Name: protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula at JoVE.co

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. Zygotic Embryo-Entwicklung <ol><li> Pflanzenmaterial <ol><li> Wachsen die Medicago truncatula Wildtyp Jemalong oder dessen in der Nähe von isogenen, hoch wieder erzeugbaren Genotyp Jemalong 2HA 13 (als 2HA bekannt) in einem Gewächshaus mit einer 14 h Fotoperiode und 23 ° C / 19 ° C Tag / Nacht-Temperatur. <ol><li> Pierce die Oberfläche der Samenschale (mit einer 23 G-Nadel) vor der Aussaat der Samen, so dass Wasser ist erlaubt, um den Samen geben und genießen in Wasser über Nacht. Fügen Sie genug Wasser, um den Samen vollständig abdecken. </li><li> Sow 3 Samen in jeder 15 cm Durchmesser Topf (insgesamt 10 Töpfe) in Blumenmischung (Grobsand, Perlit, Kokosfaser-Torf (1: 1: 1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: Langzeitdünger) und Transfer zum Gewächshaus. Bewahren Sie die gesündeste Sämling nach der Keimung, so gibt es 1 Pflanze pro Topf und umgeben von einem Gitter für die Pflanzenstengel zu klettern. </li></ol></li></ol></li><li> Harvesting Pods <ol><li> Sammeln Sie Früchte aus der wild Typ Jemalong oder 2HA, um die entsprechenden frühen Embryo Stufen zu erhalten, wie zuerst beschrieben 9. HINWEIS: Die verschiedenen pod Stufen sind in Figur 1 gezeigt, und die entsprechenden Embryo Stufen sind in Abbildung 2 dargestellt. </li><li> Überprüfen Sie die verschiedenen pod Stufen bei der Ernte mit Hilfe von Kriterien gemäß Tabelle 1. Messen Sie die Zeit von Stufe 6 vergangen zu getrennten Stufen 6 und 7 (Tabelle 2) zu helfen. </li></ol></li><li> Sezieren Samenanlagen von Hülsen und die Überprüfung der Embryonalstadium <ol><li> Isolieren Samenanlagen von Hülsen mit feinen Pinzette allein oder einem Stereo Binokular und Pinzette wie nötig. Bei Bedarf kann der Embryo Phase kann mit einem Standard-gesetzten Mikroskop (3B) schnell überprüft werden. </li><li> Bereiten geändert Hoyers Lösung, die 7,5 g Gummi arabicum, 100 g Chloralhydrat, 5 ml Glycerin, 60 ml entionisiertem, destilliertem Wasser. Lösen sich durch Rühren für 3-5 Stunden oder über Nacht. </li><li> Weitere verfeinernd Mikroskopie deaktivieren Sie die seziert Samenanlagen in modifizierten Hoyer-Lösung 15,16. Vorsichtig holen die intakten Eizellen und in einem kleinen Volumen von Hoyer-Lösung (genug, um die Samenanlage abdecken) bei Raumtemperatur, bis klar. </li><li> Sehen Sie sich die Proben mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik. Erfassen Sie die Bilder iwth einer Digitalkamera 9 (Abbildung 2). </li><li> Besorgen Sie sich die gleichmäßige Samenanlagen aus dem Mittelbereich der pod und sammeln die erforderliche Anzahl. Ein Beispiel ist in 3A gezeigt. Sammeln Sie die Samenanlagen auf Eis und an einem gewünschten Temperatur (-80 ° C für Nukleinsäuren) zur weiteren Analyse. HINWEIS: Einzelheiten zur Analyse der histologischen Schnitten, Transmissionselektronenmikroskopie, und in-situ-Hybridisierung finden Sie Papiere 8,9. </li></ol></li></ol> 2. Entwicklung somatischer Embryonen in vitro- <ol><li> Verwenden Sie ein M. truncatula Sorte tHut ist in der Lage, leicht zu bilden Embryonen in Kultur. Aus diesem Protokoll für Blattexplantate verwenden 2HA Pflanzen 13,17, die 2-4 Monate alt sind. </li><li> Nehmen Sie aus dem aktuellen Flugblätter fast vollständig erweitert dreiblättrigen Blatt einer Verlängerungsschaft. </li><li> Halten Sie die dreiblättrigen Blätter auf feuchten Papiertüchern in einem Kulturtopf um Austrocknung zu vermeiden. Hinweis: Wenn der dreiblättrigen Blätter geerntet werden sie brauchen, um mit minimaler Verzögerung genutzt werden. </li><li> Herstellung des Kulturmediums <ol><li> Verwenden Sie den P4 10: 4: 1: 5 Medium in Agar (0,8% w: v) in 9 cm Petrischalen. HINWEIS: Der P4 10: 4: 1: 5-Medium besteht aus dem P4-Basalmedium 18 plus 10 &amp; mgr; M 1-Naphthalinessigsäure (NAA), 4 &amp; mgr; M 6-Benzylaminopurin (BAP), 1 &amp; mgr; M Abscisinsäure (ABA) und 5 uM gibberellic Säure (GA). Die Verwendung von GA + ABA beschleunigt Embryobildung und verursacht materiellen Steigerungen Embryo Nummer 14. </li><li> Bilden die die P4 Grundmedium in 1 L; bestehend aus Hauptsalze (machen Calcium separat), kleinere Salze und Vitamine (Tabelle 3), Chelat-Eisen (bilden separat), Casaminosäuren (Caseinhydrolysat), 30 g Saccharose, 8 g Agar. </li><li> Shop Stammlösungen der wichtigsten Salze, Calcium, Casaminosäuren, kleinere Salze und Vitamine bei -20 ° C in geeigneten Teilmengen. Speichern Chelateisen bei 4 ° C. </li><li> Bilden den chelatisierten Eisen (200x) durch Auflösen 7,44 g Na 2 EDTA • 2H 2 O in etwa 900 ml entionisiertem destilliertem Wasser unter Rühren, dann wird die Lösung auf 98-99 ° C unter Zugabe von 1,853 g FeSO 4 • 7 H 2 O. Schließlich auf 1 L, wenn die Inhaltsstoffe gelöst sind. Shop in bernsteinfarbenen Flaschen bei 4 ° C. </li><li> Machen den P4 Grundmedium mit den Stammlösungen, wie in Tabelle 4. Die Hormone im Medium sind 10 uM NAA, 4 uM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (siehe Tabelle 4 und spezifische Materialien Tabelle). Fügen Sie die NAAund BAP vor dem Autoklavieren und fügen ABA und GA nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf etwa 55 ° C unter Verwendung von Filtersterilisation mit einem 0,22 um-Filter in eine Spritze befestigt. Und Mischen leicht schwenken. </li><li> Stellen Sie die Medien auf pH 5,8 mit 1 M KOH vor dem Autoklavieren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. </li><li> Nach dem Autoklavieren fügen Sie den Filter sterilisiert ABA und GA, und gießen Sie etwa 25 ml Medium in sterile 9 cm Petrischalen in einer Steril oder Biohazard Schrank. Kühl und lassen Sie die Agar mit dem Deckel off gesetzt. Dann legen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, es gibt keine Kondensat auf dem Deckel. Label nach Bedarf und bei 4 ° C (in einem Karton auf Deckel Kondensat vermeiden). </li></ol></li><li> Sterilisation von Blattgewebe <ol><li> Arbeiten Sie in einem UV-sterilisiert Sterilbank oder Biohazard Schrank. </li><li> Platz verlässt Ball in die Maschen eines zuvor autoklaviert Frühjahr Tee-Ei. </li><li> Tauchen Tee-Ei, das die Blätter in 70% (v: v) Ethanol in einer Stichture Topf für 30 Sekunden. Hinweis: Für alle Schritte in diesem Verfahren verwenden 250 ml Schraubverschluss Polycarbonat Kulturgefäßen, die autoklaviert werden. </li><li> Ablassen und dann übertragen und tauchen in das Blattgewebe in 1: 8 (v: v) verdünnt Bleiche (0,5% Chlor) für 10 min. Vorsichtig schwenken von Zeit zu Zeit. </li><li> Lassen Sie das Bleichmittel und überweisen Sie den Tee-Ei in einer Kultur Topf mit sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Vorsichtig schwenken und überschüssiges Wasser abtropfen lassen. Wiederholen Sie noch einmal mit frischem Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. </li><li> Blätter aus dem Tee-Ei mit einer sterilen Pinzette entfernen, um ein frisches Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Schrauben Sie die sterile Schutzkappe und spülen Sie durch Umdrehen und wirbeln. Lassen Blätter schwimmen auf dem sterilem Wasser bis zu seiner Explantate vorzubereiten. </li></ol></li><li> Vorbereitung und Beschichtung Explantate <ol><li> Mit sterilen Techniken, Trimm einzelnen sterilisiert Flugblätter von der Kante mit einem Skalpell, und schneiden Sie die verbleibenden Rechtecks ​​in zwei oder three rechteckigen Explantate (8-10 x 3-5 mm) mit der Mitte der Vene in der Mitte jedes Explantat (5A). HINWEIS: Die Größe des Explantats ist ziemlich wichtig im Hinblick auf die ersten Verhornung. Führen Sie den Schneid auf sterilen Deckeln aus Take-away-Essen-Container. </li><li> Platte 6 Explantate auf Agar verfestigten Nährboden in 9 cm Petrischalen (5B). Platte der Explantate abaxial Seite nach unten zu den üblichen Blatt Ausrichtung zu halten. </li><li> Verschließen Sie die Petrischalen mit Parafilm (5C) gestreckt um die Schale. Das Gewebe ist nun bereit für die Inkubation. </li></ol></li><li> Tissue Incubation <ol><li> Die Platten im Dunkeln inkubieren bei 28 ° C in einem Raum mit kontrollierter Temperatur oder Wachstumskammer in der gesamten Kulturperiode. HINWEIS: Die Explantate werden Entdifferenzierung initiieren, Zellteilung, Zellproliferation (Kallusbildung) und Embryogenese (Differenzierung) zu unterziehen. </li><li> Subkultur die Differenzierung Sälen mit Kaminnts nach 3 Wochen auf frisches Medium. An dieser Subkultur überweisen Sie den gesamten Explantat mit einem sterilen Spatel und Pinzette aus rostfreiem Stahl, in einer Steril oder ein Biohazard Schrank. Wie Verhornung auftritt und der Kallus die Größe der größte in 5C überschreitet, übertragen 50% der einzelnen Kallus bei Subkultivierung auf frischem Medium. </li><li> Beachten Sie die ersten Embryonen in ca. 4 Wochen. Zwar gibt es ein gewisses Maß an Synchronität, sammeln verschiedene Embryo Stufen über einem 4-8 Woche Inkubationszeit (6A, B). Sammeln unter einem Binokular und Verfahren nach Versuchsziele. </li><li> Subkultur alle 3 Wochen und Embryonen periodisch zu entfernen, so dass die Explantate werden weiterhin Embryonen für 3 Monate zu produzieren. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing interests.

Die beschriebenen Protokolle sind relativ einfach und ermöglicht Untersuchung der Leguminosen Embryogenese mit allen modernen Zell- und molekulare Techniken. Wir erkennen, dass es Vorteile und Nachteile sowohl in vivo und in vitro-Ansätze. Beide erlauben mehr Fokus auf der frühen Embryogenese im Vergleich zu Kultur der unreifen Samen 19. Im Fall von in vivo-Studien, was beschrieben wird vorwiegend die Isolierung der Samenanlage von dem POD passend fü...

Hülsenfrüchte sind die drittgrößte Gruppe von höheren Pflanzen mit ca. 20.000 Arten und der (oder Fabaceae) Familie Leguminosae sind einmalig Getreide in Gebiet geerntet und Gesamtproduktion 1. Sojabohne ist die drittgrößte Kulturpflanzen. Hülsenfrüchte liefern etwa ein Drittel des Nahrungsprotein und ein Drittel von Pflanzenöl für den menschlichen Verzehr 2. Hülsenfrüchte mit Fixierfähigkeit N 2 auch dazu beitragen, eine nachhaltige landwirtschaftliche Systeme. Medicago truncatula, wie Sojabohne, speichert Protein und Öl in den Kotyledonen der Samen und ist eine genetische und genomische Leguminosen Modell mit erheblichen genetischen und genomischen Ressourcen 3,4. Während M. truncatula hat Fortschritte im Verständnis der Leguminosen-Rhizobien Symbiose 4 hat es zunehmend eingesetzt, um Hülsenfruchtsamen Biologie 5-7 und Embryogenese 8,9 studieren aktiviert. Arabidopsis Embryogenese wurde intensiv untersucht, aber es 10,11 isa Nichthülsenfrucht und die Details der Embryogenese sind nicht identisch mit Medicago 8,10. Zygotischen Embryogenese in M. truncatula hat interessante Features, mit einem unverwechselbaren vielzelligen Hypophyse, einer endoployploid suspensor und basalen Übertragungszelle 8. Somatische Embryogenese (SE) wird üblicherweise zur Regeneration von Pflanzen 12 eingesetzt. In der Hülsenfrüchte Modell M. truncatula das Saatgut Linie Jemalong 2HA (2HA) wurde aus der Mutter Jemalong entwickelt worden, um hohe somatische Embryo 13 haben. Die Zahl der Embryonen hergestellt wurde kürzlich inhaltlich, indem sowohl die Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) in die seit langem etablierte Medium 14 erhöht. In diesem Fall GA und ABA wirken synergistisch, was ungewöhnlich ist da GA und ABA in der Regel 14 antagonistisch wirken. Die aus Kallus produziert Embryonen entwickeln sich auf der Oberfläche, die das Stadium der Embryogenese, leicht bestimmt werden können Visually und leicht geerntet. Mit in der Nähe von isogenen Linien, die embryo (2HA) und nicht-embryo (Jemalong) sind erleichtert die Untersuchung der somatischen Embryogenese und sowohl in vivo und in vitro-Systemen bietet verschiedene Experimentiermöglichkeiten. Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der Embryoentwicklung ist wesentlich für das Verständnis Saatgut und Pflanzenentwicklung. In Hülsenfrüchten, wie in anderen Dikotyle ist es die Cotyledonen des Embryos, die die Produkte, die für die menschliche Ernährung verwendet werden, zu speichern. Der frühen Embryogenese beinhaltet schnelle Zellteilung und korrekte Embryo Musterung. In ca. 8 Tage nach der Befruchtung, der M. truncatula Embryo erreicht frühen Keimblattstufen. Die morphologischen Charakterisierung ist nicht genau durch Tage nach der Befruchtung in Gewächshausbedingungen angedeutet. Somit ist eine effiziente Standardansatz, um die Phase der sich entwickelnden Embryonen zeigen wertvoll bei der Untersuchung der genetischen regulation der frühen Embryogenese zygotische. In diesem Beitrag stellen wir zwei standardisierte Protokolle, um sich entwickelnden Embryonen für biologische Untersuchungen der Embryogenese in der Hülsenfrüchte Modell M. sammeln truncatula. Die erste ist zu zygotischen Embryos durch Zuordnung der Embryogenese und pod Morphologie während der zweite ist die somatische Embryogenese via Kultivierung Blattexplantate zu leicht zugänglich großen Embryo Zahlen liefern zu sammeln.

<table><tbody><tr><td>P4 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td></tr><tr><td>Major salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minor salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Plant hormones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthaleneacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Dissolve in small amount of ethanol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Or similar, with suitable optics</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Or similar</td></tr><tr><td>Sterilising leaves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoclavable</td></tr></tbody></table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

Der frühen Embryogenese ausgehend von einer einzigen Zelle Zygote geht durch schnelle Zellteilung und Morphogenese und ist morphologisch durch pre-kugelförmig, kugelförmig, Herz, Torpedo und Keimblattstufen gekennzeichnet. Diese fortschreitende Entwicklung ist unter der strengen Regelung einer komplexen molekularen Netzwerk. Ernte ausreichend frühen Embryonen in einem ähnlichen Entwicklungsstufe ist für die Untersuchung der zellulären und molekularen Regulation der frühen Embryogenese. Das ist nicht einfach, da der frühen Embryogenese erfährt rasche Morphogenese in kurzer Zeit zB 8 Tage Medicago truncatula die frühen Keimblattstadium zu erreichen. Hier wenden wir uns das Problem durch zwei Ansätze. Die erste stellt eine Verbindung zwischen der Embryonalentwicklung und pod Morphologie helfen zeigen die Stufe des zygotischen Embryos. Dies ist insbesondere auf die Anzahl der Spiralen und pod Entwicklung der Stacheln beruht. Ein alternativer Weg zur Ergänzung des in vivo sTUDIEN ist über Kultivierung Blattexplantate zu somatischen Embryonen zu produzieren. Das Medium enthält eine ungewöhnliche Hormonkombination - ein Auxin (1-Naphthalinessigsäure), ein Cytokinin (6-Benzylaminopurin), Abscisinsäure und Gibberellinsäure. Die verschiedenen Phasen erkennbar wachsen aus dem Kallus ohne Dissektion werden.

Für zygotischen Embryogenese Kultivare Strukturen entsprechend den verschiedenen Embryo Stufen in 1A gezeigt - F - F während die verschiedenen Embryo Stufen in 2A gezeigt. Durch die Auswahl Schoten auf der gleichen Stufe, Proben von Samenanlagen, die sehr gleichmäßige erhalten werden (3A) sind. Durch die Verwendung von RT-qPCR Embryo bestimmte Gene können leicht erkannt und Zeitverlauf Studien evaluiert 9. Einige zusätz...

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

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Universidad San Sebastian

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JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.9K Aufrufe.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Serie: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Forschung

Genetik

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Entwicklungsbiologie

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular prepatterns determine the initial length-scale of somites, mechanical processes have been implicated in setting their final size and shape. To better understand the intrinsic material properties of somites, a method is developed to culture single-somite explant from zebrafish embryos. Single somites are isolated by first removing the skin of embryos, followed by yolk removal and sequential excision of neighboring tissues. Using transgenic embryos, the distribution of various sub-cellular structures can be observed by fluorescent time-lapse microscopy. Dynamics of explanted somites can be followed for several hours, thus providing an experimental framework for studying tissue-scale shape changes at single-cell resolution. This approach enables direct mechanical manipulation of somites, allowing for dissection of the material properties of the tissue. Finally, the technique outlined here can be readily extended for explanting other tissues such as the notochord, neural plate, and lateral plate mesoderm.

We present a protocol for isolating single somites from zebrafish embryos, the dynamics of which can be followed in culture for several hours by fluorescence time-lapse microscopy, thus providing a methodology to quantify tissue-scale shape changes at single-cell resolution.

The body axis of vertebrate embryos is periodically subdivided into 3D multicellular units called somites. While genetic oscillations and molecular ...

Isolierung und Genotypisierung von gastrulierenden Mausembryonen für die Einzelzellsequenzierung

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

Autor im Rampenlicht: Eine Pipeline zur Analyse linienspezifischer mutierter Embryonen mit Einzelzellauflösung

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht

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Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Preparation of Single-Somite Explants from Zebrafish Embryos

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation