Name: measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research
Uploaded: 2015-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
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The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

HINWEIS: Alle in diesem Dokument beschriebenen Verfahren werden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Michigan State University gegründet geführt. 1. Systemvorbereitungs und Setup <ol><li> Achten 5 l physiologischer Kochsalzlösung (PSS), die die für eine Gewebebad Kontraktion Experiment, das bis zu 50 ml Gewebebäder verwendet benötigte Menge ist; siehe Tabelle 2 PSS Rezept. Berechnen insgesamt erforderliche Volumen durch die Anzahl der Gewebebädern Badumwälzungen und anschließende Multiplikation mit der Anzahl der erforderlichen Gewebe Wäschen. <ol><li> Verwenden Sie Tabelle 2 als Leitfaden für die Herstellung von PSS. Auflösen der Salze in etwa 4 l Wasser. HINWEIS: HPLC - Typ I Wasser wird empfohlen </li><li> 8 ml 1 M CaCl 2 -Lösung (147 g / l Bei Verwendung des Dihydrat-Salz) zu der Lösung, so dass die Gesamtlösung ist 1,6 mM Calcium. </li><li> Quanten sufficit PSS Lösung auf 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Vorheizen Gewebebad System auf 37 ° C durch Einschalten der rezirkulierenden erhitztes Wasserbad. Critical Schritt: Jede Komponente des Systems ist mit Wassermantel, sicherzustellen, dass sie in Serien miteinander verbunden sind. Die Durchflussrichtung ist von entscheidender Bedeutung - dafür sorgen, dass Wasser fließt in jede Komponente auf dem niedrigsten Stacheldraht-Anschluss und bei der höchsten Stacheldraht Verbindung. </li><li> Schalten Sie Datenerfassungssystem. Macht auf den Kraftaufnehmer mindestens 15 min vor dem Experiment zu temperieren. HINWEIS: Die meisten Kraftaufnehmer beschäftigen Dehnungsmessstreifen, die empfindlich auf Temperaturschwankungen sind und eine thermische Drift zunächst nach Spannung gesetzt wird. </li><li> Starten Sie Software zur Datenerfassung und gewährleisten Zusammenhang mit Datenerfassungssystem. Bitte folgen Herstellung Anweisungen zur Aktivierung Datenaufzeichnung. </li><li> Achten Sie darauf, die Kraftaufnehmer vor Gewebe im Gewebe Bad und vor Datenaufzeichnung gestartet platziert kalibriert; follow Anweisungen des Herstellers für die Kalibrierung. </li><li> Schließen Sie das Gewebebad System zu einem 95% O 2/5% CO 2 für medizinische Zwecke Gasflasche und auf Gaslecks und dann das System drucklos. </li><li> Füllen Sie die Gewebebad Behälter mit PSS und die Lösung Zeit, um eine optimale Temperatur zu erreichen. Prime das System und entfernen Sie Luftblasen im System und Schläuche. </li><li> Prüfen Gewebebad Belüfter konsistente Lösung Belüftung, die die PSS-Puffer oxygeniert und liefert die Brownsche Bewegung, Medikamente, die im Gewebebad während des Experiments eingeführt wird verteilen gewährleisten. Stellen Sie sicher, Belüftung / Blasen nicht Gewebebewegung, die Datenaufzeichnungen stören verursachen; verringern Gasstrom nach Bedarf. HINWEIS: Die Gewebebad und Datenerfassungssystem sind nun bereit, das Experiment zu starten. </li></ol> 2. Gewebepräparation <ol><li> Idealerweise sezieren Gewebe aus dem Tier unmittelbar vor der Verwendung und kann direkt into PSS. HINWEIS: Einige Gewebe können in PSS über Nacht bei 4 ° C gespeichert werden, aber entsprechende Kontrollen muss getan werden, um Gewebefunktion nach längerer Lagerung zu validieren; siehe Abschnitt 6. </li><li> Verwenden Sie die Aorta als das Gewebe in dieser Übung. </li><li> Anesthetize die Ratte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts und legen Sie die Rattenrückenseite nach unten. Betäubung Bestätigen über eine Zehen Prise und dem Verlust der Reflexantwort auf diesen schmerzhaften Reiz. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet 70 mg / kg Pentobarbital durch eine intraperitoneale Injektion verabreicht. Richtlinien des Instituts für Nager Anästhesie können abweichen. </li><li> Erstellen eines Pneumothorax durch Herstellen eines Einschnitts mit einer Schere entlang der Membran an der Unterseite der Rippen. Dann setzen die Inzision von der Unterseite des Brustkorbs zum Sternum und halbieren. </li><li> Präparieren Sie weg oder legen beiseite jene Organe, die an der Spitze der Wirbelsäule sind und suchen Sie die Aorta, die direkt entlang der Wirbelsäule liegt. HINWEIS: Diese step bietet eine klare Arbeitsraum zu sezieren die Aorta. </li><li> Sever alle Verbindungen zu der Aorta; aus der Speiseröhre, der Lunge usw., und schneiden die Aorta senkrecht zur Wirbelsäule in der Ebene der Membran. </li><li> Halten Sie das Aorta mit einer Pinzette und mit einer Schere die Aorta von der Wirbelsäule zu sezieren. Starten Sie die Dissektion in der unteren Membranfläche angrenzend an die Wirbelsäule und die Arbeit zum Herzen hin. Achten Sie darauf, zusätzliche Vorsichtsmaßnahme, um nicht ziehen oder zerren an der Aortagewebe, die das Gewebe schädigen können zu nehmen. </li><li> Unmittelbar danach die Aorta in die vorbereitete Dissektion Schale mit PSS. HINWEIS: Dissektion der Aorta in Ringe am besten in einem Seziertisch Gericht, das einen schwarzen Silastic Stiftung hat getan. Dies ermöglicht die Verwendung von Drähten, die verwendet werden können, um die Aorta kanülieren und an der Schale befestigt werden, wodurch die Stabilität während der Dissektion Schale. Der schwarze Hintergrund bietet dagegen das Sezierung hilft. Es sollte bei Verwendung Kanülieren Drähte Endothels entnommen werdenial Zellschicht kann mit überschüssiger Reibung der Draht gegen das Lumen des Gefäßes entfernt werden können. </li><li> Werfen Sie einen Draht und einen kleinen Winkel von 90 ° an einem Ende und drücken Sie den abgewinkelten Ende in das Silastic Grundlage, um den Führungsdraht zu verankern. Legen Sie die gesamte Aorta in der Dissektion Gericht. </li><li> Halten Sie das Ende des Führungsdrahtes mit einer Pinzette, und dann sanft führen Sie das Kabel in das Lumen der Aorta. </li><li> Verwenden einer Pinzette, und schieben Sie die Aorta auf den Draht. Wenn das freie Ende des Führungsdrahtes zu sehen ist, die Kurve der Draht vorsichtig und legen Sie das freie Ende in die Silastic Gründung der Schale, um das Gewebe zu stabilisieren. </li><li> Mit kleinen Vannas Schere und Pinzette, entfernen Sie die perivaskulären Fettgewebe und alle anderen Fremdgewebe, Blutgerinnsel, usw., bis der thorakalen Aorta erscheint weiß und etwas faserig. </li><li> Entfernen Sie die gereinigt Aorta aus Draht und mit einer Schere die Aorta in Ringe, die etwa 3-5 mm in der Breite sind abgeschnitten. </li><li> Ein Aortaring auf einer von einem Paar von tiUSGABE Haken, indem Sie den Haken und mit einer Pinzette vorsichtig schieben Sie den Ring auf Haken. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Haken. Achten Sie darauf, um die Haken zu gewährleisten nicht verheddern; siehe Abbildung 3. </li><li> Überprüfen Sie, dass jeder Haken hat eine andere Seidenfaden befestigt. Überprüfen Sie, ob ein Haken hat einen kleinen verknoteten Schleife aus Seide, die zur Befestigung an einer Glas- oder Edelstahlstange ermöglicht, während die andere ist eine 4.10 cm langes Stück Faden, der von Hand gebunden mit dem Kraftaufnehmer sein wird; siehe Abbildung 3. HINWEIS: Wenn die Aorta an den Haken befestigt ist, ist das Gewebe, bereit, in das Gewebebad angebracht zu werden; siehe Abbildung 3. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte von 2,14 bis 2,15, um eine zweite Aortenring im zweiten Gewebebad Kammer montieren. </li></ol> 3. Die Gewebe Platzierung in Bath <ol><li> Man beachte, dass in diesem System werden die Gewebebädern selbst stationär sind. Zu dieser Zeit füllen die Gewebebäder mit warmen, belüfteten PSS und lassen Sie die Lösung zu kommen, um Temperature. </li><li> Mit der Seidenfaden, binden eine der Haken an der Gewebepräparation mit dem Stift auf dem Edelstahlstange. Dieses Ende in das Gewebe Badkammer. Schließen Sie den Stab zu einem Ringständer und das andere Ende in der Färbung Gericht mit PSS gefüllt, um Gewebe in Puffer eingetaucht zu halten; siehe Abbildung 3. <ol><li> Setzen Sie den Stab und Gewebe im Gewebebad Kammer und stellen Sie sicher, das Gewebe ist vollständig in PSS eingetaucht und der Stab ist sicher; siehe Abbildung 3. </li><li> Binden Sie die andere Naht auf den Kraftaufnehmer und stellen Sie sicher, um ein Durchhängen in der Naht zwischen dem Gewebe und den Kraftaufnehmer zu verlassen. HINWEIS: Dieser Durchhang wird durch Anpassung des Mikrometer entfernt werden; siehe Abbildung 3. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. </li></ol> 4. Einstellen Passive Tension HINWEIS: Jedes Gewebe hat eine Länge (Lo), an der glatten Muskelzellen reagieren optimally. Vorversuche die optimale Streckziehspannung, welche erzielt diese Länge ist für jeden einzelnen Gewebetyp durchgeführt werden, zu prüfen, zu bestimmen. Die Brustaorta von Ratten hat eine optimale passive Dehnungsspannung von 4 g. <ol><li> Verwenden Sie die Mikrometer / Zahnstange und Ritzel, um die Spannung zu erhöhen, 2 g und warten auf das Gewebe zu Plateau zu erreichen. Sobald Plateau erreicht ist, erhöhen Spannung eine weitere 2 g und warten auf das Gewebe zur Stabilisierung. HINWEIS: In den Aortenringe, nachdem die Anfangsspannung von 2 g ist untergegangen und Plateau erreicht, sollte das Gewebe dann auf ~ 1,6 g entspannen. Eine zweite Anwendung von 2 g würde das Gewebe zu bringen ~ 3,6 g, aus dem das Gewebe wieder zu entspannen und die Spannung nimmt ab. Somit nach Zugabe von 4 g Gesamtspannung, sollte die Software angeben etwa 3,2 g Spannung. </li><li> Wiederholen Sie diese Schritte für die zweite Aortenring und Gewebebad Kammer. </li></ol> 5. Die Gleichgewichtseinstellung und Arzneimittelherstellung <ol><li> Äquilibrieren Sie die Gewebe für60 min nach dem Auftragen passive Spannung auf das Gewebe. </li><li> Während des Gleichgewichtsphase, waschen Sie die Gewebe alle 15-20 min. Lassen Sie das Gewebe Bad und ersetzen Sie die PSS mit PSS aus einem Reservoir erwärmt. HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Gewebe zu entspannen, die durch den Verlust der passive Spannung angedeutet ist. </li><li> Während dieser Zeit der Zubereitung von Drogen für den Versuch, die mindestens 1.000 mal konzentrierter als die tatsächliche Konzentration in dem Bad benötigen, so dass nur ein kleines Volumen des Medikaments Lager benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. </li></ol> 6. Erste Herausforderung <ol><li> Am Ende des Äquilibrierungsperiode, waschen das Gewebe ein letztes Mal, Daten speichern und wieder auf Null alle Eingänge. </li><li> Wählen Sie einen Agonisten (Verbindung, die aktive Kontraktion verursachen wird), auf die das Gewebe reagiert. HINWEIS: In der Brustaorta von Ratten, die arteriellen glatten Muskeln aktiv zu einer alpha-adrenergen Rezeptor-Agonisten Vertrag aufgrund der Innervation derGewebe durch das sympathische Nervensystem. Ein adrenergen Agonisten nicht sinnvoll in Darmgewebe sein da adrenergen Agonisten verursachen Entspannung. In diesem Fall könnte ein Rezeptor-Agonisten, wie Acetylcholin (cholinergen Rezeptor) verwendet werden. Eine Alternative zu beiden Phenylephrin und Acetylcholin ist, eine Nicht-Rezeptor-Agonisten, wie hohen Kalium (K) als den ersten Auftrag. In der glatten Muskulatur arbeitet hohen K indirekt offenen Kalziumkanäle und damit als ein allgemeiner Index der glatten Muskulatur Integrität angesehen. <ol><li> Führen Sie die erste Herausforderung oder den Wake-up Herausforderung durch Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad. Um diese Konzentration in 50 ml Gewebebad zu erreichen, fügen Sie 50 ul einer 10 -2 M Phenylephrin Lösung. HINWEIS: 50 ul in 50 ml PSS ist ein 1/1000-Verdünnung, so dass die Endkonzentration 1,000x weniger als Lager oder 10 -5 M. Die Kenntnis der Menge und konsistente Pflege des Volumens innerhalb Gewebebad chamber ist entscheidend für die Bestimmung der endgültigen Arzneistoffkonzentration. </li></ol></li><li> Zugabe von 10 -5 M Phenylephrin dem Gewebebad und erlauben die Kontraktion zu Spitze und dann Plateau, wenn die Steigung der Daten zu Null wird. Stellen Sie sicher, jeden experimentellen Ereignis post experimentelle Analyse helfen zu erfassen. </li><li> Nach dem Hochplateau, waschen Sie die Agonisten gründlich durch Entleeren und Auffüllen des Gewebebad Kammer mit neuen PSS. Stellen Sie sicher, diese Ereignisse als auch aufzuzeichnen. ANMERKUNG: Eine Faustregel ist, dass die Konzentration des Agonisten in der Wanne verringert 10fach mit jeder Wäsche. Obwohl, kann mehr als 3-4 Wäschen notwendig sein, um das Gewebe wieder auf sein Gleichgewicht Grundlinientonus (Zug) zu bringen. </li><li> Lassen Sie das Gewebe Rest zu Studienbeginn Ton für ~ 10 min, bevor Sie fortfahren. </li></ol> 7. Experiment HINWEIS: Prazosin, ein alpha-adrenergen Rezeptor-Antagonist, wird dem Gewebebad Kammer eingebracht, um die Konzentration bzw. verschiebenonse Kurve auf Phenylephrin (PE); dies ist eine nachweisbare Antagonismus. <ol><li> Einem Bad, fügen dem Fahrzeug (H 2 O) in dem Prazosin wurde aufgelöst. Zum anderen, fügen Sie die entsprechende Konzentration von Prazosin. In diesem Fall werden 25 ul Fahrzeug einem Bad und 25 ul von 10 -5 M Konzentration von Prazosin zu der anderen, um eine 5 x 10 -9 M oder 5 nM Konzentration in dem Bad zu erreichen. Anmerkung: Während der Zugabe des Fahrzeugs unnötig erscheint in diesem Beispiel, ist es zwingend, so zu tun, als mit anderen Fahrzeugen, die eine potentielle vasoaktiven zu sein (beispielsweise DMSO, Ethanol, Acetat) haben. Fügen Sie die entsprechenden Fahrzeugs, auch wenn wenig Beweise gibt es für vasoaktive sein. </li><li> Lassen Fahrzeug / Prazosin in den Bädern und nicht das Gewebe Waschen für 1 Stunde. <ol><li> Während Gewebe im Gleichgewicht, bereiten mehrere Konzentrationen von Agonisten (PE). Umfassen ein breites Spektrum von Konzentrationen von Konzentrationen entlocken keine Antwort (zB &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) zu Konzentrationen, die die maximale Reaktion (übertreffen zB 10 -4 M PE). Seit Konzentrations-Wirkungs-Kurven sind logarithmisch in der Natur, machen sechs separate Stammlösungen von PE (10 -6 bis 10 -1 M) über Verdünnungsreihen von der 10 -1 M-Stammlösung. Sicherstellen, dass die für jede Konzentration benötigte Volumen etwas größer als das Dreifache des Gesamtvolumens für alle Bäder (dh&gt; 300 ul) benötigt. </li></ol></li><li> Mit Hinzufügen Agonisten, wie in Tabelle 1 beschrieben. HINWEIS: Dieses Experiment wird eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf PE zu generieren; jede Iteration berücksichtigt die Menge der Substanz bereits an dem Bad zugesetzt. Zugänge auftreten, bis sie Kontraktion nicht mehr zu erhöhen, oder die gesamte Kurve ein Plateau erreicht hat. <ol><li> Fügen Sie jede Wirkstoffkonzentration einzeln, bis das Gewebe Schwelle erreicht ist. </li><li> Wenn keine Änderung auftritt, fügen Sie den nächsten Konzentration in derSerie; siehe Tabelle 2. Anmerkung: Der Zeitpunkt dieser Zusätze hängt von der Agonist verwendet. Zum Beispiel, Noradrenalin und Phenylephrin Kontraktion entwickelt sich schnell, und sollte innerhalb weniger Minuten ein Plateau. Im Gegensatz dazu entwickelt Endothelin-1 Kontraktion langsam und nicht für fast 45 Minuten ein Plateau. Andere Experimente können auf dem Gewebe nach dem Aufbau einer Kurve, wie dies getan werden kann, solange wie (1) die Substanz auswäscht; und (2) gezeigt werden kann, dass das Gewebe wieder in den normalen Kontraktionsverhalten und wird nicht durch den vorhergehenden Stimulationen beeinflusst. </li></ol></li></ol> 8. Datenanalyse <ol><li> Achten Sie darauf, die Daten unmittelbar vor und nach einem Eingriff zu sparen (zB aufwachen oder Voll Kurve). </li><li> Suche und den Gewebegrundlinie für jedes Gewebe Badkammer / Eingangskanal, der in der Datenanalyse helfen werden. </li><li> Sobald die Grundlinie gesetzt wird, suchen Sie die maximale Reaktion für jede Konzentration, und notieren Sie die change von der Grundlinie. Nacheinander durch jede der Konzentrationen bewegen und notieren Sie die Grundlinienverschiebung. </li><li> Graph der resultierenden Daten. Tun Sie dies in jedem Grafik-Programm. HINWEIS: Graph Pad Prism für Pharmakologen gestaltet, und dies ist für die Art des Experiments hier vorgestellt. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

Die Messung der isometrischen Kraft als Forschungswerkzeug ist über 150 Jahre alt, aber es die prototypische Technik zur Charakterisierung Rezeptor in kontraktilen Gewebe 2 ist weiterhin. Die Leistungsfähigkeit dieser Technik besteht in ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit: durch Aufzeichnen Antworten durch zunehmende Konzentrationen eines Agonisten in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Antagonisten hervorgerufen, kann eine Vielzahl von Informationen über die pharmakologischen Eigenschaften eines jeden Medikaments Rezeptors abgeleitet werden, die bindet es 3-5. Experimente dieser Art sammeln auch Informationen über die Wettbewerbs versus nicht wettbewerbsfähig Natur der verwendeten Antagonisten sowie Rezeptorheterogenität und unspezifische Medikamentenwirkungen 6-8. Somit kann mit einfachen Permutationen dieser isolierten Gewebebad Experiment kann eine relativ vollständige pharmakologische Profil der Rezeptoren, Agonisten induzierten Muskelkontraktion Vermittlung erzeugt werden. In Bezug auf Agonismus, the relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten eines bestimmten Gewebes kann berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion inkubiert. 2 stellt modifizierte Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten wurden mit der maximalen Kontraktion durch PE erreicht markiert als max markiert, die als solche gekennzeichnet ½ maximale Kontraktion und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EC50-Wert erreicht. Leider hat die Verwendung Agonist abhängiger Parameters nur um festzustellen, Rezeptorbindungseigenschaften kann kompliziert sein 9. Idealerweise zusätzliche Experimente unter Verwendung von Rezeptor-Antagonisten erlauben die Berechnung von zwei wichtige Parameter, die Schlüssel zu definieren, die Wechselwirkung zwischen einem Wirkstoff und einem Rezeptor sind: -log 10 des Antagonisten Dissoziationskonstante (pK B) und der 10 -log des molaren Antagonist Konzentration notwendig, zwei-fache Rechtsverschiebung in der Konzentrations-Wirkungs-Kurve (pA 2) 10 auslösen. Sowohl K B und 2 pA Verstärkungs ihre Nützlichkeit aus der Tatsache, daß sie Agonisten-unabhängigen Werten, und konstant, selbst zwischen verschiedenen Geweben 11. Aus den Daten in Abbildung 2 kann pK B unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden, und basierend auf EC 50 -Werte anderswo berechnet: EC 50 in Abwesenheit von Prazosin = 2 x 10 -8 M EC 50 in der PreSinn von Prazosin = 7 x 10 -6 M Lösen für K B in der folgenden Gleichung: log (dr-1) = log [B] - log K B Wo: [B] = Antagonistenkonzentration, oder 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3 dr = Dosisverhältnis von EC50-Wert in Gegenwart von Antagonisten / EG 50 in Abwesenheit. Wenn es eine Verschiebung nach rechts, so wird dieser Wert größer als eins sein. Somit: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M oder 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Setzt man für [B] und dr: log (350-1) = -8 - log K B 2,54 = -8 - log KB pK B = 10,54 Dieser Wert für Prazosin ist konsistent mit den erhaltenen Werten, wenn Prazosin wirkt mit einem α 1 -adrenergen receptbzw. 12,13, was darauf hindeutet, daß der adrenerge Rezeptor vermitteln Kontraktion auf Phenylephrin ist das α 1 -adrenergen Rezeptor. Mehrere Schritte sind kritisch für den Erfolg dieser Versuche. Gewebe muss in PSS nach der Sektion bleiben, um den Verlust der Lebensfähigkeit des Gewebes zu verhindern. Jede isometrische Muskelvorbereitung hat eine optimale Länge Spannungsbeziehung, die maximale Kraft vor dem Passiv Spannung 14,15 erzeugt. Für die in diesem Protokoll beschriebenen Experiment wurde eine optimale passive Spannung zuvor kurz Zugabe Schritten von 0,5 g passiver Spannung auf das Gewebe bestimmt. Das Gewebe sollte ohne Ton beginnen und dann nach 30 min Äquilibrierungspuffer wurde das Gewebe mit einer maximalen Konzentration von KCl (80 mM), die aktive Ton erzeugt in Frage gestellt. Dann wurde das Gewebe gewaschen und bis zur Grundlinientonus zurückzukehren. Nach 15 Minuten zu Beginn der Studie wurde eine weitere 0,5 g passive Spannung gesetzt und dieser Prozess wiederholt, bis ein Plateau vonaktive Spannung wurde mit zusätzlichen passiven Spannung erreicht. In Vorversuchen wurden 4 g insgesamt passive Spannung bestimmt, um eine maximale aktive Spannung Generation in Aortenringen erreichen, und somit diese Summe der Spannungen an die Ringe vor der Äquilibrierung gegeben. Verfahrenstechnisch ist es am besten vor passive Spannung Anwendung auf Null, sondern kann jederzeit vor dem Versuch erfolgen. Überdehnung Gewebe an jedem Punkt in dem Experiment oder Dissektion wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit des Gewebes und experimentellen Ergebnissen. Dies ist besonders dann wichtig, wenn Anordnen Gewebe in der Wanne, wie dieser Schritt hat die höchste Wahrscheinlichkeit übermäßige Dehnung. Ausreichendes Waschen, in Anzahl und Dauer ist für reproduzierbare Effekte erforderlich. Eine zweite Herausforderung zu früh nach einer ersten Herausforderung, vor oder Gewebe wurden zum Ausgangsspannung zurückgesendet werden, in abweichenden Reaktionen führen. Wenn Studium reversible Antagonisten / Inhibitoren sollten Gewebe nicht vor gewaschen, um zusätzlich Agonist, als inhibitor Konzentration verringert. Es gibt bemerkenswerte Vorteile und Nachteile für den isolierten Gewebebad Assays. Nachteile: Die Gewebe können unterschiedliche Grade der Beschädigung während der chirurgischen Entfernung oder der Platzierung der Ringe an den Haken zu erfahren. Da die Endothelzellen der inneren Auskleidung des Aortenrings muss darauf von der Platzierung des Rings an Haken ergriffen, um nicht diese Zellschicht zu beschädigen. Gewebe können auch deutlich unterschiedliche Zeitdauern, in denen sie lebensfähig Gewebebad sind, und dies hat zu ermitteln; nicht alle Gewebe gleich sind. In diesem Sinne kann Gewebe in ihrer Reaktionsfähigkeit im Laufe des Tages ändern, so dass Zeitkontrollen zu einem notwendigen Steuer für jedes Experiment. Ein gutes Beispiel dafür ist die Meerschweinchentrachea, die Kontraktilität maximal um 100% während einer typischen 8 h Experiment verbessert. Medikamente, die in Wasser schlecht löslich sind, kann in dem PSS auszufällen. Schließlich kumulative einnd nicht kumulative Zugaben von einem Medikament, das ein Agonist könnte zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, wenn Rezeptordesensibilisierung auf den Agonisten auftritt; Angiotensin-II ist ein solches Medikament, das schnelle Tachyphylaxie zeigt. Vorteile: Einer der Hauptvorteile der Gewebebad-Experimente ist, dass es in Echtzeit; kann man den Versuch sehen, wie es sich entwickelt und kann schnell machen Schlussfolgerungen und nächste Schritte zu planen, sowie Fehlerbehebung während eines Experiments. Ein Experiment dauert einen Tag, um zu tun. Multiple Gewebe kann typischerweise von einem Tier hergestellt werden, so dass ein Tier als seine eigene Kontrolle dienen, und das erhöht die Festigkeit eines Experiments. Man kann auch das Gewebe von anderen Faktoren zu isolieren, so daß eine relativ reine Reaktion des Gewebes auf das Medikament zu testen. In vitro Experimente wie Gewebebad System ermöglichen auch die Verwendung einer kleinen Menge an Arzneimittel im Vergleich zu einem in vivo-Versuch. Die hier beschriebene grundlegende experimentelle Design sein kannextensiv modifiziert, um die Aufnahme von zusätzlichen Parametern oder die Einführung von anderen externen Stimuli ermöglichen. Zum Beispiel Zugabe von Elektroden ermöglichen elektrisches Feld Stimulation der Nerven innervieren 16,17. Mit dem Zusatz von thermischer oder pH-Sonden können die Effekte von Temperatur und pH auf die kontraktilen Reaktionen gemessen 18,19 werden. Auf ähnliche Weise können Sauerstoff ganz oder teilweise mit N 2 auf Hypoxie induzierte Effekte zu bewerten ersetzt werden. Darüber hinaus können die gleichen Grundprinzipien der isometrischen Kontraktionsmessung in diesem Video verwendet, um Systeme, die die gleichzeitige Messung der isometrischen Spannung Entwicklung und Veränderungen der intrazellulären Calcium 20 gestatten zu entwickeln. Signaltransduktion wird auch leicht untersucht, da Systeme existieren, die eine Gewebeprobe während einer Reaktion schnell zu gefrieren, so dass die Aktivität eines Signaltransduktionsweges System kann biochemisch verifiziert werden. Die Variation equipment die verwendet werden können, dies zu tun, ist enorm. Das ganze System, entweder von Hand gebaut oder automatisiert, können aus mehreren verschiedenen Unternehmen erworben werden. Die Gewebebäder und Gewebe-Halter im Sinne dieses Protokolls sind mundgeblasen (Gewebebäder) und von Hand gebaut (Inhaber) durch eine in-house Michigan State University Werkstätten.

Die Disziplin der Pharmakologie ist die isolierte Gewebebad System seit über 150 Jahren verwendet. Die Vielseitigkeit dieses Systems hat Wissenschaftler erlaubt in der ganzen Welt, um Rezeptoren und Rezeptor-Signaltransduktion zu charakterisieren, mit dieser Erkenntnis, die die Grundlage von Therapien, die Millionen von Menschen mit Erkrankungen oder Störungen, wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Diabetes, gastrointestinalen Erkrankungen, Blasen behandelt wurden Dysfunktion, Asthma und Schluckstörungen, um nur einige zu nennen. Bis heute bleibt das isolierte Gewebebad eine wichtige Facette der Arzneimittelentwicklung und Grundlagenforschung, da es dem Gewebe als Gewebe funktionieren. In diesem JoVE Lektion wird ein formales Protokoll gemeinsam genutzt, um eine visuelle und virtuelle Experiment unter Verwendung der Daten aus einer isolierten Gewebebad Experiment, das isometrische Kontraktion misst, die Rezeptorcharakterisierung ermöglicht demonstrieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass das Gewebe eine lebendend als Ganzes funktioniert Gewebes mit einer physiologischen Ergebnis (Kontraktion oder Relaxation), die für den Körper ist. Es ist eine Synthese von Schritten (drug-Rezeptor-Wechselwirkung, Signaltransduktion, second messenger Erzeugung, Änderung in der glatten Muskulatur Erregbarkeit und Veränderung der Gewebefunktion). Während andere Techniken ermöglichen Studium jedem dieser Schritte (zB Radioligand für die Arzneimittelaffinität, die Messung der zweiten Boten-Bindung), ermöglicht die Integration aller dieser Schritte 1 das isolierte Gewebebad Technik. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Beibehaltung der Gewebefunktion ermöglicht die Berechnung der wichtigsten pharmakologischen Variablen, die in einem Gewebe gegen ein Mobil Einstellung mehr sinnvoll sind; es näher kommt, wie die untersuchten Medikamente würden im Körper als Ganzes zu arbeiten.

<table><tbody><tr><td>LabChart Software</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>7.2</td></tr><tr><td>PowerLab (4 channel)&amp;nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>ML760</td><td></td></tr><tr><td>QuadBridge (4 channel)</td><td>ADInstruments</td><td>ML112</td><td>ML112</td></tr><tr><td>Grass Adapter Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC11</td><td>MLAC11</td></tr><tr><td>Grass Force-displacement Transducer</td><td>Grass Instrument Co</td><td>FT03</td><td>FT03</td></tr><tr><td>Grass Transducer Cable</td><td>Grass Instrument Co</td><td>TAC-7 REV-1</td><td></td></tr><tr><td>BNC to BNC Cable</td><td>ADInstruments</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 2100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>IC-2100</td></tr><tr><td>Tissue Bath</td><td>Multiple Sources&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Physiological Salt Solution</td><td></td><td></td><td>PSS</td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7615</td><td>SP104</td></tr><tr><td>Ring Stand</td><td>Humboldt MFG Co</td><td>H-2122 7</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Dishes</td><td>Handmade with Silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR Scientific</td><td>63010-100</td><td>R-3603</td></tr><tr><td>Hose Clamps</td><td>Cole-Parmer Instrument Co</td><td>06832-08</td><td>SNP-8</td></tr><tr><td>50 ml Muscle Bath</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Warming Chambers</td><td>Eberhartglass Blowing</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Gas Dispersion Tube</td><td>Ace Glass</td><td>7202-06</td><td>7202-02</td></tr><tr><td>Micrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Custom Stands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Three-prong Clamps</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>S-connector</td><td>VWR International</td><td></td><td>Talon</td></tr><tr><td>Tissue Hooks</td><td>Hand Made in House</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Dissection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Stereomicroscope MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td>10447254</td></tr><tr><td>Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12562-36</td><td>12562-36</td></tr><tr><td>Culture Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td>7740 Glass</td></tr><tr><td>Sylgard Silicone Elastomer</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 170 Kit</td></tr><tr><td>Vannas Scissors</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-150</td><td>160-150</td></tr><tr><td>Splinter &amp;amp; Fixation Forceps</td><td>George Tiemann &amp;amp; Co</td><td>160-55</td><td>160-55</td></tr></tbody></table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

In Bezug auf Agonismus, kann die relative Wirksamkeit (E max) und Wirksamkeit (EC 50) eines Agonisten in einem gegebenen Gewebe berechnet und verglichen, um Antworten von anderen Agonisten in demselben Gewebe 1 wird. In unserem Versuch wurde die Brustaorta von Ratten entweder Vehikel oder die α 1 -adrenergen Rezeptor-Antagonist Prazosin (5 nM) für eine Stunde vor der Zugabe der α 1 -adrenerge Agonist Phenylephrin dem Gewebebad und Erzeugen Kontraktion (Abbildung 1) inkubiert. Abbildung 2 präsentiert geändert Ergebnisse von 1. Die grünen Antworten markiert die maximale Kontraktion durch PE erreicht markiert max, der ½ maximalen Kontraktion als solche markiert und dann mit dem PE-Konzentration verbunden, dass die Reaktion verursacht. Die Identifizierung dieser Werte ist Identifizierung der wirksamen Konzentration eines Agonisten, die eine Hälfte max (50%) Antwort oder EG erreicht <sub&gt; 50 Wert. Das war in diesem donegraphically example.Computer Software, die zur Kurvenanpassung und die Berechnung der EC 50 -Werte können logistische Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet werden, verwendet. Bei der Erzeugung und Interpretation dieser Ergebnisse ist es wichtig, sowohl niedrige als auch hohe Konzentrationen von Agonisten zu verwenden, um die Konzentration-Antwort-Kurve zu erstellen. Ohne genug Punkte, um eine stabile Basislinie und die maximale Hochebene zeigen, kann EC 50 und E MAX nur geschätzt werden. Dies wurde graphisch in diesem Beispiel gemacht. Computersoftware, die logistischen Funktionen für sigmoidale Kurven verwendet, kann für die Kurvenanpassung und Berechnung von EC 50 Werte verwendet werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Schematische Bad Tissue-Karikatur, die einen Ring von Gewebe in der doppelwandigen platziert, mit Wassermantel Gewebe bath. Puffer und Abfluss werden durch eine 3-Wege-Glashahn in die Basis der Kammer integriert geregelt. O 2 / CO 2 wird über einen Belüfter, der mit einer Dichtung des Lecks der PSS oder Gas zu verhindern abgedichtet eingeblasen wird. Umluft Eingang unter dem Ausgabe, um eine ordnungsgemäße Rückführung zu erhalten und die Bildung von Luftblasen, die Temperatur disregulation führen würde, zu verhindern. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Abb. 2: Brustaorta von Ratten + Endothel Die Abbildung zeigt vier getrennte Experimente (verschiedene Tiere und von verschiedenen Forschern auf verschiedenen Setups, wie durch unterschiedliche Farben dargestellt getan), die Fähigkeit von Prazosin, um eine PE-induzierten Kontraktion verschieben testen. Prazosin (5 nM) deutlich verschoben PE-induzierte Kontraktionskurve nach rechts in einer parallelen Weise. Abbildung 3: Brustaorta von Ratten + Endothelium Graphical Schätzung der EC 50 Werte für PE in Abwesenheit (Fahrzeug) und Anwesenheit (Prazosin) des Antagonisten.. Grüne Linie (Gruppe C) nur markiert. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Salz </td><td> MW (g / mol) </td><td> 5 Liter </td><td> FINAL mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (Gramm) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,45 </td><td> 37,99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 1,75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7H20 </td><td> 246,5 </td><td> 1,45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,21 </td><td> 6.25 </td><td> 14,9 </td></tr><tr><td> Traubenzucker </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0,05 </td><td> 0,03 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: normale physiologische Salzlösung (PSS) Rezept Inhalt des bikarbonatgestützte PSS in diesem Experiment verwendet.. Eingeschlossen sind die Molekulargewichte aller Salze und die Menge an 5 l dH 2 O zugegeben, um die gewünschte Konzentration zu erzielen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Die Konzentration im Bad </td><td> Die Zugabe von Agonist zu Bad gemacht </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Tissue Badezusatz Agonist-Konzentrationen Die Menge des Agonisten zu jedem Bad zu Pro hinzugefügt werdenperly konstruieren kumulative Konzentrations-Antwort-Kurven. Die gewünschte Badkonzentration durch Zugabe von sequentiellen Mengen von steigenden Konzentrationen des Agonisten erreicht wird. Jedes hinaus berücksichtigt die Konzentration des Agonisten bereits im Bad vorhanden. Dies wird durchgeführt, um die Zunahme des Volumens im Gewebebad, das von unter Verwendung steigender Mengen von einer einzigen Konzentration des Agonisten führen würde minimieren.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

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Unit 1

Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

137.8K Aufrufe.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Serie: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

A. mesenterica Kontraktion und Entspannung Studies Verwendung automatisierter Draht Myographie

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Forschung

Medizin

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Glatten Muskulatur der Blase Streifen Kontraktilität als eine Methode zur unteren Harnwege Pharmakologie Bewerten

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

Kontraktilität Messungen der menschlichen Gebärmutter glatten Muskulatur um Hilfe Medikamentenentwicklung

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Biologie

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Beurteilung Murine Widerstand Artery Funktion Mit Druck Myographie

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The contractile characteristics can be evaluated independently of external influences such as vascular tonus or neurohumoral status. It depicts a scientific approach between single cell measurements with isolated cardiac myocytes and in vivo studies like echocardiography. Thus, papillary muscle preparations serve as an excellent model to study cardiac physiology/pathophysiology and can be used for investigations like the modulation by pharmacological agents or the exploration of transgenic animal models. Here, we describe a method of isolating the murine left anterior papillary muscle to investigate cardiac contractility in an organ bath setup. In contrast to a muscle strip preparation isolated from the ventricular wall, the papillary muscle can be prepared in toto without damaging the muscle tissue severely. The organ bath setup consists of several temperature-controlled, gassed and electrode-equipped organ bath chambers. The isolated papillary muscle is fixed in the organ bath chamber and electrically stimulated. The evoked twitch force is recorded using a pressure transducer and parameters such as twitch force amplitude and twitch kinetics are analyzed. Different experimental protocols can be performed to investigate the calcium- and frequency-dependent contractility as well as dose-response curves of contractile agents such as catecholamines or other pharmaceuticals. Additionally, pathologic conditions like acute ischemia can be simulated.

Murine left ventricular papillary muscle can be used to investigate cardiac contractility in vitro. This article describes in detail the isolation and experimental protocols to study cardiac contractile characteristics.

Kontraktilität Messungen auf isolierte Papillarmuskeln für die Untersuchung von Herz Inotropie bei Mäusen

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Bewertung der Reaktion der Gefäß-Tone mit isolierten mesenterischen Arterien mit einem Schwerpunkt auf der Modulation durch Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll zur Untersuchung der gastrointestinalen Dynamik und der Auswirkungen von Arzneimitteln auf die Motilität

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Zuverlässige und reproduzierbare In-vitro-Bewertung der Auswirkungen von Medikamenten auf Darmröhrchen von Ratten

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.