We thank Dr. Joseph R. Fetcho for his input throughout the development of the procedure.We would like to acknowledge funding from the US National Institutes of Health (R01 EB002019 to C.B.S and DP OD006411 to Joseph R. Fetcho) and the National Science and Research Council of Canada (to M.J.F.) for financial support.

HINWEIS: Die Pflege und experimentelle Manipulation aller Mäuse in diesem Papier wurde von der Cornell University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Einrichten für Chirurgie <ol><li> Sterilisieren Sie alle benötigten Werkzeuge unter Verwendung eines Autoklaven oder genehmigt Sterilisationsverfahren. Zumindest sind ein Skalpell, Schere, vanna Scheren, Pinzetten, Juwelier Schraubenzieher, Wattestäbchen, eine Reihe von Wundhaken, das Implantat (1A) und dessen Verabreichungssystem (1D, E). </li><li> Wischen Sie alle Oberflächen, einschließlich aller Stereoskop Knöpfe, mit 70% Ethanol und / oder geeigneten Desinfektionsmittel. </li><li> Erstellen Sie einen sterilen Bereich durch Überlagerung der benutzerdefinierten stereotax (1D) und Umgebung Tisch mit sterilen Tüchern. Heizkissen (vorzugsweise rückgekoppelt gesteuert) ist auf der Oberseite des stereotax und nach steriler Abdeckung platziert werden. </li></ol> 2. Vorbereitungdie Maus für Chirurgie <ol><li> Anesthetize eine Maus unter 5% Isofluran / Sauerstoff in einer Induktionskammer, bis die Atemfrequenz verlangsamt, um ca. 1 Atemzug / sec. </li><li> Übertragen der Maus auf einen Staging-Bereich vom sterilen Bereich, mit einem Nasenkegel auf Isofluran Belichtung fortzusetzen. Reduzieren Isofluran bis 2%. Bewerben Augensalbe zur Hornhaut Austrocknen zu verhindern. </li><li> Verabreichen Glycopyrrolat (ein Anticholinergikum) bei 0,05 mg / 100 g Maus intramuskulär in den Hinterbeinen mit 29 bis 30 G Nadeln und 3/10 ml-Spritze und liefert etwa 50% des Einspritzvolumen pro Schenkel. HINWEIS: Glycopyrrolat dient zur Flüssigkeitsansammlung in den Lungen zu verhindern, während sich der Mauszeiger in Narkose. </li><li> Mit elektrischen Haarschneider, rasieren einen Teil des dorsalen der Maus, ca. 3 cm lang und 2 cm breit und am Thoraxbogen zentriert. Den eventuell getrimmt Haar weit weg von der rasierten Bereich. </li><li> Verwalten Sie die folgenden Injektionen subkutan und distal der rasiertenPatch mit 29 bis 30 G Nadeln und 3/10 cc Spritzen: 1 ml / 100 g Maus 5% Glucose in Kochsalzlösung (für die Hydratisierung), 5 mg / kg Maus Ketoprofen (NSAID zur Analgesie), 0,2 mg / kg Maus Dexamethason ( ein entzündungshemmendes Steroid um Entzündungen zu behandeln). </li><li> Mit Wattestäbchen, führen drei Wechsel Wäschen von Jod und 70% Ethanol, warten 1 min zwischen Wäschen. </li><li> Verwalten Sie 100 ul 0,125% Bupivacain (a peripheren Nervenblockade) subkutan mit 29 bis 30 G Nadeln und 10.3 ml-Spritze in die Mitte des rasiert Patch zu Schmerzen an der Einschnittstelle zu reduzieren. </li><li> Transfer-Maus an den kundenspezifischen stereotax (1D), legen Sie die rektale Thermometer, und warten Sie etwa 10 Minuten für Bupivicain wirksam werden. </li></ol> 3. Expose und Reinigen Sie die Rücken Laminae von 3 Angrenzend Brustwirbel <ol><li> Mit dem Skalpell, erstellen Sie einen kleinen (5 mm oder weniger) Schnitt über dem Wirbel von Interesse (Abbildung 2A). </li><li&gt; Entweder mit einer Pinzette oder durch Einführen der Spitze chirurgische Scheren und verbreiten Sie die Griffe, um die Größe der Öffnung in der Haut stumpf. </li><li> Mit einem Skalpell oder chirurgische Schere vorsichtig distanzieren Binde- Faszie zwischen der Haut und der darunter liegenden Muskeln. </li><li> Verwenden Wundhaken, um die Haut zurückhalten, so dass für eine möglichst große Arbeitsfläche wie möglich (2B). Achten Sie darauf, um die Last auf der Brust zu erhöhen und dadurch die Atmung behindern. </li><li> Unter Verwendung einer Pinzette, greifen die rostral-meisten Wirbel, die durch den darüberliegenden Muskel freigelegt wird. Mit einem Skalpell geschnitten Gewebe weg auf beiden Seiten des Dornfort von allen 3 Wirbeln (Abbildung 2c). </li><li> Mit beliebige Kombination aus einer Skalpellklinge, Wattestäbchen, und / oder Knochenschaber, entfernen Sie alle darüber liegenden Gewebe aus dem dorsalen Schichten (2D). </li><li> Mit OP-Schere, schneiden Sie vorsichtig entfernt Sehnen an die Wirbel auf beiden latera befestigtl Kanten der Wirbelsäule (2E). </li><li> Verwendung des Skalpells, sanft zu entfernen, wie viel Gewebe von den Seitenkanten der Wirbelsäule wie möglich sein, um eine saubere Klemmfläche vorzusehen. </li><li> Debridement vorsichtig die Wirbel der Verwendung eines Knochenschaber und / oder Wattestäbchen das verbleibende Weichgewebe. Schneiden Sie jede unpassende Gewebe an anderer Stelle mit chirurgische Scheren (2F). HINWEIS: Es ist wichtig, sowohl für Spann- und Durchführung der dorsalen Laminektomie, dass die Wirbel sind sauber ausgesetzt. Ein Ausbrenner kann nützlich bei der Kontrolle der anschließenden Blutungen. </li><li> Umschalt Retraktoren, die rund um die Wirbelsäule zusätzlich zu der Haut (2F) Gewebe zurückhalten. </li><li> Bringen Sie die Implantatseitenstege zu den Zinken auf den Lieferposten und laden Sie diese in den post-Inhaber (wie in Abbildung 1E). </li><li> Klemmen Sie die drei Wirbelkörper mit den Seitenleisten, die Anwendung gerade genug Druck, um securel halteny (2G, H). Verwenden einer Pinzette, um sicherzustellen, ein Niveau Klemmung der drei Wirbel. Man beachte, dass mehrere Versuche notwendig sein. Stellen Sie sicher, dass die Seitengitter sind beide Ebene und parallel vor der Durchführung der Laminektomie. </li><li> Sorgfältig reinigen und trocknen Sie die Rückenfläche des eingespannten Wirbel mit Wattestäbchen. </li></ol> 4. Führen Sie eine dorsale Laminektomie <ol><li> Stecken Sie die Spitzen der Vannas Schere in den Epiduralraum des medialen Wirbel eingespannten und drücken Sie die Griffe leicht; wenn der Knochen trocken ist, sollte es über die Länge der Rücken Lamina knacken. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der Gegenseite, die Lamina zu lösen. </li><li> Gently Greifen der losen Lamina von der dorsalen Verfahren mit einer Pinzette vorsichtig schneiden Sie jede Bindegewebe an den rostralen und kaudalen Enden der Lamelle und ziehen Sie es. </li><li> Mit 0,9% Salzlösung und / oder künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), gründlich abzuwaschen Blut overlying das Rückenmark. Verwenden Sie Wattestäbchen, um überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren. </li><li> Mit Vannas Schere vorsichtig schneiden Sie die seitlichen Ränder der Knochen zurück in den Seitenholmen des Implantats. Auch abzuwaschen und zu kontrollieren Blutungen mit Wattestäbchen und Kochsalzlösung / ACSF. </li><li> Für den Fall, dass ein Teil der Knochenhaut hat abgenommen und liegt über dem Rückenmark, entfernen Sie dieses Gewebe unter Verwendung von Wattestäbchen und / oder eine 29 bis 30 G-Nadel. Achten Sie darauf, in diesem Teil des Verfahrens zu verletzen das Rückenmark. Verwechseln Sie nicht die losen Knochenhaut mit dem fest eingewickelt Dura mater. </li><li> Vorsichtig Abdichtung der verbleibenden freiliegenden Kanten des Knochens mit einem oder beiden der Dentalacryl und Cyanoacrylat (2I). Seien Sie besonders vorsichtig, nicht zuzulassen, die Klebstoffe an auf die freigelegte Rückenmark fließt. </li></ol> 5. Verschließen Sie die Kammer <ol><li> Positionieren Sie die obere Platte vorsichtig, so dass die 4 Steckplätze eine Linie mit den 4 Löchern an den Seitenleisten und die Öffnung über der freiliegenden Spinal Kabel (Abbildung 1B und 2J). </li><li> Mit der Juwelier-Schraubendreher vorsichtig starten Sie die erste Schraube, die Stabilisierung der Schaft des Schraubendrehers mit einer anderen Pinzette. Die Schraube in dieser Phase nicht festziehen, aber setzen Sie sie, so dass die ersten Gewindegänge im Eingriff sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen 3 Schrauben. HINWEIS: Es ist sinnvoll, Titan oder anderen nicht magnetisierbaren Pinzette verwenden, um Position zu diesem Zeitpunkt helfen, die Schrauben. </li><li> Bei allen vier Schrauben fest, Jede Schraube abwechselnd um den gleichen Betrag in kleinen Schritten, bis alle Schrauben fest gesichert (Abbildung 2K). Beachten Sie, dass es nicht ungewöhnlich, dass die obere Platte, die während dieses Prozesses zu biegen. Achten Sie darauf, die Schrauben nicht zu fest an, da der Schraubenkopf kann brechen und übermäßiger Druck nach unten wird die Klemme lösen und / oder zu Verletzungen des Rückenmarks. </li><li> Verwenden ein Silikonelastomer, den Raum zwischen dem Rückenmark und dem Glasfenster zu füllen. Weil es does nicht Essigsäure bei der Aushärtung zu erzeugen, verwenden Sie KwikSil Marke Elastomer und Mischkanülen. Eine großzügige Teil der Silikon auf die freigelegte Rückenmark. Achten Sie darauf, loszuwerden, jede silikonhaltige Luftblasen aus der Mischspitze vor dem Aufbringen auf das Rückenmark zu bekommen. </li><li> Arbeiten schnell, drücken Sie vorsichtig eine 5 mm # 0 Deckglas in den Einsatz in der oberen Platte. Genügend Druck allmählich zusammendrücken flüssiges Elastomer umgibt das Rückenmark, aber nicht im Rückenmarkkompression (2L) führen. Einstellzeit für das Elastomer ist ca. 90 Sekunden, so stellen Sie sicher, dass das Deckglas wird rasch vorgenommen. </li><li> Im Falle einer fehlgeschlagenen Versiegelung, warten Sie, bis das Elastomer ausgehärtet ist, entfernen Sie sie aus dem Implantat mit einer Pinzette und wiederholen 5,4-5,5. </li><li> Bedecken die Ränder exsudierter Elastomers mit Dentalacryl / Cyanacrylat und sich an den umgebenden Knochen, so viel wie möglich, um das Elastomer von der Verschiebung auf der Oberfläche des Rückenmarks zu verhindern. </li><li> Wundhaken entfernen und ziehen Sie die Haut rund um den Rand des Implantats. Mit Sekunden haften die Haut bis zu den Rändern des Implantats (2M, N). </li><li> Legen # 0-80 - 1/4 &quot;Gewindestifte in die Flügel der oberen Platte (1C und 2 O). </li><li> Mit Zahn Acryl, verschließen Lücken in den Schraubenöffnungen der oberen Platte (Abbildung 2P). </li></ol> 6. Postoperative Behandlung <ol><li> Entfernen Tier aus der Narkose und in einen großen Käfig sauber. Sicherzustellen, daß der Käfig ausreichend groß ist, dass die Kammer nicht auf irgendetwas hängen bleiben (wie die V-förmigen Tauch für eine Wasserflasche und / oder Lebensmitteln), während des Verlaufs der normalen Fortbewegung der ganzen Käfig. ANMERKUNG: Eine Standard-Rattenkäfig ist ideal. </li><li> Setzen Sie den Käfig auf einer erhitzten Oberfläche, während das Tier erholt. Sie nicht die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren zurück, bis er sich vollständig erholt hat. </li><li> Überprüfen Tier behaVior in 1 - 2 Stunden nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen oder Leiden und Implantatintegrität. HINWEIS: Unter normalen Bedingungen sollte das Tier in der Lage, mit geringen Störungen auf die Bewegung ambulate sein. </li><li> Weiter zur Tier alle 8 überprüfen - 12 Stunden für die ersten 72 Stunden, Messgewicht und Überwachungsverhalten. Überprüfen Sie, ob die Tiere aktiv und mobil in der Nacht sind. Feuchtnahrung in Form von Boden Chow mit Wasser oder Nahrungs Gele, Futter-Pellets vermischt und Trinkwasser sollte in Bodennähe zur Verfügung gestellt werden. Zusätzliche Flüssigkeitszufuhr durch subkutane oder intraperitonealen Injektionen sollte bei Bedarf zur Verfügung gestellt werden. </li><li> Verabreichen 5 mg / kg Maus Ketoprofen und 0,2 mg / kg Dexamethason subkutan Maus 24 und 48 h Zeitpunkte, postoperativ. Zusätzlich sollte 0,005-0,010 mg / 100 g Maus alle 8 h durch subkutane Injektion von 72 h verabreicht werden. </li></ol> 7. In Vivo Imaging <ol><li> Anesthetize eine Maus unter5% Isofluran / Sauerstoff in einer Induktionskammer, bis die Atemfrequenz verlangsamt, um ca. 1 Atemzug / sec. </li><li> Übertragen der Maus auf die benutzerdefinierte stereotax (1D) mit Rückkopplung gesteuert Heizkissen und legen Rektalthermometer. Reduzieren Isofluran bis 2%. </li><li> Verabreichen Glycopyrrolat 0,05 mg / 100 g Maus intramuskulär in den Hinterbeinen mit 29 bis 30 G Nadeln und 3/10 ml-Spritze und liefert etwa 50% des Einspritzvolumen pro Schenkel. </li><li> Verabreichen 1 ml / 100 g Maus 5% Glucose (zur Hydratation) subkutan in Salz einmal pro Stunde. </li><li> Setzen Sie die Gewindekammer Inhaber in die post-Halter für die Chirurgie (1F) verwendet. Stellen Sie die Höhe und drehen Sie die Beiträge auf die Gewindestifte in der oberen Platte. </li><li> Mit befestigt beide Halter, erhöhen Sie die Halterungen in den post-Inhaber, bis die Brust frei nach Inspiration zu erweitern. HINWEIS: Sowohl die feste Anbringung der Halterungen und die freie Ausdehnung der Brust significantly Reduzierung von Bewegungsartefakten aufgrund der Atmung. </li><li> Führen Bildgebung, wie gewünscht. </li><li> Wenn Imaging abgeschlossen ist, niedrigere Beiträge, abdrehen Kammer Halter entfernen rektale Thermometer und Ort der Maus auf einer erhitzten Oberfläche zu erholen. Sie nicht die Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren zurück, bis er sich vollständig erholt hat. </li></ol>

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<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Hocine, M., Zalc, M., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Spinal+Cord+Window+Chamber+Model+for+In+Vivo+Longitudinal+Multimodal+Optical+and+Acoustic+Imaging+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A Spinal Cord Window Chamber Model for In Vivo Longitudinal Multimodal Optical and Acoustic Imaging in a Murine Model.</a> Plos One. 8 (3), 58081(2013).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+Glass+Spinal+Cord+Windows+in+Adult+Mice+with+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 82, 50826(2013).</li>
<li>Romanelli, E., Sorbara, C. D., cacute, I. N., Dagkalis, A., Misgeld, T., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular%2C+subcellular+and+functional+in+vivo+labeling+of+the+spinal+cord+using+vital+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cellular, subcellular and functional in vivo labeling of the spinal cord using vital dyes.</a> Nature Protocols. 8 (3), 481-490 (2013).</li>
</ol>

The authors having nothing to disclose, and no competing financial interests.

Die Technik hier gezeigt ermöglicht wiederholt, Zeitraffer, in vivo-Bildgebung des Rücken Maus SC aus, um viele Wochen nach der Operation ohne die Notwendigkeit für eine nachfolgende chirurgische Eingriffe. Dieses Verfahren stellt eine wesentliche Verbesserung gegenüber wiederholter Chirurgie Imaging-Studien oder über portmortem histologischen Ansätzen, bei denen Informationen über zelluläre Dynamik verloren. Wir haben zuvor gezeigt, 30 den Wert dieser Technik zur Untersuchung SCI Pathologie in vivo. Die maximale Längserstreckung der Bildgebung durch das Wachstum einer dichten, faseriges Gewebe über die dorsale Oberfläche des SC bestimmt. Im Laufe der Zeit ergab sich dieses Wachstum in dem Verlust von Bildkontrast und die Auflösung. Dieses Wachstum wurde auch in alternative chirurgische Präparate 31 gesehen. Gerüchten zufolge wir durch vorsichtiges Waschen des dorsalen SC Oberfläche zu Blutprodukten zu entfernen, Abdichtung der Oberfläche beobachtet haben, dass dieses Wachstum minimiert werden kannder geschnittene Knochen mit Cyanoacrylat Dichtkanten der Kammer gut mit Silikonelastomer und den Zwischenraum zwischen der Rücken SC und dem Deckglas minimieren. Vor kurzem ein anderer Ansatz ähnlich wie unsere eigene mit einem Polycarbonat Kammer hat sich gezeigt, 32. Die Verwendung von Polycarbonat ist vorteilhaft, da sie mit der X-ray und akustische Bildgebungsverfahren, das nicht der Fall ist für unsere Edelstahlteile kompatibel ist. Doch mit der heute allgegenwärtigen Technologie der 3D-Drucker, Kammerteile können aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, um speziellen Anforderungen entsprechen. Vor kurzem haben wir eine klare Photopolymer gedruckt allen Teilen. Ein wesentlicher Nachteil einer geschlossenen Kammer ist die Unfähigkeit, wiederholte Dosierungen von Medikamenten oder exogene Farbstoffe geeignet für SC-Bildgebung 34 zu verabreichen. Jedoch durch Nutzung der mechanischen Stabilität unserem gegenwärtigen System haben wir bereits unsere Gegenwart Kammer zur erfolgreichen verwendetlich verankern einen intrathekalen Katheter an eine subkutan implantierte Injektionsöffnung verbunden, die für die Arzneimittelabgabe auch in einer geschlossenen Kammer Systems (unveröffentlichte Arbeit) erlaubt zu mehreren Zeitpunkten. Außerdem ist es aufgrund des modularen Aufbaus der oberen Platte werden zukünftige Versionen dieser Zubereitung enthalten eine wiederverschließbare Kammer für wiederholte Anwendung von sowohl therapeutischen Mittel und fluoreszierende Markierungen ermöglichen. Es ist auch möglich, die oberen Platten mit Aufnahmen zur Aufnahme von Elektroden, optische Einsätze und Ports für die Arzneimittelabgabe vorstellen. Solche Zusätze wäre wahrscheinlich schwieriger zu implementieren mit dem minimalistischer System Fenrich et al. 31. Abschließend bietet unseren Kammer ein Gateway Plattform, auf der diverse Experimente basieren.

Zeitraffer-in-vivo-Mikroskopie in intakten Organismen ermöglicht die direkte Visualisierung von komplexen biologischen Prozesse, die zu den traditionellen Einzelzeitpunktanalyse nicht zugänglich sind, wie Immunhistochemie. Insbesondere Mehrphotonenmikroskopie (MPM) 1 erlaubt für die Bildgebung in streuendem Gewebe, wie beispielsweise Nager Neocortex, wobei Abbildungs ​​bis zu 2,3 und mehr als 4 1 mm erreicht wurde. Wenn mit chirurgischen Vorbereitungen 5-7, in dem ein einziges Verfahren ermöglicht einen optischen Zugang zum Gehirn für Wochen bis Monate kombiniert wurden diese Mikroskopie Ansätze verwendet worden, um dynamische Prozesse im Gehirn von gesunden und erkrankten Zuständen 8-11 studieren. Darüber hinaus wurden Protokolle entwickelt 12,13, die für In-vivo-Bildgebung in wach (dh nicht narkotisierten) Tiere, so dass für zelluläre auflösenden funktionellen Bildgebung bei Verhaltenstests. Diese Protokolle wurden für Comparis verwendetons korrelierter neuronaler Aktivität 14, Astrozyten Calcium-Signal 15 in narkotisierten und wachen Tieren, die Identifizierung von aufgabenspezifischen neuronalen Cluster 16, und die Fähigkeit der Neuronen zur Lage des Objekts auf Whisker Stimulation 17 unterscheiden. Angesichts der Möglichkeit dieses Ansatzes zu gesunden und pathologischen Mechanismen, Zeitraffer-in-vivo-Bildgebung wurde dem Rückenmark der Maus (SC) aufgebracht aufzuklären, die die Identifizierung von akuten axonale Degeneration (AAD) als Krankheitsmechanismus 18. Anschließende Studien untersuchten Wirkungen der peripheren Läsionen auf Spinalganglien (DRG) Axonregeneration 19, die Rolle von Blutgefäßen in Axonregeneration 20, glial-Chemotaxis als Reaktion auf Verletzung 21, T-Zell-Migration in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) 22, Aktivität Mikroglia und Astrozyten 23,24 25 in Reaktion auf amyotrophic lateraler Sklerose (ALS), die Rolle von STAT-3 in axonalen Sprossung nach SC Verletzungen (SCI) 26 und einen Mechanismus der Axon Verlust und Wiederherstellung in EAE 27. Trotz des Erfolgs dieser Ansätze wurden alle diese Studien, entweder eine einzelne Abbildungs ​​Sitzung beschränkt, wodurch Untersuchungen zur kurzfristigen Dynamik Begrenzung oder auch erforderlichen wiederholten chirurgischen Öffnungen des Tieres bei jedem Abbildungszeitpunkt, wodurch die Anzahl von Zeitpunkten zugänglich und die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer Verwechslung experimentellen Artefakte. Protokolle für diese Operationen wurden zuvor 28,29 veröffentlicht. Kürzlich veröffentlichten wir eine Technik, 30 für die Implantation einer chronischen Wirbelsäulen Kammer, die Zeitraffer MPM Bildgebung in der Maus SC über mehrere Wochen freigegeben ohne die Notwendigkeit wiederholter Operationen. Kurz gesagt enthalten diese chirurgische Vorbereitung Durchführung Laminektomie in der unteren Brustwirbelsäule und die Implantation von einer vierteiligen Kammer. Die Kammer enthaltendrei individuelle bearbeiteten Teile aus Edelstahl, der die Wirbel umgebenden Laminektomie und ein Deckglas über das SC plaziert und mit Silikonelastomer gesichert eingespannt ist. Diese Technik erlaubt für Routine-Bildgebung, um mehr als 5 Wochen nach der Operation bei gesunden und verletzten Staaten ohne die Notwendigkeit für Wiederholungsoperationen. Die Anzahl der Bilderzeugungszeitpunkten wurde nur von der Frequenz, mit der das Tier zur Narkoseeinleitung tolerieren beschränkt. Imaging Lebensdauer wurde durch das Wachstum einer dichten, fibrösen Gewebe über die Oberfläche des SC beschränkt. Darüber hinaus überprüft man, daß das chirurgische Implantat hatte keine langfristigen Auswirkungen auf die Motorfunktion. Seit unserer ersten Veröffentlichung wurden alternative Ansätze auch ermöglicht langfristige Bildgebung in der SC-31-33 an anderer Stelle beschrieben. Dieses Protokoll zeigt unser Verfahren zum Implantieren des Rückenkammer von uns entwickelte.

<table><tbody><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-04</td><td></td></tr><tr><td>forceps, scissors, scalpel, etc.</td><td>Fine Science Tools</td><td>multiple&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -magnetic fixator</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-02</td><td></td></tr><tr><td>retractor kit -retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td>other retractors may also be used</td></tr><tr><td>retractor kit -elastomer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-07</td><td></td></tr><tr><td>feedback controlled heating blanket</td><td>CWE Inc.</td><td>Model: TC-1000 Mouse&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Part No. 08-13000</td><td></td></tr><tr><td>stereotax</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>spinal chamber holders</td><td></td><td>see Farrar et al, Nat. Meth., 9, 297, 2012, Supplement (online)</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>Loctite 495</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Coral Powder (dental acrylic powder)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8101</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Teets Cold Cure Liquid (dental acrylic liquid)</td><td>Teets</td><td>Mfg. Part: 8501</td><td>multiple suppliers</td></tr><tr><td>Glycopyrrolate</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 29706 (Baxter 1001901602)</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaine</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 029841 (Hospira 116301)</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 002800 (Pfizer 2193)</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>MWI SKU: 501012 (VetOne 1DEX032)</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Elastomer</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>KwikSil Mixing Tips</td><td>World Precision Inc.</td><td>KWIKMIX</td><td></td></tr></tbody></table>

a procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

Nach dem Verfahren oben, sollte jede Stufe der Operation die Ergebnisse für die einzelnen Phasen der Operation in Abbildung 2 skizziert imitieren. Besondere Vorsicht ist bei der Anwendung der Silikonelastomer, um Luftblasen unter dem Glas zu beseitigen genommen werden oder zumindest sicherzustellen, dass sie an der Peripherie des Gebietes von Interesse (2L) befindet. Für einen erfahrenen Chirurgen, chirurgische Komplikationen Euthanasie erfordern entweder während der Operation oder innerhalb der ersten 24 Stunden nach dem Eingriff auftreten, in etwa 20% der Operationen. Diese Komplikationen am häufigsten sind eine übermäßige Weichgewebe Blutungen oder Misserfolg sicher zu befestigen die Kammer an der Wirbelsäule. In erfolgreich implantiert Kammern, bleibt das Fenster in der Regel optisch transparent für mehrere Wochen (Abbildung 3). Trotz aller Bemühungen, bildet eine opake, faserig, neoplastisches Wachstum häufig innerhalb weniger Tage, was zu einer teilweisen obscuring des Fensters (3C - F, schwarz gestrichelte Linie). Leuchtstoffstrukturen sind schwierig zu sehen, mit 2PEF Mikroskopie unter diesem Bindegewebe. Wir finden eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, mit ca. 50% der erfolgreich implantiert Fenster übrigen klar für mehr als 5 Wochen nach der Operation, und ca. 50% immer auf 1 verschleierten - 3 Wochen. Für Fenster, die klar, die meisten Orte im Sichtfenster Erfahrung nur ein bescheidenes Maß an Neovaskularisation in oder über der Dura (Abbildung 3D - F, grün Sternchen) bleiben, die 2PEF Bildgebung nicht behindert. Unsere früheren Studie 30 zeigten einen Anstieg der Mikroglia aber nicht Astrozyten Dichte unter dem Fenster und benachbarten Wirbeln, was einer leichten Entzündung analog der in Hirn Fenster Zubereitungen 5 ersichtlich. In transgenen Mäusen, gelb fluoreszierendes Protein (YFP) bei einem Teil der dorsalen Wurzel gangl exprimierendenia (DRG) Neuronen (YFPH Leitung; Jackson Labs) wurden Axone deutlich unterscheidbar Wochen postoperativ (4A und B) und, sofern vier Monate in einem Tier (Daten nicht gezeigt). Blutgefäße (4A und B) wurden durch retroorbital Injizieren fluoreszierenden Texas Rot sichtbar gemacht markiertem Dextran in das Blutplasma. Mikroglia wurden auch bei Mäusen, die GFP in einem CX3CR1 knock-in Maus sichtbar gemacht (CX3CR1-GFP; Jackson Labs) ging zum YFPH Linie (4C). Kontrast und die Auflösung verschlechtert geringfügig über die Zeit (4C) durch die Bildung eines vorher 30 beschriebenen faserigen Wucherung. Wir routinemäßig für 3 Stunden in einer einzigen Sitzung ohne Mortalität jeder 12 Stunden abgebildet und so oft. Sitzungsdauer und Frequenz wird durch die Toleranz der Tiere zur Narkoseeinleitung, gleichzeitig mit der begleitenden Schmerzen und Leiden zu Versuchstieren ethischen Überlegungen begrenzt. &lt;<html> p class = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Eine kundenspezifische OP-Bereich erleichtert Kammer Lieferung während der Implantation und stabilisiert die Kammer bei der anschließenden Imaging-Sitzungen. Zwei Seiten-Bars und eine obere Platte (A) zusammengesetzt werden (B) mit kleinen Schrauben in den Wirbelkammer (C). Ein Operationstisch mit ausziehbaren Stützen (D) ermöglicht die Lieferung und Spannen der Seitenschienen an den Wirbeln mittels Haltezapfen (E). Nachfolgende Imaging-Sitzungen statt dessen Innengewinde Beiträge an die Kammer über die Stellschrauben auf den Schwingen des Implantats (F) zu befestigen. Steuerung b dieser Zahl hat sich von Farrar et al., Nature Methods, 2012 30 mit Genehmigung der Nature Publishing Group geändert.96 / 52196fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Eine dorsale Laminektomie durchgeführt, und eine chronische Abbildungskammer implantiert ist, um einen optischen Zugang zum Rückenmark bereitzustellen. Das Verfahren ist in der Montage beschrieben. Zunächst wird die Haut (Platten A, B; Protokoll Schnitte von 3,1 bis 3,4) und Muskeln (C; 3,5) zurückgezogen, um die drei zugrunde liegenden Wirbel aus. Die darüberliegende diese drei Wirbel Gewebe entfernt (D, E, F; 3,6-3,10) und die Seitenfort abgeschabt zu reinigen, bevor sie sich auf beiden Seiten (G, H; 3,12) eingeklemmt sind. Vorsichtig ist der dorsale Lamina des zentralen Wirbel entfernt und die Kanten des Knochen abgedichtet (I </strong&gt;; 4. 6). Eine obere Platte angelegt wird (J; 5.1) und Schrauben in Position (K; 5,3) befestigt sind, um die Kammer vor dem Abdichten der Kammer mit Silikonelastomer und Deckglas (L; 5.5) sichern. Nachdem die Lieferung Stifte entfernt (M; 5,8) wird die Haut an den Seiten der Kammer geklebt (M, N; 5,8) und die Schrauben in den Flügeln (O; 5.9) eingefügt. Schließlich werden die Schraubenschlitze mit Zahn Acryl versiegelt (P; 5,10). Und die Maus in einem sauberen Käfig zu erholen platziert <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52196/52196fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Eine chronische Rückenkammer bleibt optisch transparenten over mehrere Wochen. Weißlichtbilder des Rückenmarks, im Bereich von einigen Minuten (A) bis drei Wochen nach der Operation (F). Vascular Sehenswürdigkeiten identifizierbar zu allen Zeitpunkten (gelbe Pfeile). Wenig Veränderung ist auf einen Tag nach dem Eingriff (B) zu sehen. Dichte Faserüberwucherung (C - F, durch die gestrichelte Linie auf der unteren rechten begrenzt) vorhanden ist schon drei Tage und führt zu einer teilweisen Verdunkelung der Bildfläche. Mild Neovaskularisation (D, E, F, grün Sternchen) ist auch vorhanden, aber nicht darüber hinwegtäuschen, ursprüngliche Gefäßsystem in weißes Licht oder 2PEF Bildgebung. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52196/52196fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52196/52196fig4highres.jpg" /><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Abbildung 4. Eine chronische Rückenkammer ermöglicht wiederholte Mehrphotonen Bildgebung ohne die Notwendigkeit wiederholter Operationen. wiederholte Abbildung von transgenen Mäusen, die YFP in einer Untergruppe von DRG Axone (grün) in die dorsale funiculi des Rücken Schnur und Gefäßen (rot) durch intravaskuläre Injektion Farbstoff (A, B) markiert. Die Aktivität von Mikroglia (lila) kann auch im Laufe der Zeit in Thy1-YFP / CX3CR1-GFP doppelt transgenen Mäusen (C) verfolgt werden. Während Axonen und Mikroglia sichtbar bleiben, Kontrast und Auflösung Rückgang bescheiden im Laufe der Zeit (C). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52196/52196fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

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A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

14.1K Aufrufe.  Cornell University.  In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert. 

Serie: A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

This is a compact visual description of a combination of surgical technique and device for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. While the technique is demonstrated in the animal, the procedure is FDA-approved and currently being used for stem cell transplantation into the spinal cords of patients with ALS. While the FDA has recognized proof-of-principle data on therapeutic efficacy in highly characterized rodent models, the use of large animals is considered critical for validating the combination of a surgical procedure, a device, and the safety of a final therapy for human use. The size, anatomy, and general vulnerability of the spine and spinal cord of the swine are recognized to better model the human. Moreover, the surgical process of exposing and manipulating the spinal cord as well as closing the wound in the pig is virtually indistinguishable from the human. We believe that the healthy pig model represents a critical first step in the study of procedural safety.

Short visual description of the surgical technique and device used for the delivery of (gene and cell) therapies into the spinal cord. The technique is demonstrated in the animal but is entirely translatable and currently being used for human application.

Operationstechnik für Spinal Cord Lieferung von Therapien: Demonstration der Vorgehensweise in Göttingen Minischweine

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Medizin

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as multiple sclerosis. Here we present a low-cost and reproducible glass window implantation protocol that is suitable for intravital microscopy and studying the dynamics of spinal cord cytoarchitecture with subcellular resolution in live adult mice with EAE. Briefly, we surgically expose the vertebrae T12-L2 and construct a chamber around the exposed vertebrae using a combination of cyanoacrylate and dental cement. A laminectomy is performed from T13 to L1, and a thin layer of transparent silicone elastomer is applied to the dorsal surface of the exposed spinal cord. A modified glass cover slip is implanted over the exposed spinal cord taking care that the glass does not directly contact the spinal cord. To reduce the infiltration of inflammatory cells between the window and spinal cord, anti-inflammatory treatment is administered every 2 days (as recommended by ethics committee) for the first 10 days after implantation. EAE is induced only 2-3 weeks after the cessation of anti-inflammatory treatment.
Using this approach we successfully induced EAE in 87% of animals with implanted windows and, using Thy1-CFP-23 mice (blue axons in dorsal spinal cord), quantified axonal loss throughout EAE progression. Taken together, this protocol may be useful for studying the recruitment of various cell populations as well as their interaction dynamics, with subcellular resolution and for extended periods of time. This intravital imaging modality represents a valuable tool for developing therapeutic strategies to treat autoimmune demyelinating diseases such as EAE.

We describe a method for implanting and maintaining glass windows over the exposed spinal cords of adult mice for studying experimental autoimmune encephalomyelitis. These windows provide chronic optical access to the spinal cord for monitoring cell dynamics at the subcellular level in live animals using two-photon microscopy.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Biotechnik

In Vivo Mouse Model of Spinal Implant Infection

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The purpose of this method is to describe a novel mouse model of spinal implant infection (SII) that was created to provide an inexpensive, rapid, and accurate in vivo tool to test potential therapeutics and treatment strategies for spinal implant infections.
In this method, we present a model of posterior-approach spinal surgery in which a stainless-steel k-wire is transfixed into the L4 spinous process of 12-week old C57BL/6J wild-type mice and inoculated with 1 x 103 CFU of a bioluminescent strain of Staphylococcus aureus Xen36 bacteria. Mice are then longitudinally imaged for bioluminescence in vivo on post-operative days 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28, and 35. Bioluminescence imaging (BLI) signals from a standardized field of view are quantified to measure in vivo bacterial burden.
To quantify bacteria adhering to implants and peri-implant tissue, mice are euthanized and the implant and surrounding soft tissue are harvested. Bacteria are detached from the implant by sonication, cultured overnight and then colony forming units (CFUs) are counted. The results acquired from this method include longitudinal bacterial counts as measured by in vivo S. aureus bioluminescence (mean maximum flux) and CFU counts following euthanasia.
While prior animal models of instrumented spine infection have involved invasive, ex vivo tissue analysis, the mouse model of SII presented in this paper leverages noninvasive, real time in vivo optical imaging of bioluminescent bacteria to replace static tissue study. Applications of the model are broad and may include utilizing alternative bioluminescent bacterial strains, incorporating other types of genetically engineered mice to contemporaneously study host immune response, and evaluating current or investigating new diagnostic and therapeutic modalities such as antibiotics or implant coatings.

The protocol describes a novel in vivo mouse model of spinal implant infection where a stainless-steel k-wire implant is infected with bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36. Bacterial burden is monitored longitudinally with bioluminescent imaging and confirmed with colony forming unit counts after euthanasia.

In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen

Spine implant infections portend poor outcomes as diagnosis is challenging and surgical eradication is at odds with mechanical spinal stability. The ...

Rückenmarkschirurgie und Implantation des optischen Schaftes bei Nagetieren

Implantation of Optoelectronic Devices in the Rodent Spinal Cord

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the spinal cord remains relatively unexplored. The inherently delicate and mobile spinal cord tissue imposes constraints that make the precise implantation of neural probes challenging. Despite recent advances in neuromodulation devices, particularly flexible bioelectronics, opportunities to expand their use in the spinal cord have been limited by the surgical complexities of device implantation. Here, we provide a series of surgical protocols tailored specifically for the implantation of a custom-made optoelectronic device that interfaces with the spinal cord in rodents. The steps to place and anchor an optical shank on a specific segment of the spinal cord via two different surgical implantation methods are detailed here. These methods are optimized for a diverse range of devices and applications, which may or may not require direct contact with the spinal cord for optical stimulation. To elucidate the methodology, the vertebral anatomy is referenced first to identify prominent landmarks before making a skin incision. The surgical steps to secure an optical shank over the cervical spine in rodents are demonstrated. Procedures are then outlined for securing the optoelectronic device connected to the optical shank in a subcutaneous space away from the spinal cord, minimizing unnecessary direct contact. Behavioral studies comparing animals receiving the implants to those undergoing sham surgeries indicate that the optical shanks did not adversely affect hindlimb or forelimb function seven days post-implantation. The present work broadens the neuromodulation toolkit for use in future studies aimed at investigating various spinal cord interventions.

Autor im Rampenlicht: Innovative Methodik zur Implantation und Befestigung von neuronalen Sonden im Rückenmark von Nagetieren

This protocol details a surgical procedure for performing spinal cord surgery and for implanting and securing an optical shank over the spinal cord in rodents.

Implantation optoelektronischer Geräte in das Rückenmark von Nagetieren

Neuromodulation can provide diagnostic, modulatory, and therapeutic applications. While extensive work has been conducted in the brain, modulation of the ...

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs

Zusammenfassung

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