 490 nm unter Verwendung geeigneter Software (GRAMM / AI 8,0), die Peakhöhe, Peakzentrum, und die Spitzenbreite der Soret-Bande des Aerogels zu bestimmen. </li><li> Wenden Sie das Bier-Lambert Gesetz der gemessenen Dicke des Gels unter Verwendung von für die Pfadlänge (l), dem Extinktionskoeffizienten 31 (ε) von 106.100 M -1 cm -1 </sup&gt; und die Soret Peakhöhe (A) die Konzentration (c) von cyt. c in dem Aerogel (A = εlc) zu berechnen. </li><li> Vergleichen Sie die berechneten cyt. C zur Konzentration theoretisch in dem Gel (15 &amp; mgr; M) , um die Lebensfähigkeit von cyt zu ermitteln. C innerhalb des Aerogel. Typische Prozent Lebensfähigkeit sind nahezu 100%, aber es sollte angemerkt werden , dass diese Lebensfähigkeiten sind Schätzungen , nur weil die Berechnung auf der Extinktionskoeffizient von cyt. C in Lösung beruht 31 , die etwas anders ist als der Extinktionskoeffizient von cyt werden vermutet. c in den Aerogelen , die nicht bekannt ist. </li><li> Führen Sie Stickstoff in das CD-Gerät mindestens 5 Minuten vor dem Einschalten der Lampe. </li><li> Kleben Sie die Kartonhalter auf dem CD-Spektrometer so das Loch im Einklang mit dem Strahlengang ist. </li><li> Messen Sie einen kontinuierlichen Wellenlängenspektrum leer mit nichts in der Kartonhalter 350-500 nm bei 100 nm / min, im Durchschnitt drei Scans nehmen. </li><li> Legen Sie ein Gel (Dicke gemessen zuvor in Schritt 6.2) auf dem Karton-Plattform und messen ein Spektrum von 350 bis 500 nm bei 100 nm / min, im Durchschnitt drei Scans nehmen. </li><li> Wiederholen Sie die UV-Vis und CD-Messungen für alle Aerogelmonolithen von Interesse. </li></ol> 7. Erkennen Anwesenheit von Stickstoffmonoxid (NO) Gas mit Cyt. C -silica Aerogels VORSICHT: Arbeiten mit NO ist gefährlich und alle NO-Gas sollte in einem Abzug oder erschöpft in einem Abzug gehandhabt werden. Anhaltende Einwirkung von NO ist toxisch an Gewebe als hochgiftige Stickstoffdioxid und / oder Distickstofftetroxid bilden wird, wenn NO in Kontakt mit Luft kommt. Hitze und ätzende Dämpfe werden auch erzeugt, wenn NO mit Wasser in Berührung kommt. <ol><li> Legen Sie eine 8 L Stickoxid Zylinder (10% Stickstoffmonoxid, 90% Stickstoff) in einem gut belüfteten Abzugshaube und stellen Sie den Druck auf 4 bar. </li><li> Die Leitungen sowohl für die Stickoxid-Zylinder und zu einem Stickstoffzylinder (Druck auf 6 psi) und verbinden die Enden des Rohres mit einem T-Ventil (siehe Abbildung 3a). </li><li> Wählen Sie ein Aerogel Monolith für das Experiment und Messung der Dicke (oder Pfadlänge) mit einem Mikrometer. </li><li> Legen Sie das Aerogel (~ 3 mm dick) in einem Einweg-Küvetten mit Kunststoffkappe und setzen Sie die Küvette in das Spektralphotometer. Schneiden Sie das Aerogel leicht bei Bedarf in der Küvette zu passen. </li><li> Legen Sie zwei Spritzennadeln in die Kunststoffkappe der Küvette, ein mit dem Ausgang des T-Ventil verbunden ist , und ein mit einem Rohr verbunden als Abgas in den Abzug zu dienen (Abbildung 3b sehen). Verwenden Parafilm die Nadeln auf den Schlauch und die Kappe in die Küvette zu versiegeln. </li><li> Stellen Sie eine leere Einwegküvette in der Referenzzelle. </li><li> Stellen Sie die Aerogel-Küvettenposition um sicherzustellen, dass das Aerogel in dem Strahlengang liegt, bevor das Experiment zu starten. </li><li> Nehmen Sie ein anfängliches Spektrum von 800 bis 300 nm. </li><li> Überwachen der Differenz zwischen der Extinktion bei 414 nm und die Extinktion bei 408 nm, während Drehen des T-Ventils zwischen Stickstoff und Stickoxid / Stickstoff-Gemisch in festgelegten Zeitintervallen sicherstellen zu schalten, dass die Strömungsgeschwindigkeit des Stickstoff oder Stickoxid / Stickstoff-Gemisch so hoch zu keiner Zeit ist, dass das Aerogel bewegt sich in der Küvette um. </li><li> Nehmen Sie ein endgültiges Spektrum von 800 bis 300 nm, wenn die Belichtungszyklen fertig sind. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang mit drei vor vier Monolithen eine durchschnittliche Sensorantwort zu erhalten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Wie beschrieben, hat diese Vorgehensweise konsequent tragfähige cyt hergestellt. C innerhalb Aerogele eingekapselt. Die Konzentration des cyt. C innerhalb der Aerogele können , können 4,4 bis 70 mM Phosphat ohne schwere nachteilige Wirkungen auf die Protein Lebensfähigkeit variiert werden innerhalb der Aerogele eingekapselt 5 bis 15 um , und die Pufferkonzentration des anfänglichen cyt. C Lösung variiert werden. Doch die Spitzenmitte und Peakbreite des charakteristischen cyt. C Soret-Bande in Aerogele am nächsten sind , was sie sind für cyt. C in Lösung , wenn cyt. C in Aerogele aus Lösungen von 40 mM Puffer 9 eingekapselt ist. Die Synthese des cyt. C -SiO 2 Aerogele wird im Alter von einigen der Ausgangsreagenzien beeinflusst. Methanol, Tetramethoxysilan und Ammoniumhydroxidlösung sind hygroskopisch und sollte alle ein bis zwei Monate ausgetauscht werden. Die erhöhte Wasser, das nach oben baut indiese Reagenzien im Laufe der Zeit wirkt sich auf die Gel-strukturelle Merkmale und die Sol-zu-Gel-Übergangszeit. Wenn überkritische Trocknung durchgeführt wird, die kritischen Transfer Bootes Punkt Trocknungsvorrichtung kann dick, 1 cm Durchmesser Gele bis achtzehn 0,5 cm halten. Wie im Protokoll Abschnitt beschrieben, sollte eine bestimmte Füll- und Entleerungs verfahren werden, um Kohlendioxid in die Sol-Gel zu übertragen. Es ist wichtig, dass zu Beginn der Ablaufprotokoll zu beachten, das Entwässern Mischung von Kohlendioxid und Aceton fließt bei einer so hohen Geschwindigkeit, die das Ablaßrohr steif friert mit Feuchtigkeit auf der Außenseite zu Eis kondensiert. Die Mischung Ablassen aus etwas Wasser enthält, da das Aceton nicht wasserfrei ist und dieses Wasser kann gefrieren gelegentlich in einem Ausmaß, dass das Ablaufrohr tatsächlich verstopft. Es ist notwendig, für solche Verstopfungen zu beobachten und zu einem Stillstand der Strömung hört. Das Ablassventil sollte für ein paar Minuten geschlossen werden, so dass die Clog schmilzt, wenn eine Verstopfung erkannt wird. Imim schlimmsten Fall, wenn das Ablassventil nicht geschlossen ist, kann eine Verstopfung so viel Druck bewirken, dass der Ablaufschlauch knallt weg gewaltsam den Apparat aufzubauen, dass. Nach den ersten paar Ablaufzeiten wird sich die Mehrheit der Aceton wurde aus der Apparatur gespült, und das Auftreten von nassen Eisbrocken dramatisch sinken. Die Entladung wird ähnlich progressiv Trockeneis als die Trockenlegung Protokoll mit restlichem Nachweis von Aceton Gegenwart (wie Duft) immer nicht nachweisbar durch das Ende des Trockenlegung Prozess wird fortgesetzt. Nachdem das Kohlendioxid in der Vorrichtung von der Flüssigkeit auf überkritische Fluid und der Entlüftungsvorgang begonnen hat , übergegangen ist, ist es notwendig , mindestens 45 min die Flüssigkeit freizugeben , mit einer langsamen Geschwindigkeit über als 9 in dem Verfahren angegeben. Eine höhere Geschwindigkeit der Freisetzung kann die Lebensfähigkeit von cyt verringern. C innerhalb der Aerogele und die Aerogele selbst brechen tatsächlich (wie in Abbildung 9 gezeigt) auseinander , wie the Fluid strömt aus den Gelen zu entkommen. In der Regel, auch wenn die Aerogele intakt bleiben, nachdem das Gerät Tür zu öffnen, ist es wichtig, sie sorgfältig und schonend zu behandeln, da sie spröde sind und leicht brechen kann. Die Steuer Kieselgele die neben dem cyt gegossen werden. C -SiO 2 Gele werden nach dem überkritischen Trocknung verwendet , um festzustellen , ob der Kohlendioxidübertragung in den Gelen erfolgreich war. Manchmal ist die cyt. C -SiO 2 Gele können trüb erscheinen und es ist wichtig , zu bestimmen , ob dies zu einer unvollständigen Lösungsmittel Übertragung zurückzuführen ist oder ob es kann mit der Konzentration des cyt. C zu tun , oder innerhalb der Gele eingekapselt Puffer. Wenn die Kieselgele ohne cyt. C erscheinen eine homogene, durchscheinendes Aussehen im ganzen zu haben, kann dies als Beweis dafür genommen werden , dass das Lösungsmittel Transfer vollständig , selbst wenn die cyt aufgetreten. C -SiO 2 Gele haben eine gewisse Trübung zu ihnen. Trübungen innerhalb der Kieselgeleohne cyt. c nach dem Trocknen zeigt an, dass einige Aceton innerhalb der Gele während des Entlüftungs blieb. Wie in dem Protokollabschnitt angegeben ist, müssen wichtige Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden, wenn mit Stickstoffmonoxid (NO) zu arbeiten. Zur Erkennung von NO die Aerogele verwendet wird, ist es notwendig, die Küvette sehr gut zu verschließen und das Gas fließt über die Aerogele in einer Abzugshaube zu erschöpfen. Alternativ kann das ganze Spektrophotometer in einer Abzugshaube Einwirkung NO-Gas zu begrenzen, zusammen mit dem NO-Gaszylinder als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme bewegt werden. Bei Kontakt sofort mit Luft NO, um den hochgiftigen Stickstoffdioxid, Distickstofftetroxid oder beides erzeugen. NO kann auch mit Wasser reagieren auf Hitze und korrosive Dämpfe abgeben. Daher aufrechterhalten Exposition NO kann zu direkten Gewebetoxizität. Wenn die cyt verwenden. C -SiO 2 Aerogele die Anwesenheit von Stickstoffmonoxid zu erfassen, werden die Soret - Bande wird zunächst bei ~ 408 nm und verschiebt sichauf ~ 414 nm in Gegenwart von Stickstoffmonoxid. Nach dem Einschalten wieder zu Stickstoff sollte die Soret-Bande umkehren wieder bei ~ 408 nm zentriert ist. Es kann auch möglich sein , den cyt zu verwenden. C -SiO 2 Aerogele 27 das Vorhandensein von anderen Liganden, wie Kohlenmonoxid zu detektieren. Verschiedene veröffentlichten Verfahren umfassen einen zusätzlichen Schritt zum Kombinieren Gold oder Silber - Nanopartikel mit cyt. C in Lösung , bevor sie mit dem Sol Mischen und kritischer Trocknung von Aerogelen zu bilden 4-8. Vergleich des UV-VIS - Spektroskopie von cyt. C eingekapselt in Aerogele mit Metall - Nanoteilchen zu der cyt. C in Aerogelen ohne Metallnanoteilchen eingekapselt zeigt , dass diese beiden Typen von Einkapselungsverfahren erzeugen cyt. C ähnlicher Lebensfähigkeit innerhalb der Aerogele (Figur 5) . Doch die cyt. C mit Metall - Nanopartikeln verkapselt ist etwas stabiler als cyt. C kapselnd ohne Metall - Nanopartikel innerhalb der Aerogele 9. Die CD - Spektren der beiden Arten von cyt. C Aerogele sind ebenfalls ähnlich, obwohl beide aus dem Spektrum des cyt unterscheiden. C in Puffer gewissen Entfaltung cyt. C innerhalb der Aerogele (Abbildung 7) anzeigt. Frühere Berichte über cyt. C in Aerogele eingekapselt legen nahe , dass der Zirkulardichroismus - Spektroskopie ist wahrscheinlich die äußerste Schicht der Protein Beurteilung, ungefaltet bei Kontakt mit dem Silicagel, entweder innerhalb Metallnanoteilchen nukleierten mehrlagigen cyt. C Strukturen oder lose Strukturen organisiert, bilden wenn keine Metall - Nanopartikel sind in Aerogele 4,9. Der Großteil des cyt. C innerhalb jeder Art von selbstorganisierten Aufbau innerhalb der Aerogele bleibt durch die UV-Vis - Spektroskopie , obwohl gemessen gefaltet. Der Vorteil des beschriebenen Protokolls hier sans Nanopartikel ist, dass teure Anschaffung oder zeitaufwändige Synthese von MetallNanopartikel ist nicht erforderlich. Proteine ​​sind oft nicht erfolgreich innerhalb Aerogele gekapselt und so dieses Verfahren ist wichtig, daß es zum Einkapseln von anderen Proteinen in Aerogele mit potentiellen Bedeutung für zukünftige bioanalytische Geräte zur Entwicklung eines allgemeineren Verfahrens führen kann.

Cytochrom - c (Cyt. C) ist ein Schlüsselelektronentransferproteins in der Zellatmung Reaktionen des Körpers beteiligt. Es wurde in die Apoptose, eine kontrollierte Form des Zelltods, und es kann eine solche kleine detektieren toxische Moleküle wie Stickoxid und Kohlenmonoxid 1-3 einbezogen werden gezeigt. Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine Rolle bei einer Vielzahl von physiologischen Vorgänge im Nerven, Herz-Kreislauf nehmen, und das Immunsystem. Während cyt c . Typischerweise eine wässrige Umgebung auf einen pH-neutral gepufferte Werte erfordert strukturell intakt und aktiv bleiben, hat die Forschung , dass cyt gezeigt. C seine Struktur und Funktion in festen Materialien , bekannt als Aerogele unter bestimmten Bedingungen 4-9 beibehalten kann. Aerogele sind hochporöse Materialien oft gebildet durch Sol-Gel-Metalloxide Synthetisieren (Während Metalloxid Aerogele sind sehr häufig, Kohlenstoff und andere Arten von Aerogelen synthetisiert. Ein Beispiel hierfür ist InP aerogels) 10 und diese Sol-Gele derart Trocknen daß die poröse feste Matrix 11-14 unverändert. Alle der Poren in fester Aerogele führen in viel Aerogele Bereich zur Verfügung zu Oberfläche äußerst nützlich für alle Anwendungen, bei denen Oberflächenreaktionen wichtig sind. Wenn chemische oder biochemische Funktionalität innerhalb des Aerogels Nanoarchitektur zusammengesetzt ist, wurde gezeigt, dass die physische Porosität und verbesserter Oberfläche der Aerogele Sensoren zu verbessern, sowie Elektroden zur Batterie, Brennstoffzelle und supercapacitor Anwendungen 11,15-23 . Um Aerogele in einer Weise zu trocknen, dass die poröse feste Matrix unverändert lässt, ist es typisch, das Lösungsmittel, das in den Poren nach dem Sol-Gel-Synthese durch überkritische Lösungsmittelextraktion bleibt zu entfernen. Jede Pore collapse, die aus dem Gel als Lösungsmittel verdampft durch Oberflächenspannungskräfte verursacht werden, da in überkritischen Trocknen eine Flüssigkeit-Dampf-Grenzfläche nie Formen minimiert. c in Sol-Gel eingekapselt ist , die gehalten wurden nass oder die getrocknet wurden bei Umgebungsbedingungen 24-30. Berichte über Einkapseln Biomolekülen in Sol-Gele, die dann getrocknet werden kritisch Aerogele aufgrund der notwendigen Verarbeitung seltener sind zu bilden, die auf die Struktur vieler Proteine ​​nachteilig sein kann. Im Falle von cyt. C, bestimmte Bedingungen ermöglichen es , die Fähigkeit von cyt. C zu halten , um Gasphasen Stickstoffmonoxid innerhalb Aerogele zu erkennen und darauf zu reagieren. Einmal im Aerogel stabilisiert, die hochwertige Porenstruktur des Aerogels erleichtert die Reaktion zwischen cyt. C und Stickoxid - 4,8,9. Cyt. C kann zunächst innerhalb Aerogele eingekapselt werden , indem sie in mehreren Schichten um Gold oder Silber - Nanopartikel in Lösung 4-8 zuordnen. Diese mehrschichtige Aufbauten dienen dazu, das Protein in der Aerogel-Matrix zu schützen. In der jüngsten Approach , die wir entwickelt haben, wenn die Proteinkonzentration und Pufferstärke werden zusammen mit anderen Synthesebedingungen gesteuert, cyt. c behält Integrität innerhalb der Aerogele auch ohne Metallnanopartikel anfängliche Assoziation 9. Die Synthese beginnt wie viele Aerogel Synthesen beginnen mit Silica Sol-Gel-Vorstufen für einen bestimmten Zeitraum zu mischen. Es ist nach einer bestimmten Zeit das Mischen dass cyt. C als eine gepufferte Lösung in das Gemisch zugesetzt wird. Gelierung erfolgt dann eine poröse Kieselsäure feste Struktur zu bilden, in dem die Poren gefüllt sind, mit Wasser, Methanol, verbleibenden Reaktanden und Nebenprodukten. Diese Flüssigkeit, die die Poren füllt sich mit verschiedenen Lösungsmitteln ausgespült durch eine Reihe von Lösungsmittelaustausch werden kann, werden die letzten Austausch mit flüssigem Kohlendioxid innerhalb eines kritischen Punkt Trocknungsvorrichtung unter gehalten bei niedriger Temperatur. Bringen des Gels über der kritischen Temperatur (31,1 ° C) von Kohlendioxid erleichtert die Bildung alsupercritical Flüssigkeit im Inneren des unter Druck stehenden Vorrichtung, die entlüftet werden kann trocken, hochporöse Aerogele zu bilden. Die relativ niedrige Temperatur für Kohlendioxid benötigt, um ein überkritisches Fluid zu bilden, ist vorteilhaft im Vergleich zu anderen Lösemitteln, da es das Protein unterhalb einer Temperatur, bei der es hält denaturieren könnten. Unsere Metallnanoteilchen freien Ansatz zur Verkapselung cyt. C in Aerogele ist vorteilhaft , da es ein einfaches Verfahren ist, die auch auf die Entwicklung eines allgemein anwendbares Protokoll zum Einkapseln anderer Proteine ​​führen kann. Viele Proteine ​​können nicht mit Metall - Nanopartikel in der gleichen Weise interagieren , die cyt. C hat und Metallnanopartikelsynthese oder Beschaffungs fügt zusätzliche Zeit und Kosten für das Verfahren. Die wenigen Berichte über Einkapseln Proteine ​​in Aerogele, um die Entwicklung dieses Verfahrens ein wichtiger Schritt nach vorne, eine allgemeinere Verfahren zum Einkapseln von anderen Proteinen in Aerogele zu finden, dass ich helfen kann,n potentielle zukünftige bioanalytische Geräte. Das Protokoll Abschnitt dieses Manuskript beschreibt , wie Kieselsol-Gele zu synthetisieren, kapseln cyt. C in diese Sol-Gele, trocknen diese Komposit - Sol-Gel - Aerogele zu bilden, zeichnen diese bioaerogels mit UV-Vis und Circulardichroismus - Spektroskopie und die Anwesenheit erfassen von Gasphasen Stickoxid mit diesen bioaerogels. Cyt. C wurde in Aerogele erfolgreich eingekapselt wenn zuerst in 4,4-70 mM wässrige Lösungen von Phosphatpuffer gelöst. Jedoch optimierte Proteinstruktur in Aerogelen wurde , wenn 40 mM Phosphat - gepufferte Lösungen von cyt Verkapselung führt gefunden. C Herstellung loaded Aerogel cyt. C - Konzentrationen im Bereich von 5 bis 15 &amp; mgr; M 9. Daher angesichts der Protokoll ist unten Aerogele zu synthetisieren unter Verwendung von 40 mM Phosphat - gepufferte Lösungen von cyt. C in einer geladenen cyt resultiert. C - Konzentration in den Aerogelen von 15 uM. &lt;/ P&gt;

<table><tbody><tr><td>Potassium phosphate, monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>Certified ACS (also possible to use sodium phosphate monobasic)</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>Certified ACS (also possible to use sodium phosphate dibasic)</td></tr><tr><td>Water</td><td>Millipore Direct-Q</td><td></td><td>18 M&amp;Omega; cm</td></tr><tr><td>pH meter and electrode</td><td>Denver Instrument</td><td>UB-10</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrome c from equine heart</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7752-100MG&amp;nbsp;</td><td>&amp;ge;95% based on Mol. Wt. 12,384, used as received and stored at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Glass scintillation vials</td><td>Wheaton</td><td>03-341-25J</td><td>20 ml, O.D. x height (with cap): 28&amp;nbsp;mm x 61&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>Disposable cuvette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-126</td><td>methacrylate, 10 mm x 10 mm x 45&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>Ultraviolet Visible Spectrophotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV-1800</td><td>Uses UVProbe v 2.33 software</td></tr><tr><td>Circular dichroism spectrometer (or spectropolarimeter)</td><td>JASCO</td><td>J-810</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Laboratory Refrigerator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene disposable beakers</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-291-10</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Tetramethylorthosilicate (also known as tetramethoxysilane, TMOS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>218472-500G</td><td>98% purity</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A457-4</td><td>GC Resolv grade</td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221228-25ML-A</td><td>ACS reagent, 28.0%-30.0%</td></tr><tr><td>General purpose polypropylene scintillation vials</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z376825-1PAK</td><td>16 mm x 57 mm, volume size 6.5&amp;nbsp;ml, slice off bottom with sharp knife or razor</td></tr><tr><td>generic plastic wrap</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M laboratory wrapping film</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Plastic syringe plunger</td><td>various</td><td></td><td>use syringe plunger from 3 ml syringe</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>Acros</td><td>61509-0040</td><td>Absolute, 200 proof, 99.5% A.C.S. reagent</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Critical point drying apparatus</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td>E3000 Series</td></tr><tr><td>Circulator</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 3016</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide cylinder</td><td>Tech Air</td><td></td><td>siphon tube</td></tr><tr><td>Micrometer</td><td>Central Tool Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRAMS/AI 8.0 software</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen cylinder</td><td>Tech Air</td><td></td><td>Another inert gas could be substituted</td></tr><tr><td>10% nitric oxide/90% nitrogen cylinder</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-switch valve</td><td>various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe needles</td><td>various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

encapsulating cytochrome c in silica aerogel nanoarchitectures without metal nanoparticles while retaining gas-phase bioactivity

Anwendungen wie Sensoren, Batterien und Brennstoffzellen wurden durch die Verwendung von hochporösen Aerogelen verbessert, wenn funktionelle Verbindungen innerhalb der Aerogele eingekapselt sind. Jedoch nur wenige Berichte über Proteine ​​in Sol-Gelen einkapselt, die verarbeitet werden Aerogele zu bilden, existieren. Ein Verfahren zum Einkapseln von Cytochrom c (cyt. C) in Siliciumdioxid (SiO 2) Sol-Gele , die überkritisch verarbeitet werden bioaerogels mit Gasphasenaktivität für Stickstoffmonoxid (NO) zu bilden , dargestellt. Cyt. C wird einem gemischten Kieselsol unter kontrollierten Proteinkonzentration zugegeben und Festigkeitsbedingungen puffern. Das Sol Mischung wird dann geliert und die Flüssigkeit in die Gelporen Füllen wird durch eine Reihe von Lösungsmittelaustausch mit flüssigem Kohlendioxid ersetzt. Das Kohlendioxid wird auf seinen kritischen Punkt gebracht und entlüftet trockenen Aerogele mit cyt zu bilden. C eingekapselt. Diese bioaerogels sind mit UV-VIS-Spektroskopie ein gekennzeichnetd Zirkulardichroismus-Spektroskopie und kann verwendet werden, um die Anwesenheit von Gasphasen Stickstoffmonoxid zu detektieren. Der Erfolg dieses Verfahrens beruht auf Regulieren des cyt. C die Konzentration und die Pufferkonzentration und erfordert keine andere Komponenten wie Metallnanoteilchen. Es kann möglich sein, andere Proteine ​​machen dieses Verfahren wichtig für die Entwicklung bioanalytische Geräte mögliche zukünftige Verwendung eines ähnlichen Ansatz zu verkapseln.

Die beschriebenen Verfahren führt zu Aerogelen , die lebensfähige cyt. C. Wie am Ende der Einleitung angegeben, cyt. C kann aus wässrigen Pufferlösungen eingekapselt werden , die 4,4 bis 70 mM Phosphat liegen. Beispiele für cyt. C -silica (cyt. C -SiO 2) Aerogele aus Lösungen mit verschiedenen Pufferkonzentrationen hergestellt sind in Abbildung 4 dargestellt. Alle Gele relativ durchscheinend sind, mit den von 70 aus Gelen mM die opakste puffern. Ein Vergleich der Spektroskopie von cyt. C unter verschiedenen Bedingungen ist in 5 dargestellt. Ein typisches Spektrum (Figur 5c) zeigt die große Soret Peak um 408 nm für cyt. C -SiO 2 Aerogele und ist sehr ähnlich dem Spektrum von cyt . c in Lösung (Figur 5a). Zusätzlich wird ein Spektrum von cyt.c innerhalb Aerogele mit Metall - Nanopartikeln verkapselt ist auch (5b) und die cyt gezeigt. c -SiO 2 Aerogel Spektrum ist ähnlich wie auch in diesem Spektrum. Wenn die cyt. C -SiO 2 Aerogel zu Stickstoffmonoxid freigelegt ist, wird eine typische Verschiebung der Soret-Bande beobachtet (Figur 5d). Die UV-Vis - Spektren von cyt gemacht Gele. C - Lösungen in verschiedenen Pufferkonzentrationen sind in 6 gezeigt. Alle diese Gele zeigen charakteristische UV-Vis - spektroskopischen Eigenschaften darauf hinweist , dass cyt. C ist nicht in einem denaturierten Zustand in den Gelen. Jedoch kann die verminderte Durchsichtigkeit der Gele aus 70 mM Puffer führt zu einem niedrigeren Signal-Rausch-Verhältnis für diesen Spektren vorgenommen. Die CD - Spektren von cyt. C -SiO 2 Aerogele sind ähnlich den Spektren von cyt c . </em&gt; innerhalb Aerogele mit Metall - Nanoteilchen eingekapselt, während beide Arten von Aerogel - Spektren aus einem Spektrum von cyt unterscheiden. c in gepufferter Lösung (Abbildung 7). Figur 8 zeigt eine typische Stickoxid Überwachungsantwort für cyt. C -SiO 2 Aerogele und entsprechenden Aerogele , die auch Metallnanoteilchen neben cyt. C enthalten. Der Unterschied zwischen der Absorption bei 414 nm und bei 408 nm gesehen wird erhöht und dann verringert wird, wenn die Gele zu Stickstoffmonoxid freigelegt sind und dann Stickstoff jeweils nacheinander. Wenn das überkritische Kohlendioxid nicht bei einer langsam genug Geschwindigkeit freigesetzt wird, die Lebensfähigkeit des cyt. C innerhalb der gebildeten Aerogele beeinträchtigt. Dies wird durch den Vergleich resultierenden UV-sichtbaren Spektren ergab nach Gelen durch Freisetzung des Kohlendioxids bei verschiedenen FormungsRaten (Abbildung 9). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig1.jpg" /> Abbildung 1: Kritischer Punkt Trocknungsvorrichtung kritischen Apparat Punkt - Trocknung von dem (A) vorne und (B) zurück mit der Transferboot und eine Vorrichtung Tür an der Rückseite des Geräts gezeigt unten gezeigt.. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig2.jpg" /> Abbildung 2: Karton - Plattform Die zusammengesetzte Karton Plattform ein Aerogel auf dem Weg eines Instruments des Strahls zu halten.. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig3.jpg" /> Abbildung 3: Stickstoffmonoxid Sensoraufbau Der Stickoxid - Messaufbau gezeigt einschließlich (A) dem Abzug von 10% Stickoxid eingeschlossen.90% Stickstoffzylinder, Schläuche und T-Ventil ist , und (B) die Küvette mit eingesetzten Nadeln. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig4.jpg" /> Abbildung 4:.. Beispiel cyt c -SiO 2 Aerogele Aerogele Einkapselung 15 uM cyt c in 4,4 mM, 40 mM und 70 mM Kaliumphosphat - Puffer sind im Vergleich zu einem Cent gezeigt von links nach rechts.. Diese Aerogele sind ca. 0,2-0,5 cm hoch. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 9. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig5.jpg" /> Abb . 5: Cyt c -SiO 2 Aerogel - Spektroskopie Sichtbare Spektren von 15 uM Cytochrom c in (a) 50 mM Phosphatpuffer Sols.ution; (B) Au (5 nm) ~ cyt c -SiO 2 Aerogel. (C) cyt c -SiO 2 Aerogel (Luft ausgesetzt). (D) cyt. C -SiO 2 Aerogel (ausgesetzt zu Stickstoffmonoxid für 3,5 min). Diese repräsentativen Spektren von jeder Art von Gel sind der Übersichtlichkeit halber Offset, und die gestrichelte Linie zeigt die Position der Soret-Bande des cyt. C in Puffer. Während jedes Spektrum von 15 uM cyt ist. C sind die Gelstärken (oder Höhen) nur 0,2-0,5-cm im Vergleich zu der 1-cm - Lösung Küvette in einer höheren Lösungs Extinktion ergibt. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 9. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig6.jpg" /> Abbildung 6: Aerogel - Spektroskopie als gekapselte Pufferkonzentration variiert Gemittelt UV-sichtbaren Spektralbereich Absorption von Aerogelen durch Gel - Weglänge für Gele geteilt Einkapselung 15 _.6; M cyt c in 70 mM (schwarz) (durchschnittlich 4 Spektren), 40 mM (rot, gepunktet) (durchschnittlich 8 Spektren) und 4,4 mM (grün gestrichelt) (durchschnittlich 9 Spektren) Kaliumphosphatpuffer. . Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 9. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig7.jpg" /> Abbildung 7:... Aerogel Zirkulardichroismus - Spektroskopie Circulardichroismus - Spektren von cyt c in Natriumphosphat - gepufferten Lösung (fest), zwei repräsentative Spektren von cyt c -SiO 2 Aerogele (gestrichelt) und zwei repräsentative Spektren von Au (5 nm) ~ cyt. c SiO- 2 Aerogele (gestrichelt). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 9. <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig8.jpg" /> Abbildung 8: Stickoxid - Detektion mit cyt c -SiO 2. </. sub&gt; Aerogele Überwachung der Verschiebung (&amp; Delta; A = A 414 nm - A 408 nm). in der Soret Intensität des cyt c (fest rot) und Au ~ cyt c (gestrichelte blaue) eingekapselt in SiO 2 Composite - Aerogel - Nanoarchitekturen als Gasstrom. umgeschaltet wird (ist wo Soret Peak-Maximum bei ~ 408 nm) zwischen Stickstoff und Stickstoffmonoxid (wo Soret Maximum bei ~ 414 nm-Spitze ist). Jede Kurve ist ein Mittelwert von 3-4 Versuchen mit zwei der cyt c -SiO 2 Versuche bei &amp; Delta; A = A überwacht 414 nm . - Ein 407 nm , da die anfängliche Soret Peak - Maximum bei 407 nm für diese Versuche war. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 9. <img alt="9" src="/files/ftp_upload/53802/53802fig9.jpg" /> Abbildung 9:. Wirkung der überkritischen Fluid Release - Zeit Gemittelt UV-sichtbaren Spektralbereich Absorption durch Gel - Weglänge für cyt geteilt c -SiO 2 Aerogele enca.psulating 10 uM cyt. c in 50 mM Phosphatpuffer , in dem die überkritisch getrockneten Aerogelen entweder durch Lösen kritischem Kohlendioxid über 45 min wurden (Feststoff, schwarz (durchschnittlich 9 Spektren)) oder 7 min (gestrichelte, rot (durchschnittlich 4 Spektren)). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung 9.

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Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

Einkapseln Cytochrome<em&gt; c</em&gt; In Silica Aerogel-Nanoarchitekturen ohne Metallnanopartikel unter Beibehaltung der Gasphase Bioaktivität

Dieses Verfahren beschreibt , wie Cytochrom c zu kapseln (cyt. C) in Kieselsäure (SiO 2) Sol-Gele, Verfahren diese Gele bioaerogels zu bilden, und diese bioaerogels verwenden , um schnell Stickstoffmonoxid (NO) durch eine Gasphasenreaktion zu erkennen. Diese Art von Protokoll kann bei der zukünftigen Entwicklung von Biosensoren oder andere bioanalytische Geräte unterstützen.

Applications such as sensors, batteries, and fuel cells have been improved through the use of highly porous aerogels when functional compounds are ...

encapsulating-cytochrome-c-silica-aerogel-nanoarchitectures-without

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

10.3K Aufrufe.  Fairfield University.  Dieses Verfahren beschreibt , wie Cytochrom c zu kapseln (cyt. C) in Kieselsäure (SiO 2) Sol-Gele, Verfahren diese Gele bioaerogels zu bilden, und diese bioaerogels verwenden , um schnell Stickstoffmonoxid (NO) durch eine Gasphasenreaktion zu erkennen. Diese Art von Protokoll kann bei der zukünftigen Entwicklung von Biosensoren oder andere bioanalytische Geräte unterstützen. 

Serie: Encapsulating Cytochrome c in Silica Aerogel Nanoarchitectures without Metal Nanoparticles while Retaining Gas-phase Bioactivity

Preparation of Silica Nanoparticles Through Microwave-assisted Acid-catalysis

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle diameters ranging from 30-250 nm by varying the reaction conditions. Through the selection of a microwave compatible solvent, silicic acid precursor, catalyst, and microwave irradiation time, these microwave-assisted methods were capable of overcoming the previously reported shortcomings associated with synthesis of silica nanoparticles using microwave reactors. The siloxane precursor was hydrolyzed using the acid catalyst, HCl. Acetone, a low-tan &#948; solvent, mediates the condensation reactions and has minimal interaction with the electromagnetic field. Condensation reactions begin when the silicic acid precursor couples with the microwave radiation, leading to silica nanoparticle sol formation. The silica nanoparticles were characterized by dynamic light scattering data and scanning electron microscopy, which show the materials&#39; morphology and size to be dependent on the reaction conditions. Microwave-assisted reactions produce silica nanoparticles with roughened textured surfaces that are atypical for silica sols produced by St&#246;ber&#39;s methods, which have smooth surfaces.

Silica nanoparticles were prepared using acid-catalysis of a siloxane precursor and microwave-assisted synthetic techniques resulting in the controlled growth of nanomaterials ranging from 30-250 nm in diameter. The growth dynamics can be controlled by varying the initial silicic acid concentration, time of the reaction, and temperature of reaction.

Herstellung von Silica-Nanopartikeln durch Mikrowellen-unterstützte Säure-Katalyse

Microwave-assisted synthetic techniques were used to quickly and reproducibly produce silica nanoparticle sols using an acid catalyst with nanoparticle ...

Forschung

Chemie

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Biotechnik

Preparing Silica Aerogel Monoliths via a Rapid Supercritical Extraction Method

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The procedure requires 15-20 min of preparation time, during which a liquid precursor mixture is prepared and poured into wells of a metal mold that is placed between the platens of a hydraulic hot press, followed by several hours of processing within the hot press. The precursor solution consists of a 1.0:12.0:3.6:3.5 x 10-3 molar ratio of tetramethylorthosilicate (TMOS):methanol:water:ammonia. In each well of the mold, a porous silica sol-gel matrix forms. As the temperature of the mold and its contents is increased, the pressure within the mold rises. After the temperature/pressure conditions surpass the supercritical point for the solvent within the pores of the matrix (in this case, a methanol/water mixture), the supercritical fluid is released, and monolithic aerogel remains within the wells of the mold. With the mold used in this procedure, cylindrical monoliths of 2.2 cm diameter and 1.9 cm height are produced. Aerogels formed by this rapid method have comparable properties (low bulk and skeletal density, high surface area, mesoporous morphology) to those prepared by other methods that involve either additional reaction steps or solvent extractions (lengthier processes that generate more chemical waste).The rapid supercritical extraction method can also be applied to the fabrication of aerogels based on other precursor recipes.

This article describes a rapid supercritical extraction method for fabricating silica aerogels. By utilizing a confined mold and hydraulic hot press, monolithic aerogels can be made in eight hours or less.

Vorbereiten Silica Aerogel Monolithen über eine schnelle Überkritische Extraktion-Methode

A procedure for the fabrication of monolithic silica aerogels in eight hours or less via a rapid supercritical extraction process is described. The ...

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

Synthese und katalytische Aktivität von Gold-Intercalated in den Wänden der mesoporösen Silicat-

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

Herstellung und Prüfung von katalytischen Aerogelen über schnelle überkritische Extraktion vorbereitet

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Preparation of Functional Silica Using a Bioinspired Method

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally purify the same by acid elution. By combining sodium silicate with a polyfunctional bioinspired additive, silica is rapidly formed at ambient conditions upon neutralization. 
The effect of neutralization rate and biomolecule addition point on silica yield are investigated, and biomolecule immobilization efficiency is reported for varying addition point. In contrast to other porous silica synthesis methods, it is shown that the mild conditions required for bioinspired silica synthesis are fully compatible with the encapsulation of delicate biomolecules. Additionally, mild conditions are used across all synthesis and modification steps, making bioinspired silica a promising target for the scale-up and commercialization as both a bare material and active support medium.
The synthesis is shown to be highly sensitive to conditions, i.e., the neutralization rate and final synthesis pH, however tight control over these parameters is demonstrated through the use of auto titration methods, leading to high reproducibility in reaction progression pathway and yield. 
Therefore, bioinspired silica is an excellent active material support choice, showing versatility towards many current applications, not limited to those demonstrated here, and potency in future applications.

Here, we present a protocol to synthesize bioinspired silica materials and immobilize enzymes therein. Silica is synthesized by combining sodium silicate and an amine &#39;additive&#39;, which neutralize at a controlled rate. Material properties and function can be altered either by in situ enzyme immobilization or post-synthetic acid elution of encapsulated additives.

Vorbereitung der funktionalen Kieselsäure mit einer Muskelmodelle Methode

The goal of the protocols described herein is to synthesize bioinspired silica materials, perform enzyme encapsulation therein, and partially or totally ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Eine schnelle Synthese-Methode für Au, Pd und Pt-Aerogelen über lösungsorientierte Direktreduktion

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis Method for Cellulose Nanofiber Biotemplated Palladium Composite Aerogels

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often result in fragile aerogels with poor shape control. The use of carboxymethylated cellulose nanofibers (CNFs) to form a covalently bonded hydrogel allows for the reduction of metal ions such as palladium on the CNFs with control over both nanostructure and macroscopic aerogel monolith shape after supercritical drying. Crosslinking the carboxymethylated cellulose nanofibers is achieved using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) in the presence of ethylenediamine. The CNF hydrogels maintain their shape throughout synthesis steps including covalent crosslinking, equilibration with precursor ions, metal reduction with high concentration reducing agent, rinsing in water, ethanol solvent exchange, and CO2 supercritical drying. Varying the precursor palladium ion concentration allows for control over the metal content in the final aerogel composite through a direct ion chemical reduction rather than relying on the relatively slow coalescence of pre-formed nanoparticles used in other sol-gel techniques. With diffusion as the basis to introduce and remove chemical species into and out of the hydrogel, this method is suitable for smaller bulk geometries and thin films. Characterization of the cellulose nanofiber-palladium composite aerogels with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, thermal gravimetric analysis, nitrogen gas adsorption, electrochemical impedance spectroscopy, and cyclic voltammetry indicates a high surface area, metallized palladium porous structure.

A synthesis method for cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented.The resulting composite aerogel materials offer potential for catalysis, sensing, and hydrogen gas storage applications.

Synthesemethode für Cellulose Nanofaser Biotemplated Palladium Composite Aerogels

Here, a method to synthesize cellulose nanofiber biotemplated palladium composite aerogels is presented. Noble metal aerogel synthesis methods often ...

Aesthetically Enhanced Silica Aerogel Via Incorporation of Laser Etching and Dyes

A procedure for aesthetically enhancing silica aerogel monoliths by laser etching and incorporation of dyes is described in this manuscript. Using a rapid supercritical extraction method, large silica aerogel monolith (10 cm x 11 cm x 1.5 cm) can be fabricated in about 10 h. Dyes incorporated into the precursor mixture result in yellow-, pink- and orange-tinged aerogels. Text, patterns, and images can be etched onto the surface (or surfaces) of the aerogel monolith without damaging the bulk structure. The laser engraver can be used to cut shapes from the aerogel and form colorful mosaics.

This protocol describes a method for etching text, patterns, and images onto the surface of silica aerogel monoliths in native and dyed form and assembling the aerogels into mosaic designs.

Ästhetisch verbessertes Silica-Aerogel durch Einbau von Laserätzen und Farbstoffen

A procedure for aesthetically enhancing silica aerogel monoliths by laser etching and incorporation of dyes is described in this manuscript. Using a rapid ...

Ingenieurwesen

Imprägnierung und Veredelung von aminierten Verbindungen auf Kieselsäuresubstraten

A Synthetic Methodology for Preparing Impregnated and Grafted Amine-Based Silica Composites for Carbon Capture

Recently, there has been a significant effort towards reducing or mitigating CO2 emissions through the use of carbon capture materials for point source or direct air capture (DAC) methods. This work focuses on amine-functionalized CO2 adsorbents for DAC. These materials show promise for CO2 removal because they have low regeneration energy consumption and high adsorption capacity. The incorporation of amine species into a porous substrate combines the advantages of the amine species&#39; affinity to CO2 with the large pore volumes and surface areas of the porous substrate. There are three methods commonly used to prepare amine-based CO2 sorbents, depending on the selection of the amine species, material support, and preparation method. These methods are impregnation, grafting, or chemical synthesis. Silica is a prevalent choice of substrate material because of its adjustable pore size, moisture tolerance, temperature stability, and ability to adsorb CO2 in low concentrations for DAC applications. Typical synthetic procedures and primary attributes of both impregnated and grafted amine-silica composites are described herein.

Autor im Rampenlicht: Standardisierung der Entwicklung von aminbasierten Silica-Kompositen als CO2-Adsorbentien für Direct Air Capture 

This work aims to facilitate the development of standardized techniques for impregnating or grafting aminated compounds onto silica substrates, which are often broadly described in the literature. Specific amounts of solvent, substrate, amines, and the values of other important experimental parameters will be discussed in detail.

Eine synthetische Methode zur Herstellung von imprägnierten und gepfropften Kieselsäure-Verbundwerkstoffen auf Aminbasis für die Kohlenstoffabscheidung

Recently, there has been a significant effort towards reducing or mitigating CO2 emissions through the use of carbon capture materials for point source or ...

Einkapseln Cytochrome

Zusammenfassung

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