Name: isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

Die Autoren danken Ryan Chaplin und Dr. Gregg Rentfrow von der University of Kentucky und Fleisch Lab Abteilung Tier und Lebensmittelwissenschaften für die Bereitstellung von Möglichkeiten zur experimentellen hier verwendeten Gewebe zu sammeln.

Verfahren in dieser Studie verwendeten nicht bedürfen der Zustimmung der Universität von Kentucky Animal Care und Use Committee, weil keine lebenden Tiere verwendet wurden. Vor der Entnahme einer Probe hier verwendet wird, wurden alle Tiere mit einem Bolzenschuss betäubt und ausgeblutet. Dies wurde auf einer staatlich untersuchten Schlachthaus-Anlage an der Universität von Kentucky durchgeführt. Ein offizieller Vertreter der USDA Nahrungsmittelsicherheit und Kontrolle Service beobachtet alle Aktivitäten, die mit dem lebenden Tier und die Handhabung des Schlachtkörpers behandelt. 1. Vorbereitung der Besetzung <ol><li> Um die Menge der Zeit zwischen Sammlungen von Gewebeproben zu Beginn eines Experiments, einzurichten Geräte zu minimieren und vor vorzubereiten Puffer zu sammeln experimentellen Gewebe (oder, wenn zusätzliches Personal zur Verfügung stehen, können diese Aufgaben gleichzeitig auftreten). HINWEIS: Dieser bietet nicht nur die größte Menge an Zeit, die das Gewebe lebensfähig bleibt, Experimente durchzuführen, aber einigeExperimente können für lange Zeitperioden ausgeführt werden (oder es besteht der Wunsch, mehrere Experimente in einem Tag vollständig), daher ist es gewöhnlich wünschenswert, so früh wie möglich zu beginnen. </li><li> Schalten Sie den Computer verbunden, Datenübernahmen Ausrüstung, Wasser-Bad (für Puffer (s)) und Myographions Einheit (en). Legen Sie die Kalibrierungsgeräte auf der Myographions Einheit (en), und schalten Sie Myographions Wärme (voreingestellt auf 37,5 ° C) und lassen Einheiten und Kalibrierungsausrüstung erwärmen Temperaturen eingestellt. <ol><li> Öffnen Sie ein zuvor erstelltes Diagramm Software-Einstellungen-Datei auf dem Computer ein und starten einen Lauf (aber nicht der Datenerfassung). </li></ol></li><li> Aufwärmen der Ausrüstung für 10 min. <ol><li> Datenerfassung beginnen. </li><li> Null alle Kanäle. </li><li> Zu überprüfen, und führen die Kalibrierung (falls erforderlich) auf jedem Kanal (4 Kanäle pro multimyograph), um die von der jeweiligen Kraftaufnehmer mit diesem Kanal zu einem Gewicht von einem zertifizierten geliefert 2-g-Kraft verbunden gelieferte elektrische Signal zu standardisieren. </li><li> Nach Kalibrierung und ein Einheiten Umwandlung abgeschlossen sind, speichern Sie alle nachfolgenden Daten als Gramm. Entsprechend ändern, basierend auf Wünsche jedes einzelnen Labor; Ausrüstung und Software ermöglichen die Verwendung von anderen Einheiten, wie Millinewton und Volt. </li></ol></li><li> Stellen Sie sicher, dass die Gasleitungen sind frei von Blockaden und schalten Sie Gasversorgung (95% O 2/5% CO 2) bis (e) Einheiten Myographions. Gas kontinuierlich alle Puffer (in den Kammern Myographions) während des gesamten Verfahrens. </li><li> Füllen Sie alle Myographions Kammern mit 70% Ethanol und genießen für 10 min, Ethanol entfernen, und wiederholen Sie für eine zweite 10 Minuten einweichen. <ol><li> Nach Entfernen des Ethanols gründlich dreimal mit entionisiertem Wasser, gefolgt von drei Spülungen mit vorbereiteten Puffer (siehe Abschnitt 2 zur Herstellung Puffer), so dass die dritte Zugabe von Puffer in den Kammern. HINWEIS: An dieser Stelle kann das Gerät im Leerlauf in diesem Zustand, bis Puffer und Gewebe hergestellt und Personal steht bereit, um mit den experimen gehent. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung von Puffern <ol><li> Eine 1 l Krebs-Henseleit-Pufferlösung zur Verwendung bei Transport und Verarbeitung von Gewebeproben, um Endkonzentrationen von 11,1 mM D-Glucose zu erreichen; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM KH 2 PO 4; 4,7 mM KCl; 118.1 mM NaCl; 3,4 mM CaCl 2; 24,9 mM NaHCO 3. <ol><li> Mischen 9,6 g Krebs Salze in etwa 900 ml VE-Wasser auf einer Rührplatte. </li><li> Mischen in 0.373 g Calciumchlorid-Dihydrat, gefolgt von 2,1 g Natriumhydrogencarbonat pro Liter Puffer gewünscht. </li><li> Gaspufferlösung für 20 Minuten mit 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Nach Begasung, pH-Wert auf 7,05 (Filtration von Puffer erhöht pH-Wert; endgültige Ziel pH-Wert sollte 7,4 sein), und stellen Sie die Lautstärke auf 1 L </li><li> Filter sterilisieren Puffer in einem sauberen autoklaviert 1 L Flasche und Medienspeicherpuffer bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Bereiten separaten Krebs-HEnseleit Pufferlösung zur Verwendung in Myographions Experimente wie in Schritt 2.1 zum Transport Krebs-Henseleit-Puffer mit zusätzlichen Verbindungen, die an die Kontraktilität Experimente betreffen beschrieben. HINWEIS: In der Regel 2 L wird für die in diesem Artikel beschriebenen Versuche genügen, aber dieses Volumen muss möglicherweise erhöht oder bezogen auf die Länge des Experiments reduziert werden, die Anzahl der Myographions Kammern und die Anzahl Puffer Ersatz (bezogen auf die Behandlung Ergänzungen). <ol><li> Vor der Vergasung (Schritt 2.1.3), fügen Sie 9,1 mg (pro l Puffer in Vorbereitung) von Desipramin-HCl zu puffern. </li><li> Bereiten Sie eine 1,0 uM Lösung von Propranolol-HCl und 1 ml (pro Liter Puffer in Vorbereitung) dieser Lösung in der Krebs-Henseleit-Pufferlösung. Machen Sie diesen Puffer auf dem Tag der Nutzung bringen und Myographions Betriebstemperaturen (eine Temperatur, die mit 37,5 ° C Temperatur im Myographions ergibt). HINWEIS: Die Desipramin wird hinzugefügt, um die Wiederaufnahme-Mechanismen biogenes Amin hemmenund lassen Clearing von experimentellen Zugänge aus dem Puffer Baden der Blutgefäße schneller auftreten. Die Zugabe von Propranolol verhindert die unspezifische Bindung von Behandlungs Verbindungen an Rezeptoren-adrenergen β. </li></ol></li></ol> 3. Sammlung und Herstellung von Gefäßsystem <ol><li> So bald wie möglich, entfernen Sie den Magen-Darm-Trakt von der Karkasse. Sobald das Tier nicht mehr weist jede unfreiwillige Reflex, entfernen Sie den Kopf und verstecken und heben Sie dann den Korpus vertikal. Entfernung des Magen-Darm-Eingeweide (Speiseröhre bis zum Anus) von den Schlachtkörper von zugelassenen Schlachthof Personal (&lt;20 min von der Zeit des Betäubung) durchgeführt werden. HINWEIS: Wie schnell, wird in der Regel durch die Lage / Einrichtung, in der Darmtrakt ist gegen und Standardarbeitsanweisungen oder Bund beauftragt Verfahren, gefolgt von den Anlagenpersonal gesammelt beschränkt. <ol><li> In den meisten Einrichtungen, führen Manipulationen des Magen-Darm-Traktan einem separaten Ort von der Verarbeitung des Tierkörpers, die bestimmt ist, die Nahrungsmittelversorgung ein. Verwenden Sie eine günstige Lage in der Nähe, wo der Magen-Darm-Trakt aufgenommen und kann zur Prüfung verteilt werden. </li></ol></li><li> Sobald der Magen-Darm-Trakt ist ausgebreitet, identifizieren den Dünndarm, die ileozökalen fach Anschluss des Dünndarms zu Blinddarm und die Ileum-Flansch, der sich proximal der Bauhin fache (Abbildung 1A). <ol><li> Mit einem Skalpell oder Messer, sehr leicht einen Einschnitt in der mesenterialen Membran in der Mitte des Ileum-Flansch. Mit beiden Zeigefinger, unverblümt sezieren entfernt die Freilegung der mesenterialen Gefäßsystem (Abbildung 1B) Fett und Bindegewebe. </li></ol></li><li> Von diesem Flansch oder Ausbuchtung in der Darm Gekröse, sezieren mehrere Zweige (~ 2 cm in der Länge) der exponierten A. und V. mesenterica Bündel, die diesen Teil des Ileum (1C) zu unterstützen. <ol><li> Wenn usingen Pinzette, um Gewebe zu erfassen, achten Sie darauf, nicht direkt erfassen oder ziehen auf die Blutgefäße überhaupt beim Entfernen sie wie jede Art von Strecken kann beschädigt werden und negativ beeinflussen Gewebe Leistungs 14. Blutgefäß Entfernung geschieht am besten, indem über jedem Ende des Abschnitts zu entfernen und dann Schneiden neben oder parallel zu der jetzt isoliert Abschnitt. Für eine einfache, entfernen Sie einige der umliegenden Gewebe zusammen mit Gefäßen etwas Gewebe mit einer Pinzette fassen zu schaffen. </li><li> Mit einer Pinzette, tauchen Gewebeprobe in einem Röhrchen mit eiskaltem Krebs-Henseleit-Puffer und Lagerung auf Eis, bis die Verarbeitung kann im Labor erfolgen. </li></ol></li><li> Platzieren Gewebeprobe auf einer Schneidfläche oder in eine Petrischale und teilweise in eiskaltem Krebs-Henseleit einzutauchen. <ol><li> Mit # 5 Juweliere Zangen, Noyes Iris Schere, und Lupenleuchte oder Binokular (2,5 bis 5,0-fache Vergrößerung ist ausreichend), sorgfältig sezieren entfernt die umgebende Fett und connective Gewebe und trennen die Arterie und Vene. Identifizieren des Gefäßöffnung an einem Ende des Abschnitts und sorgfältig erfassen die Blende um den Behälter mit der Zange. </li><li> Machen Sie einen Schnitt mit der Schere auf das Schiff parallel, indem die Spitze der Schere unter der Faszie angehoben. Nach dem anfänglichen Schnitt, das Fett und Bindegewebe kann weiterhin aus dem Gefäß durch eine Senkung auf beiden Seiten mit einer Schere getrennt werden. Sicherzustellen, dass die Behälter auch so rein wie möglich bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Zeit, die Behälter zu verbringen auf der Bank. </li><li> Blutgefäße zurück, um Rohre von frischen Krebs-Henseleit-Puffer und bei 4 ° C (Proben können für bis zu 24 Stunden nach der Sammlung gespeichert bleiben und immer noch gültig Kontraktilität Daten zu erzeugen). </li><li> Mit einer Rasierklinge, um die Schichtbehälter in Myographions in die gewünschte Anzahl der 2-mm-Abschnitte verwendet werden (es ist hilfreich, um eine Gewebeschneidemaschine verwenden, um konsistente Querschnitte zu erhalten). </li><li> Untersuchen Sie jeden Abschnitt unter einem Präparations scope (12,5-fach Vergrößerung), um sicherzustellen, dass jeder Abschnitt hat keine Auffälligkeiten, Äste, Ventile, oder oberflächliche Schäden versehentlich bei der Präparation und Reinigung getan. Ersetzen Sie die Gefäßabschnitt, wenn es irgendeine Anomalie, Zweig, Ventil oder oberflächliche Schäden. </li></ol></li><li> Shop akzeptabel geschnitten Gefäßabschnitte (in Krebs-Henseleit-Puffer eingetaucht) auf Eis oder bei 4 ° C bis bereit für die Montage in Myographions Kammern (meist &lt;30 min). </li><li> Montieren Sie vorsichtig das Schiff auf der Myographions, indem Sie die Stützen durch das Lumen und erhöhen die Spannung (unter Verwendung der auf der Mikropositionierer Myographions) vorsichtig, um die Gefäße über eine 2 bis 3 g Lesung nicht strecken. </li><li> Nachdem alle Kammern abgedeckt sind, saugen den Puffer aus allen Kammern und füllen mit 5,0 ml Puffer und starten Sie eine 15-min-Timer, um die Gleichgewichtsperiode und das Experiment zu beginnen. </li></ol> 4. Experiment <ol><li> Ins Gleichgewicht alle Gefäßabschnitte 1,5 h, um eine stabile res zu erreichenting Spannung von 1,0 g. <ol><li> Ersetzen Sie den Krebs-Henseleit Inkubationspuffer alle 15 min. </li><li> Während der Gleichgewichtseinstellung, ständig die Spannung auf die Blutgefäßabschnitte anpassen bis zu 2 g und lassen Sie sich zu entspannen auf ca. 0,80 g. Versuchen Sie nicht, damit Schiffe zu viel um sich zu entspannen (sie können die Halterungen rutschen). Versuchen Sie, eine stetige Ausgangsspannung, wenn das Schiff hält 1 g Spannung ohne Anpassung erfordern erreichen. </li></ol></li><li> Während der Gleichgewichtseinstellung, bereiten eine wässrige 1,32 M KCl-Lösung als Referenz verwendet werden. </li><li> Nach der Beendigung eines zufriedenstellenden Gleichgewichts, 500 ul des 1,32 M KCl-Lösung in einer 0,12 M Lösung in 5,5 ml Lösung Baden des Gefäßes führen. <ol><li> Nach der Zugabe der 1,32 M KCl, nicht die Spannung manuell einstellen als die maximale Reaktion, die auf dieser Addition wird verwendet, um die Gewebelebensfähigkeit zu bewerten und um eine A verwendet, um Behandlungsdaten normalisiert werden (zB Konzentration Antwortengonist). </li><li> Ersetzen Sie den Puffer in 15-Minuten-Intervallen, bis Spannung wurde auf die Baseline-Wert von 1,0 g zurück. </li></ol></li><li> Sobald Baseline erreicht wird, ändern Sie den Puffer und gleichzeitig beginnt eine 1 min-Timer. Tun Sie dies für alle Kammern gleichzeitig eine Staffelung der Startzeiten zu vermeiden. <ol><li> Mischen Sie den Standard aufgenommen werden und bereiten einen Kommentar für Kammer 1 während der 1 min Countdown. </li><li> Hinzufügen der Standards in 25 ul Aliquots jeder Kammer als Experiment Diktat (somit die Behandlung unter 0,5% des Gesamtvolumens). </li><li> Wenn der letzte Standard hinzugefügt wurde, starten Sie eine 9 min-Timer. </li><li> Am Ende der 9 min Inkubation Standard, entfernen Sie die Behandlung mit Puffer von den Kammern und 5,0 ml frischem Puffer, und starten Sie die 2,5 min-Timer. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 4.4.4. </li><li> Am Ende des zweiten 2,5 min Spülen, Saugen, die Kammern und fügen Sie frischen Puffer, und starten Sie einen 1-min-Timer, um den Beginn der SECON CountdownD Standard hinaus. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie diesen Zyklus für alle Standard-Ergänzungen des Tages. </li><li> Während der letzten Standardaddition und anschließende 9 min Inkubation bereiten die 1,32 M KCl Referenzverbindung für ein Ende der Laufreferenzdosis Zugabe von 500 ul. </li><li> Nach der 1 min Intervall nach der letzten Behandlung hinaus, fügen Sie die KCl und starten Sie eine 9 min-Timer. HINWEIS: Die KCl hinaus ist die Lebensfähigkeit des Gewebes auf den Abschluss des Experiments bestätigen, und ist hilfreich, wenn die Verwaltung eine Behandlung, die nur in vernachlässigbaren Reaktion führt. </li><li> Zum Abschluss des letzten 9 min Referenzverbindung Inkubation Vakuum oder entfernen Puffer aus allen Kammern. Fügen Sie keine frischen Puffer. Abschluss des Experiments. </li><li> Sparen Diagramm-Datei, entfernen Blutgefäßabschnitte und fachgerecht entsorgen, und folgen Sie den sauberen up-Protokoll (vom Hersteller zur Verfügung gestellt und können spezifisch sein Labor) für Myographions Ausrüstung. </li></ol>

<ol>
	<li>Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intestinal+blood+flow.">Regulation of intestinal blood flow.</a> The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).</li><li>Dobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+absorption+from+the+rumen.">Blood flow and absorption from the rumen.</a> Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).</li><li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ.">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260, 617-619 (1976).</li><li>Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strain-gauge+myograph+for+isometric+measurements+of+tension+in+isolated+small+blood+vessels+and+other+muscle+preparations.">A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations.</a> Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).</li><li>Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+small+arteries.">Structure and function of small arteries.</a> Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).</li><li>Klotz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+vasoconstrictive+potential+of+D-lysergic+acid+using+an+isolated+bovine+lateral+saphenous+vein+bioassay.">Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay.</a> Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).</li><li>Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+contractility+bioassay+using+bovine+right+ruminal+artery+and+vein.">A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein.</a> Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).</li><li>Westendorf, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+ruminal+and+physiological+responses+to+endophyte-infected+tall+fescue.">In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).</li><li>Strickland, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Board-invited+review:+St.+Anthony&amp;#34;s+Fire+in+livestock:+causes,+mechanisms,+and+potential+solutions.">Board-invited review: St. Anthony&amp;#34;s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions.</a> Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).</li><li>Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E., B, B. e. r. d. e., HO, S. c. h. i. l. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+11.">Ch. 11.</a> Ergot Alkaloids and Related Compounds. , (1978).</li><li>Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+blood+flow+to+peripheral+and+core+body+tissues+in+sheep+and+cattle+induced+by+endophyte-infected+tall+fescue.">Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).</li><li>Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ergot+alkaloids+on+contractility+of+bovine+right+ruminal+artery+and+vein.">Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein.</a> Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).</li><li>Foote, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergot+alkaloids+from+endophyte-infected+tall+fescue+decrease+reticuloruminal+epithelial+blood+flow+and+volatile+fatty+acid+absorption+from+the+washed+reticulorumen.">Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen.</a> Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).</li><li>Hocking, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+mechanical+stretch+on+smooth+muscle+function+in+saphenous+veins.">Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins.</a> Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).</li><li>Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+intestinal+surgery.">Bovine intestinal surgery.</a> Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).</li><li>Budras, K. D., Habel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bovine Anatomy An Illustrated Text. , (2003).</li><li>Klotz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+lateral+saphenous+vein+serotonin+receptors+from+steers+grazing+endophyte-free,+wild-type,+or+novel+endophyte-infected+tall+fescue.">Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).</li><li>Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+exposure+to+ergot+alkaloids+decreases+contractility+of+bovine+mesenteric+vasculature.">Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature.</a> Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).</li></ol>

Die Erwähnung von Handelsnamen, proprietäres Produkt, oder solche Ausrüstung stellt keine Garantie oder Gewährleistung durch die USDA und keine Zustimmung zum Ausschluss von anderen Produkten, die verfügbar sein können.

Die erste Herausforderung in der Entwicklung dieses Bioassay war die Einrichtung einer Sammelstelle für wiederholbare mesenterialen Gefäßsystem. Probenstelle Konsistenz ist wichtig, da einige der Funktionen des Dünndarms Änderung während des Fortschreitens des Jejunums durch die Ileum und folglich das Mesenterium variieren in einem ähnlichen Muster. Die Ileum-Zweige der A. und V. mesenterica waren die leicht durch anatomische Landmarken identifiziert. Durch Anordnen des Blinddarms und folgende ileocecalen fache seiner Terminus auf der linken Seite des Mesenteriums, ist dieses in der Nähe der Beendigung der Schädel mesenterialen Arterie 15. Die Fläche mehr Gekröse (der so genannten Flansch) und die Verlängerung der ileozökalen fache (einzigartig in der Rind) 16 gemacht Probenahme über zahlreiche Tiere sehr wiederholbar. Eines der größeren Gefahren, die gemacht werden können, ist in dieser Phase des Bioassays. Mechanisches Strecken einen großen negativen Einfluss auf die nachfolgende Gefäß performance 14 und die Forscher feststellen, dass die Schiffe, die übermäßig manipuliert werden oder während der Entnahme und anschließende Reinigung gestreckt werden nicht an die Referenzverbindung verwendet reagieren. Das ist leider der einzige Weg, wirklich bewerten die Qualität der Gefäß Vorbereitung auf funktionaler Ebene und Behälter, die nicht an KCl reagieren, sollten nicht weiter für die Erzeugung von zuverlässigen Daten berücksichtigt werden. Zwei andere Verfahren Validierungsschritte (nicht gezeigt), die mit dem hier vorgestellten Verfahren endgültigen führten, waren die Verwendung von anderen Chemikalien als Referenzverbindungen und Testen der Lebensfähigkeit von Blutgefäßen nach 24 Stunden Lagerung. Norepinephrin und Serotonin wurden als Referenzverbindungen ausgewertet, aber Reaktionen der A. und V. mesenterica waren zu variabel für Schiffstyp und für Tiere, damit sie erfolgreich verwendet werden. Umgekehrt ist die Zugabe von 120 mM KCl ergab eine sehr reproduzierbare Antwort auf beide Arterie und Vene Zubereitungen. Einlso, wurden Arterie und Vene Antworten Tag der Entnahme ausgewertet und neu bewertet 24 Stunden nach der Sammlung, und es gab keine Unterschiede in der Reaktion Agonist entweder durch die Arterie oder Vene. Dies war ein wichtiger Aspekt der Bioassay, da häufig eine große Anzahl von Anwendungen (oder verschiedenen Behandlungskombinationen), die angewendet werden können, aber Forscher von Platz auf der Myographions und zeitlich begrenzt. Durch die Verlängerung der Überlebensfähigkeit aus 24 h aus der Sammlung, wird die Zeit für zusätzliche Experimente stark erhöht. Es ist wichtig für die Forscher, die Flexibilität der Behandlungsstruktur dieser Bioassay angewendet verstehen. Ein Forscher kann jede Verbindung zu dem Inkubationspuffer, die er oder sie Interesse an chronisch Aussetzen der Blutgefäße, um etwas von biologischen Relevanz zu steuern oder als Behandlung ist (im Falle von Klotz et al hinzuzufügen. 17, wurde diese mit fertig Seitenstammvenen kontinuierlich ausgesetzt ketanserin, die eine Serotonin-Rezeptor von Interesse antagonisiert). Die mesenterialen Blutgefäße könnte mit einer Verbindung von Interesse vor der Durchführung einer Kontraktionsreaktion Experiment vorbehandelt werden. Der Bioassay, wie vorgestellt, wurde entwickelt, um eine kumulative Konzentrations-Wirkungs-Experiment Blick auf Mutterkornalkaloide als Agonisten und ob vor ernährungsbedingten Exposition gegenMutterKornAlkaloide Auswirkungen auf die Gefäßreaktion 18 durchzuführen. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass dieses Verfahren eine messbare Gefäßreaktion zu erzeugen, und nur vier Konzentrationen wurden verwendet, um dies zu erreichen. Im Fall von Egert et al. 18, waren bis zu 10 verschiedenen Konzentrationen eingesetzt, um eine Antwortkurve zu konstruieren. Dieses Verfahren ist ein Weg, eine große Anzahl von verschiedenen Verbindungen oder Rezeptoren auf Blutgefäße aus einem einzigen Tier in einem kleinen Zeitfenster zu bewerten.

Veränderungen im Blutfluss zu einem Gewebe Bett kann einen großen Einfluss auf die Organfunktion. Eine primäre Funktion des Dünndarms ist Nährstoffabsorption. Arteriellen Blutfluss in den absorbierenden Oberfläche des Darms erforderlich für die Nährstoffaufnahme und Blutfluss erhöht, um in der Nährstoffabsorption Verdauungs bewegt sich entlang der Oberfläche 1 zu unterstützen. Eine Abnahme des Blutflusses kann eine Verringerung der Nährstoffabsorption aufgrund einer Abnahme in der transepithelialen Gradient 2 verursachen. Neben Nährstoffen kann die Dünndarm auch sekundäre Metaboliten, Medikamenten oder Toxinen, die sich auf lokale Durchblutung im Mesenterium ausüben ausgesetzt werden. In dem Fall des Wiederkäuers können Verbindungen aus einer Futter freigesetzt werden (beispielsweise Nährstoffe, wie Aminosäuren, oder Toxine, wie Mutterkornalkaloide) durch fermentative Prozesse der Vorderdarm. Wenn diese Verbindungen überleben den mikrobiellen Stoffwechsel der Pansenfermentation, sind sie nun für die Absorption verfügbaroder Interaktion während sie sich durch den Magen-Darm-Trakt des Tieres. Es gibt eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung, um den Blutfluss in vivo zu messen (zum Beispiel Doppler-Ultraschall, Dauerblutflussmesser, radioaktiv markierte Mikrokügelchen und Indikator-Verdünnungsverfahren), die Bewertung der verschiedenen experimentellen Szenarien oder Behandlungen zu ermöglichen. Allerdings sind Angaben zu den mechanischen oder pharmakologischen Eigenschaften der glatten Gefäßmuskulatur zu erhalten, blieb Methoden beschränkt sich auf große Schiffe bis Mulvany und Halpern 3 einen Artikel veröffentlicht, beschreibt eine Technik, mit Draht befestigt Gefäßring Zubereitungen in einer Myographions. Seit der Entwicklung dieser Technik Modifikationen weiterhin den zugehörigen Myographions Systeme, die eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen für die Bewertung der röhrenförmigen Strukturen zulassen werden. Das System wurde angepasst, um feste Stäbe für die Montage größerer Schiffe 4, wo Perfusion nutzenTechniken sind nicht erwünscht. Wegen der Unterschiede in Gefäßen aus verschiedenen anatomischen Ursprung und Auszeichnungen in den gleichen Gefäßen aus verschiedenen Tierarten, Daten aus Tiergefäß und Typ kann nicht einfach über verschiedene Gefäße oder demselben Schiff in verschiedenen Tierarten 5 extrapoliert werden. Folglich müssen getrennte Biotests entwickelt und validiert diese Aspekte jederzeit geändert werden werden. Kürzlich haben mehrere Biotests mit diesen Technologien für den Einsatz in der Rinder Vena saphena und rechten Pansen Arterie und Vene 6,7 entwickelt lateral. Diese Bioassay wurde entwickelt, um speziell zu untersuchen, welche Auswirkungen die Mutterkornalkaloide haben am Gefäßsystem unterstützt den Dünndarm. Es wurde berichtet, dass 50-60% der zugeführten Alkaloide in abomasale Inhalte angezeigt werden, aber nur 5% sind im Kot 8 gewonnen. Strickland et al. 9 erklärte in einer Überprüfung der Mutterkornalkaloide, dass die verfügbaren Daten Suggest, dass der Dünndarm kann der wichtigste Standort für ergopeptine Absorption. Eckert et al. Prüft biopharmazeutisches 10 Aspekte der Mutterkornalkaloide und erklärte, dass, sobald sie die epitheliale Barriere zu überschreiten, Mutterkornalkaloide sind entweder durch Lymphsystem in die V. subclavia oder über mesenterica und in Portal Blut transportiert. Rhodes et al. 11 verzeichnete einen Rückgang des Blutflusses zum Zwölffingerdarm und Dickdarm in Ochsen Verzehr einer hohen endophyteninfizierten (hohe Ergotalkaloid) Ernährung. Mit der rechten Pansen Arterie und Vene-Bioassay, Foote et al. Gezeigt, dass 12 Mutterkornalkaloide sind vasoaktive in Pansengefäßsystem. Foote et al. 13 anschließend in vivo gezeigt, dass die ruminale Einwirkung Mutterkornalkaloide zu einer verringerten Pansen epithelialen Durchblutung. Diese Verringerung des Blutflusses zu der Absorptionsfläche der Pansen gleichzeitig eine Reduzierung der Nährstoff (flüchtige Fettsäure) Fluss. Angesichts der quantity der Mutterkorn-Alkaloide Weitergabe an den Dünndarm aus dem Vorderdarm; es wurde angenommen, daß eine ähnliche Wirkung auf Dünn Vaskulatur und Nährstoffabsorption auftreten würde. Dies erforderte die Entwicklung der Rinder proximalen Ileum A. und V. mesenterica Bioassay.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specific to DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &amp;#956;m pore size; 45 mm neck size</td></tr><tr><td>#5 Jewler&amp;rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Any brand of forceps can be used</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Any brand of scissors can be used</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Any brand of dissecting light microscope will suffice</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Säugerverdauungssysteme ständig zu Verbindungen (erwünschte und unerwünschte), die eine Wirkung auf den Blutfluss zu und von dem System auswirken können. Veränderungen im Blutfluss in den Dünndarm kann Auswirkungen auf die absorptive Funktion des Organs führen. Besonderes Interesse an der Giftstoffe aus Futtermitteln durch fermentative und Verdauungsprozesse befreit hat bei Wiederkäuern als Bereich, in dem produktive Effizienz verbessert werden könnte entwickelt. Das Video zu diesem Artikel unter beschreibt, um Verbindungen für Vasoaktivität in isolierten Querschnitte von Rindern A. und V. mesenterica mit einem multimyograph entwickelte einen in vitro-Bioassay. Sobald die Blutgefäße angebracht sind und in der Myographions ins Gleichgewicht gebracht, kann der Bioassay selbst verwendet werden: als Screening-Tool, um die Kontraktionsreaktion oder Vasoaktivität von Verbindungen von Interesse zu bewerten; bestimmen das Vorhandensein von Rezeptortypen von pharmakologisch Targeting-Rezeptoren mit spezifischen Agonistens; Bestimmung der Funktion eines Rezeptors mit der Anwesenheit von einem oder mehreren Antagonisten; oder zu bestimmen, mögliche Wechselwirkungen von Verbindungen von Interesse mit Antagonisten. Durch all diese werden Daten in Echtzeit gesammelt werden, kann Gewebe von einem einzigen Tier gesammelt, um eine große Anzahl von verschiedenen experimentellen Behandlungen (ein Vorteil in vitro) ausgesetzt werden, und stellt Gefßsystem zu beiden Seiten des kapillaren Bett eine genaue bereitzustellen Bild dessen, was könnte in der zu-und abführenden Blutversorgung unterstützen den Dünndarm passiert werden.

Die zur Herstellung der enthaltenen Ergebnisse erzeugen Blutgefäße wurden aus 6 Holstein Ochsen (425 ± 8 kg) innerhalb von 3 Wochen-Intervall gesammelt. Ein Beispiel eines typischen mesenterica kontraktilen Reaktion auf KCl und Behandlung Zusätze Erhöhung der Konzentration ist in Abbildung 2 dargestellt. Die Größenordnung der Reaktionen einige mit der Größe des Behälters (mit der Größe des Spendertieres korreliert) zu variieren, kann aber auch durch unsachgemäße Behandlung beeinflusst werden (negativ) (Dehnung) der Gefäße bei der Sammlung und Reinigung. Daher ist es wichtig, einen wesentlichen kontraktile Reaktion in den Gefäßen Einwirkung KCl beobachten. Wenn eine vernachlässigbare Reaktion an dieser Stelle zu beachten, ist es nicht ratsam, weiter in dem Verfahren mit dem Behälter stattfindet. Wie in den 9 min Inkubationszeit in 2 zu sehen, gibt es inkrementale Erhöhungen in der Antwort, die mit steigenden Konzentrationen entsprechen. Obwohl für diese insbeson wünschenswertdere experimentellen Design, kann es nicht immer auftreten, oder nach mit anderen Behandlungen gesucht werden. Die KCl-Zugabe am Ende des Experiments, die aber nicht bei der Verarbeitung der gesammelten Daten verwendet werden, ist sehr wichtig, da sie die Lebensfähigkeit des Gewebes bestätigt am Ende der Versuchsperiode (wird wichtiger, wenn der Behälter nicht reagiert irgendeinem der Behandlungs Ergänzungen). Die in 2 gezeigten Daten sind in Gramm Spannung aufgezeichnet. Es ist wichtig, diese Daten zu normalisieren, um ein Tier zu Tier und Schiff-zu-Schiff Variation zu minimieren. So ist neben der Verwendung als ein Indikator für die Lebensfähigkeit verwendet, wird die maximale KCl Reaktion verwendet, um alle Behandlungs Ergänzungen zu normalisieren. Dies erzeugt kontraktile Antwort-Daten als Prozentsatz der maximalen KCl. Dies ist, wie A. und V. mesenterica Antwortkurven der zunehmenden Konzentration von 5-Hydroxytryptamin (Serotonin, Figur 3) und Norepinephrin ( <strong&gt; Abbildung 4) werden vorgestellt. Die Daten in diesen Figuren wurden fit sigmoidale Konzentrations-Reaktions-Kurve unter Verwendung einer nicht-linearen Regression. Die mesenterica Reaktion auf sowohl 5-Hydroxytryptamin (Abbildung 3) und Noradrenalin (Abbildung 4) begann als negative Werte. Dies ist ein Ergebnis der Korrektur der maximalen Spannung während jedes 9 min Inkubationszeit von der Ausgangsspannung vor der anfänglichen Zugabe KCl aufgezeichnet. Diese Basislinienkorrektur gewährleistet, dass geringe Unterschiede in der Spannung nicht in die Analysen einbezogen und damit die vorgestellten Daten nur eine Änderung in der Spannung zu reflektieren. Die negativen Wert ergibt sich aus dem Blutgefäß entspannen und fallen unter den vor der KCl Ausgangswerten vor der nachfolgenden Behandlung hinaus. Dies ist besonders häufig bei venösen Proben, bei denen die Ausgangskonzentrationen der Behandlung oder Agonisten zu niedrig um einen Kontraktionsreaktion verursachen. Dies war nicht der Fall für mich der<html> senteric Arterie Reaktion entweder auf biogene Amin, das Spannung über dem Ausgangswert gehalten, bis das Schiff fing an, zu den Behandlungs Ergänzungen zu reagieren. Dieser Unterschied veranschaulicht die Unterschiede in den Behältern auf jeder Seite der Kapillare Bett und warum sie auch als Teil dieser Bioassay betrachtet. Dieser Bioassay verwendet werden, um vasoaktive Wirkung von Verbindungen auf die Blutgefäße Nährstoffen in den Dünndarm als auch Blutgefäße, die absorbierten Nährstoffen aus dem Dünndarm zu bewerten. Daten in den 3 und 4 sind einfache Beispiele dafür, wie dies erreicht werden kann. Im Falle von 5-Hydroxytryptamin (Figur 3), es war kein Unterschied in der arteriellen oder venösen Kontraktionsreaktion. Umgekehrt wird die Kontraktionsreaktion durch die Vena mesenterica steigenden Konzentrationen von Norepinephrin war größer als die der mesenterialen Arterie. gurieren 1 &quot;fo: content-width =&quot; 3 Zoll &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Abbildung 1:. Ein Beispiel Rinderdarmtrakt als Quelle der mesenterialen Blutgefäße verwendet Der rote Stern zeigt den sichtbaren Teil des ileozökalen fach in allen drei Bereichen als Bezugspunkt. (A) Die ganze Trakt mit dem roten Oval, das die Ileum-Flansch an denen die Entnahme von Gefäßsystem aufgetreten. (B) Die Exposition von mesenterialen Gefäßbett. (C) Iris Schere auf einem exponierten Zweig der mesenterica (sichtbar) und Arterie (nicht sichtbar) kurz vor der Sammlung zeigt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2: Beispiel für eine Konzentrationsantwort eines mesenterica steigenden Konzentrationen von Noradrenalin (1 x 10 -7 bis 1× 10 -4 M). Die großen Ereignisse am Anfang und Ende der Spur sind Antworten auf 0,12 M KCl Ergänzungen. Das rote Rechteck bedeutet die Datenerfassung mit dem entsprechenden Bereich 9 min Inkubationszeit für jede Behandlung hinaus. Die 3 schlanken Spitzen, die diese folgen, sind Artefakte, die durch die Puffer Ersatz generiert und sind nicht in die Analyse einbezogen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52020/52020fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3: Die mittlere Kontraktionsreaktionen der Arteria mesenterica (MA) und Vene (MV n = 6 steuert), um zunehmende Konzentrationen an 5-Hydroxytryptamin (Serotonin)-Linien gezeigt sind, wurden unter Verwendung nicht-linearer Regressionsanalyse, um die Daten in eine sigmoidale passen erzeugt. Konzentration response Kurve, die die folgende Gleichung eingesetzt: y = unten + [(oben - unten) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], wobei oben und unten sind der Anteil der 120 mM KCl maximale Kontraktionsreaktion auf den Hochebenen, und die EC 50 die molare Konzentration des Alkaloids, die 50% der maximalen Reaktion KCl. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig4highres.jpg" width="500" /> Figur 4: Die mittlere Kontraktionsreaktionen der Arteria mesenterica (MA) und Vene (MV n = 6 steuert) zu steigenden Konzentrationen von Norepinephrin Linien gezeigt sind, wurden unter Verwendung nicht-linearer Regressionsanalyse, um die Daten in eine sigmoidale Konzentration-Antwort-Kurve, die verwendet passen erzeugt. die folgende Gleichung: y = unten + [(oben - unten) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], wobei oben und unten sind der Anteil der 120 mM KCl maximal contractile Reaktion auf den Plateaus, und die EC 50 die molare Konzentration des Alkaloids, die 50% der maximalen Reaktion KCl.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Der Dünndarm wird häufig Giftstoffe, die den Blutfluss zu beeinflussen, und kann sich negativ auf die Nährstoffabsorption ausgesetzt. Mit Hilfe eines multimyograph und A. und V. mesenterica isoliert, Verbindungen oder Giftstoffe von Interesse für Vasoaktivität abgeschirmt werden.

Isolierung und Verwendung von Rinder Abschnitte A. und V. mesenterica als Bioassay für Vasoaktivität im Dünndarm Testen

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K Aufrufe.  USDA-Agricultural Research Service.  Der Dünndarm wird häufig Giftstoffe, die den Blutfluss zu beeinflussen, und kann sich negativ auf die Nährstoffabsorption ausgesetzt. Mit Hilfe eines multimyograph und A. und V. mesenterica isoliert, Verbindungen oder Giftstoffe von Interesse für Vasoaktivität abgeschirmt werden. 

Serie: Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

A. mesenterica Kontraktion und Entspannung Studies Verwendung automatisierter Draht Myographie

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Forschung

Medizin

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologie

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Exploring arteriellen glatten Muskelzellen KV7 Kalium Kanal Funktion mit Patch-Clamp-Elektrophysiologie und Druck Myographie

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Beurteilung Murine Widerstand Artery Funktion Mit Druck Myographie

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Bewertung der Reaktion der Gefäß-Tone mit isolierten mesenterischen Arterien mit einem Schwerpunkt auf der Modulation durch Perivascular Adipose Tissues