This work was supported by the National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 and Georgetown University.

1. Larvenaufzucht von zwei A. albopictus Gruppen zum Erwachsenwerden <ol><li> Stellen Sie zwei Photoperiode Schränke mit programmierbaren Beleuchtung bei 21 ° C für eine optimale Diapause Ausdruck 16 und ca. 80% relativer Luftfeuchtigkeit. <ol><li> Programmieren Sie einen Schrank für einen 16L: 8D-Licht: Dunkel-Zyklus (ein nicht-Diapause induziert LD Photoperiode). Stellen Sie das zweite Gehäuse für eine 8L: 16D Licht: Dunkel-Zyklus (Diapause induziert) 13. </li><li> &quot;Licht an&quot; Programm zur gleichen Zeit in beiden Schränke auf circadiane Zeit zwischen Photoperioden zu synchronisieren. </li></ol></li><li> Berechnen Sie die Menge der Eier erforderlich sind, um das Experiment durchzuführen. Ziel für 300 bis 500 Eier pro Käfig. Mindestens drei replizieren Diapause Käfige und drei replizieren nicht Diapause Käfige für die RNA-Generation benötigt. Dieser beläuft sich auf 1,800-3,000 Eier pro Experiment ca.. <ol><li> Hatch die Eier durch Eintauchen Ei Papiere in ca. 500 ml VE H 2 O </li><li> Hinzufügen &lt;em&gt; ca. wie zuvor 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Grundfutter und Artemia beschrieben 24. Decken Sie Behälter mit Mesh, und halten Sie die Masche an Ort und Stelle mit einem Gummiband. </li><li> Platzieren Sie in der Photoperiode LD Schrank für ca. 24 Std. </li></ol></li><li> Übertragungs geschlüpften Larven zu 10 x 10 x 2 cm Petrischalen mit ca. 90 ml gefüllt entionisiertem H 2 O. <ol><li> Halten Sie ca. 30 Larven pro Schale. Übertragen Larven zu reinigen Gerichte jeden 48-72 Stunden, zum Beispiel jeden Montag, Mittwoch und Freitag (MWF) 24. </li><li> Feed ca. 1 ml Essen Aufschlämmung, bestehend aus Boden Hundefutter und Artemia in VE-Wasser jeden MWF wie zuvor beschrieben 24. </li></ol></li><li> Bis drei Minuten vor vier Erwachsenen Käfige diese Einstellung für jedes Photoperiode Behandlung, wobei jeder Käfig einen biologischen Replikation. <ol><li> Von gegenüberliegenden Seiten des 9,5 l Eimer, schneiden Sie ein 10-für-14 cm Loch, und ein weiteres Loch mit 15 cm Durchmesser. Cover das erste mit Mesh. Geschnitten etwa eine Fußlänge eines orthopädischen Strumpf und kleben einem Ende um die Innenseite der anderen Bohrung. </li><li> Schneiden Sie das Fußende der Strumpf aus und Knoten geschlossen - offen nur bei Zugriff auf das Innere des Käfigs erforderlich. Für den Käfig Deckel, schneiden Sie den gesamten Innenraum, so dass nur die Felge, und ersetzen Sie den Innenraum Kunststoff mit Mesh-24. </li><li> Achten Sie auf die Photoperiode, replizieren Zahl, Käfig Startdatum und andere Informationen, die für das Experiment mit wasserfesten Stift auf der Seite des Käfigs. </li></ol></li><li> Den Boden der Erwachsenen Käfige mit feuchtem Filterpapier. Befeuchten des Filterpapiers mit ausreichend entionisiertem H 2 O, lokale Luftfeuchtigkeit im Käfigs zu erhöhen, aber vermeiden stehendes Wasser, das Eiablage auf dem Filterpapier 24 stimulieren kann. Überprüfen Sie das Filterpapier täglich zum Trocknen, wieder nass, wenn notwendig. </li><li> Um eine ausreichende Eier für eine RNA-Bibliothek zu erstellen, mindestens 100 Frauen / 9,5 L cage, mit nicht mehr als 500 Mücken pro Käfig. </li><li> Sammeln Puppen MWF und in eine kleine Tasse sauber H 2 O bei einer Dichte von nicht mehr als 50 Puppen pro 25 ml H 2 O Übertragen Sie die Puppen cup einem Erwachsenen Käfig. Platz Käfige in der jeweiligen Photoperiode Schrank - A. albopictus Puppen sind lichtempfindlich 15. </li><li> Stellen Sie sicher, dass täglich H 2 O in Tassen ist sauber und klar, und entfernen abgestorbene Puppen, weil Aufbau von toten Puppen können Massensterben verursachen. Entfernen H 2 O Tassen, nachdem alle Puppen entstehen. </li><li> Platzieren organische Rosinen auf dem oberen Gitter des Käfigs Zucker zur taucht Erwachsenen bereitzustellen. Überwachen Sie Rosinen, und ändern Sie sie alle 3-5 Tage, um Schimmel Ansammlung zu verhindern. </li></ol> 2. Wartung der Erwachsene zu Paarung und Eierproduktion zulassen <ol><li> Pflegen Käfigen bei hoher Feuchtigkeit (ca. 80%) durch Auskleiden der Käfigunterteil mit einem feuchten Filterpapier, und den Zugriff auf Nicht-schimmelig Rosinen, wie oben beschrieben (Abschnitons 1.5 und 1.9). </li></ol> 3. Blut-Fütterung <ol><li> Bereiten Sie sich darauf Blutzufuhr Weibchen zwischen zwei bis sechs Tage nach dem Schlüpfen, um sicherzustellen, dass Frauen haben mindestens acht eindeutige kurze Tage ausgesetzt worden, bevor der Eiablage beginnt für nahezu 100% Diapause Eier 14. </li><li> Bereiten Sie die Hemotek Membran Zuführsystem. Stecken Sie die Zuführungseinheiten in die Stromversorgung. Die Temperatur einer jeden Einheit auf 37 ° C mit der Stellschraube. Mit einem elektronischen Thermometer und Sonde, um die Temperatur der Zuführungseinheit während der Kalibrierung zu messen. </li><li> Bereiten Sie die Mahlzeit Reservoir. Dehnen Sie ein Quadrat von Kollagen Fütterung Membran über der Öffnung der Mahlzeit Behälter und sichern Sie sie mit einem O-Ring. Die Ecken, um Falten zu entfernen Ziehen; schneiden Sie die überschüssige Membran mit einer Schere. HINWEIS: Collagen Membran kann nicht gut für alle Mückenarten zu arbeiten, und es kann notwendig sein, verschiedene Arten versucht, die optimale Membran zu finden, wenn die Arbeit mit einemaußer A. Arten albopictus. Parafilm funktioniert gut mit Culex pipiens. <ol><li> Wenn Blut wird bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor der Verwendung gefroren gelagert, Tauwetter. </li><li> Halten Sie den Behälter, so dass die Membran nach unten zeigt, werden nicht unterstützt, und die Einfüllöffnungen nach oben zeigt. Verwenden einer Transferpipette oder Spritze, um das Reservoir mit etwa 3 ml Vollblut von Hühnern, Natriumcitrat als Antikoagulans einfüllen. Siegel Einfüllöffnungen mit Kunststoffstopfen. </li></ol></li><li> Befestigen Sie das vorbereitet Reservoir zur Zuführung durch Aufschrauben auf das Gestüt auf der Wärmeübertragungsplatte auf der Unterseite des Förderers. Kehren Sie die Zuführung und setzen Sie ihn auf dem Käfig, Membranseite nach unten, so dass Mücken können durch die Maschen des Käfigs zu ernähren. Halten Sie die Zuführung auf den Käfig ca. 45 min zu Fütterung zu maximieren. </li></ol> 4. Anregung Eiablage <ol><li> Vier bis fünf Tage nach der Blutmahlzeit, rüsten jeden Käfig mit einem dunkel gefärbten 50 ml cmit rohen Samenkeimung Papier (Ei Papier) oder strukturierte nicht-gebleichten Papiertuch ausgekleidet und füllen auf halbem Weg mit VE-Wasser 9. Wenn mehr als 250 Mücken sind in einem Käfig, verwenden Sie zwei Tassen. HINWEIS: Bei kleinen Käfigen oder Einzel weibliche Fläschchen kann &quot;Heu-Infusion&quot; in Eiablagebehälter Eiablage durch den Geruch der mikrobiellen Flora 25 zu erhöhen. </li></ol> 5. sammeln und speichern Eggs <ol><li> Beginnen Eiersammlung innerhalb von 4-5 Tagen von blutsaugenden, weil die Eierproduktion Spitzen typischerweise etwa fünf Tage nach Blut Fütterung und dann nachlässt in der nächsten Woche. </li><li> Vary Eiersammlung Frequenz auf Notwendigkeiten des Experiments. Für allgemeine Zwecke, sammeln Eier Papiere auf einer MWF Zeitplan. Entfernen Ei Papiere aus jedem Käfig und ersetzen mit frischem Papier. Zeigen kürzlich entfernt Papiere in Petrischalen und lagern in SD Photoperiode Schrank auf verwirrende Auswirkungen ei der Lagerung zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie Eier Papieren neu<html> Haupt nass für 2 Tage nach der Eiablage an serösen Nagelhautbildung, die Ei Austrocknung Widerstand 26 erhöht ermöglichen. </li><li> Etwa 48 Stunden nach der Sammlung, trockene Eier im Freien. Trocknen Sie das Papier, so dass es schlaff und leicht feucht anfühlen, aber nicht so feucht, dass das Papier dunkel von H 2 O oder stimuliert Schlüpfen der Eier. HINWEIS: Ein 6.5 &quot;x 4&quot; Papier kann etwa 3,5 Stunden dauern, um zu trocknen. Seien Sie vorsichtig, nicht zu über-trocken Ei Papiere, da dies in Ei Austrocknung 27 führen. </li><li> Reserve zusätzliche Eier sowohl von LD und SD-Photoperioden zu Diapause Häufigkeit zu beurteilen und interpretieren die photoperiodische Effekt (siehe Mess Diapause, Abschnitt 6). </li><li> Für langfristige Lagerung, halten Ei Papiere bei 21 ° C und ca. 80% Luftfeuchtigkeit in Petrischalen. Halten Sie Petrischalen in einer Tupperware Vorratsbehälter mit einer Flasche Wasser auf lokale Feuchtigkeit zu halten, wie der Embryonalentwicklung dauert vier bis fünf Tage bei 21 ° C. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Messen Sie Diapause Inzidenz <ol><li> Verwenden Sie zusätzliche vorbehalten Embryonen (siehe Stimulieren Eiablage, Abschnitt 4), die 7 bis 20 Tage alt, um die Diapause Antwort zu quantifizieren sind. </li><li> Notieren Sie sich die Anzahl der auf jedem Ei papier Eier. </li><li> Stimulieren Sie Eier, die von Notlaufeigenschaften einzelnen Ei Papiere in einem 90 ml Petrischale mit ca. 80 ml ​​VE H 2 O schlüpfen In etwa 0,25 ml Lebensmittel Gülle. </li><li> Nach 24 Stunden tally die Anzahl der schraffierten ersten Larvenstadium. Legen Sie die Petrischale auf eine schwarze Oberfläche zu Larven zu visualisieren und legen Sie eine Lichtquelle auf einer Seite der Schale. Die Larven werden von der Lichtquelle weg bewegen, was eine klare Bilanz von einzelnen Larven. Entfernen Sie einzelne Larven mit einer Pipette beim Zählen erzählt einzelnen Larven zu verhindern. </li><li> Platz Ei Papiere in eine neue Petrischale und wieder trocken. Re-Eier brüten nach ca. 1 Woche wieder übereinstimmen Eiern geschlüpft Verwendung des vorstehenden Verfahrens. </li><li> Platz Ei Papiere mit dem restlichen u<html> n-geschlüpften Eier in neue 90 ml Petrischalen mit ca. 80 ml ​​Bleichlösung 28. Sicherzustellen, dass die Eier Papiere vollständig in der Bleichlösung eingetaucht und lassen im Abzug über Nacht, um den Geruch der Bleich vermeiden. HINWEIS: Bleichlösung kann für ~ 1 Woche bei 4 ° C gelagert werden, sollte aber ansonsten frisch hergestellt werden. </li><li> Überprüfen Sie Eier mit einem Lichtmikroskop als Bleich das Chorion zu löschen und Visualisierung von embryonierten, un-geschlüpften Eiern. Wenn das Ei embryonierten, wird das Ei eine cremefarbene, mit den Augen als zwei kleine schwarze Punkte gegenübereinander auf der Rückenseite erscheinen. Tally die Anzahl der nicht-schraffierten, embryonierten Eiern 13. </li><li> Bestimmen Diapause Einfall mit der folgenden Formel:% Diapause = keine. embryonierte un-Eier ausgebrütet / (Nr. geschlüpften Eier + Nr. embryonierte un-Eier ausgebrütet) x 100 13. </li></ol> 7. RNA-Extraktion aus Eier / Larven pharate NHALT &quot;&gt; Hinweis: Verwenden Trizol in einer Sterilbank. <ol><li> Pinsel Mücke Eier enthalten entwickelnden Embryonen oder pharate Larven an bestimmten Entwicklungszeitpunkten vom Ei Papiere Glasschleifer mit einer Kamelhaarbürste. Schleifen Sie die Eier in Trizol (1 ml pro 50 bis 100 mg Gewebe), bis sie vollständig pulverisiert. Verwenden Sie mindestens 400 Eier pro Bibliothek, um eine ausreichende RNA ergeben. <ol><li> Alternativ Snap freeze Eier in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C in Mikrozentrifugenröhrchen für bis zu einem Monat vor dem Mahlen in Trizol gespeichert. </li></ol></li><li> Führen RNA-Extraktion in Trizol gefolgt von Isopropanolfällung nach Herstelleranweisungen. </li><li> Behandeln Sie die Bank mit RNase Dekontaminationslösung oder andere Mittel, um alle restlichen Nukleasen zu entfernen, um RNA-Abbau zu vermeiden. <ol><li> Behandeln Sie die extrahierte RNA mit DNase. Nach den Anweisungen des Herstellers, Inkubation der RNA-Proben mit DNase für 30 min bei 37 ° C. Verwenden Sie 1 und #181; l DNase für bis zu 10 &amp; mgr; g RNA in einer 50 ul Reaktion. Erhöhung der Menge an DNase, wenn es mehr als 10 &amp; mgr; g RNA in einer Reaktion. </li><li> Inaktivierung von DNase durch Zugabe von 5 ul suspendiert DNase-Inaktivierung Reagenz. Inkubiere 5 Minuten bei Raumtemperatur, dreimal während der Inkubationsperiode (leichter Verwirbelung). </li><li> Zentrifugieren bei 10.000 × g für 1,5 min. Die überstehende, die die behandelten RNA Proben in frische Röhrchen zur anschließenden Schritten. </li></ol></li><li> Bewerten Sie die Qualität der Gesamt-RNA-Proben mittels Fluorometrie. Senden Sie die Proben auf eine Spezialanlage mit geeignete Instrument für diese Aufgabe. Die Anlage wird auf dem Chip-Gelelektrophorese durchgeführt, um die Größe der RNA-Spezies in der Probe durch Fluoreszenzfarbstoff in der Chip instilliert visualisiert bestimmen. Die Ergebnisse werden als ein Elektropherogramm zurückgegeben. <ol><li> Bestimmung der Integrität der Gesamt-RNA-Proben durch das Vorhandensein oder Fehlen von Abbauprodukten, wie durch das Vorhandensein o belegenf Peaks zwischen 18S und 5S rRNA Peaks auf der resultierenden Elektropherogramm (1B). </li></ol></li></ol> 8. RNA Sequenzierung <ol><li> Senden der Gesamt-RNA-Proben mit einer ausreichend hohen Qualität (1A) und Menge (in der Regel&gt; 3 ug pro Bibliothek) an eine kommerzielle Ordnungszentrum für den Bau von angereichertem Paired-End mRNA-Bibliotheken und mRNA-Sequenzierung nach Standardprotokollen. </li><li> Wenn mehr als eine Spur wird für die Sequenzierung eines einzigen Experiment verwendet wird, aufgeteilt einzelnen Bibliotheken in zwei Fahrspuren für die Sequenzierung für technische Unterschiede zwischen den Fahrspuren während der Sequenzierung zu berücksichtigen. </li></ol> 9. Illumina lesen Reinigung ANMERKUNG: Abbildung 2 zeigt die Bioinformatik Teil dieses Protokolls. Für eine vollständige Liste aller Programme und Ressourcen in der Bioinformatik Abschnitt dieses Protokoll verwendet, auf die Tabelle 1 verwiesen. InAußerdem STADT Datei 1 enthält Befehlszeilenbeispiele für jede der folgenden Bioinformatik Protokollschritte. <ol><li> Verwenden ssaha2 29 (Tabelle 1), um Gruppen aus 95% Identität oder höher, um der NCBI UniVec Core-Datenbank identifiziert (Tabelle 1), A. albopictus rRNA-Sequenz (GenBank # L22060.1) und Sequenzierung Adaptern (detaillierte Befehlszeilenbeispiele in STADT Datei-1 zur Verfügung gestellt). Entfernen Lesepaare mit Streichhölzern mit Perl oder eine ähnliche Scripting-Tool, beispielsweise durch Anpassung der bereitgestellten Perl-Skript (Supplemental Datei 2). </li><li> Reinigen Sie verbleibende liest mit dem SolexaQA Paket 30 (Tabelle 1; Supplemental Datei 1): schneiden Regionen mit phred Punktzahl Äquivalent von weniger als 20 mit den Standardeinstellungen des DynamicTrim.pl. <ol><li> Entfernen Sie liest die kürzer als 25 bp mit LengthSort.pl auf Vorwärts- und Rückwärts liest gleichzeitig. Bewerten Sie die Qualität der fastq gereinigt Dateien mit FastQC (Tabelle 1 </strong&gt;) - insbesondere, ob die pro-Basensequenz Qualität und die pro-Sequenz, Qualitätswerte sind über 20. </li></ol></li></ol> 10. Digitale Normalisierung <ol><li> Führen Sie eine Runde von digitalen Normalisierung auf dem gereinigten liest mit Hilfe des Khmer-Werkzeug 31 (Tabelle 1; Supplemental Datei 1), insbesondere normalize-by-median.py (mit k-mer Größe 20, eine Abdeckung Cut-off von 20, und x = 1e10). </li><li> Alternativ, wenn eine Maschine mit hoher RAM zur Verfügung steht (Hunderte von GB), verwenden Sie Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl Skript (Tabelle 1). </li></ol> 11. De Novo Transkriptom Assembly <ol><li> Beim Zugang zu einem Computer oder einem Computer-Cluster mit bis zu 256 GB RAM und 24 CPUs, abhängig von der Größe der Anordnung. </li><li> Verwenden Trinity 32 (Tabelle 1; Supplemental Datei-1), um die digital normalisierte Lese in Contigs gesetzt zu montieren. So verkleinernSpeichernutzung, verwenden --min_kmer_cov 2. </li></ol> 12. Montage Bewertung <ol><li> Führen assemblathon_stats.pl vom Assemblathon2 Projekt 33 auf der Fläche zu Trinity-Ausgang. Dieses Skript führt Grundrechenarten relevant Auswertung Montagequalität, wie die Anzahl der Gerüste, N50, Montage Zusammensetzung und (Tabelle 1; Supplemental Datei 1). </li></ol> 13. Markieren des Assembled Transkriptom <ol><li> Führen BLASTX (Tabelle 1) der Anordnung gegenüber einem Referenzprotein-Set; für Moskitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens und Aedes aegypti eignen Referenzen. Genauer gesagt, formatieren Sie das Referenzprotein fasta Datei für Explosion, gefolgt von blastx (Supplemental Datei 1). </li></ol> 14. Karte Liest der Versammlung Mit RSEM 34 (Tabelle 1) <ol><li> Erstellen Sie eine Datei &quot;transcript-to-Gen-Karte&quot;, in dem dererste Spalte enthält die Referenz-Gen-IDs und die zweite Spalte die Fläche zu IDs. In einem Spreadsheet-Editor, tauschen die ersten und zweiten Spalte von der BLASTX Ausgang, und schreiben Sie diese Spalten in eine TXT-Datei. Verwenden Sie die Linebreak-Programm um Zeilenumbrüche in der resultierenden Textformat an den Unix-Format zu konvertieren. </li><li> Erstellen Sie eine Referenzdatensatz aus der Transkriptom fasta Datei mit dem RSEM-Vorbereitung Verweis Skript, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt. </li><li> Berechnen Sie die Expressionswerte für jede Bibliothek mit dem Befehl RSEM-calculate-Ausdruck, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt. Wie liest, verwenden Sie die gepaart fastq Dateien aus dem Lesereinigungsschritt (Schritt 9.2) ergibt. <ol><li> Wenn RNA aus einer biologischen Replikation wurde für die Sequenzierung in zwei Bahnen aufgeteilt, umfassen sowohl fastq Dateien im Ausdruck Berechnung, um eine einzelne Datei zu generieren. </li></ol></li><li> Konvertieren Sie die Ausdruck ergibt sich aus jeder Bibliothek zu einer Matrix leicht von anderen p verarbeitetROGRAMME mit dem mitgelieferten Skript RSEM-generate-Data-Matrix, in der RSEM Paket (Supplemental Datei 1) zur Verfügung gestellt. </li></ol> 15. Differential Expressionsanalyse <ol><li> Installieren R und Kantenschneider (Tabelle 1). </li><li> Verwenden read.delim die RSEM Ergebnisse aus Schritt 14.3 (Supplemental Datei-1) zu laden. Falls erforderlich, ergänzen die Zähler auf die nächste ganze Zahl. HINWEIS: Der Kantenschneider Leitfaden empfiehlt die Begrenzung der Datenmenge, um Gene mit hoch genug zum Ausdruck Bedeutung zu erkennen. </li><li> Um die Daten für Edger zu formatieren, erzeugen eine DGEList Objekt aus der geladenen Datei (Supplemental Datei 1). Dann normalisieren die Daten mit TMM Normalisierung (Supplemental Datei 1). Schätzen Sie die gemeinsame und tagwise Dispersionen der Daten (Supplemental Datei 1). </li><li> Identifizieren differentiell exprimierte Gene mit einem Benjamini-Hochberg korrigierten p-Wert &lt;0,05 (Supplemental Datei 1). Zeichnen Sie die Verteilung der log-fach Wechsel vs. Fülle (Supplemental Datei 1). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll stellt Methoden, um differentiell exprimierte Gene aufgrund entdecken induzierte Diapause in A. photoperiodisch albopictus. Das Protokoll ist, dass es auf einzigartige Weise Moskito Aufzucht und Bioinformatik-Techniken, um alle experimentelle Aspekte eines molekularen Physiologie Programm zugänglich Anfänger machen signifikante - insbesondere für diejenigen, die sich auf die photoperiodische Diapause Antwort. Bestehende Verfahren, nach unserer Kenntnis nicht bieten so viele Details bei der Aufzucht-Protokoll - die oft notwendig ist, um Fehler zu identifizieren, Aufzucht - noch haben sie einen Einblick auf experimentelles Design während der Aufzuchtphase, die erfolgreich bioinformatische Analyse Downstream ermöglicht. Die hier vorgestellten Verfahren wurden für A. optimiert albopictus, vor allem die Aufzuchtmethoden, die in der Regel nehmen sechs Wochen nach einer Labor Generation zur nächsten. Jedoch in zukünftigen Anwendungen dieser Methode könnten mit bescheidenen angepasst werdenAnpassungen an andere Mückenarten, die photoperiodische Diapause 23 aufweisen. Außerdem werden zur Versuchsplanung und Bioinformatik Workflow gelten für das Studium der anderen polyphenisms. Einige Punkte, die nicht im Protokoll aufgeführt sollte bei der Aufzucht von A. werden albopictus Larven. Zuerst A. albopictus können in einer Vielzahl von natürlichen und künstlichen Behälter Lebensräume wie in früheren Arbeiten beschrieben 36, 37. Gebrauchte Reifen Plätze sind eine häufige Quelle von Larven zur Festlegung labor Kolonien gefunden werden. Bevölkerung über 32N Breitengrad in Nordamerika gesammelt zu erwarten, dass eine starke Reaktion Diapause 13 aufweisen werden. Die A. in diesem Protokoll verwendet albopictus Stamm wurde aus Manassas, VA gesammelt und wurde in einer Laborumgebung mehr als acht Generationen vor der experimentellen Manipulation aufgezogen. Zweitens sollten die Beleuchtung in den Photoperiode Schränke mit Sorgfalt ausgewählt werden. Bulbs Schränkemit eingebautem Lichtfunktionen können Temperaturspitzen im Gehäuse zu bewirken, wenn die Beleuchtung ein- bzw. ausgeschaltet wird. Anekdotische Beobachtung legt nahe, diese Temperaturspitzen können die Diapause Reaktion stören. Um dies zu verhindern, integrierte Lichtfunktionen sollten deaktiviert werden und Schränke sollten mit einem 4-Watt-cool-Leuchtstofflampe ausgestattet werden. Drittens Larven sind empfindlich gegenüber H 2 O Qualität und Lebensmittelfluss. Daher kann Überfütterung, um bakterielle Akkumulation und Larvensterblichkeit führen. Viertens gibt es alternative Methoden zur Blutzufuhr erwachsenen weiblichen Mücken. Glasmembranen sind eine Alternative künstlichen Membransystem 38, 39, obwohl die HemoTek System führt besser in Erfahrung der Autoren. Lebende Tiere (meist Huhn oder Nagetier) kann auch verwendet werden 38 - in diesem Fall ist es wichtig, zunächst entsprechende Zertifizierung zu erhalten von Ihrem Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC). Fünftens, obwohl es keine klaren Beweise veröffentlicht thbei Eiern sind lichtempfindlich 15, schlage anekdotischen Beobachtungen, dass Eier von einer SD-Photoperiode Behandlung weisen leicht reduziert Diapause Inzidenz, wenn sie einer Photoperiode LD 10 Tage nach der Eiablage ausgesetzt. So speichern sowohl SD und LD Eier unter SD Bedingungen, um eine maximale Diapause Reaktion in den SD-Eier zu produzieren und zu keiner Verwechslung Wirkung von Photoperiode (SD vs. LD) bei Eier Lagerung. Hohe RNA-Qualität ist für die Erstellung hochwertiger RNA-Seq Daten. Reichlich Sorgfalt sollte während der RNA-Extraktion getroffen werden, um Nuklease Kontamination zu vermeiden. Niedrige Qualität RNA-Proben, wie sie in 1B gezeigt, sind nicht für die Sequenzierung geeignet. Die Beurteilung der RNA Qualität, bevor die Proben für die Sequenzierung ist zwingend erforderlich. Charakteristische Banden von RNA-Molekülen kann für verschiedene Arten von Insektengewebe zur RNA-Extraktion verwendet wird, wie beispielsweise vier Bänder kleiner als 18S in der hohen Qualität RNA Elektropherogramm gezeigt sichtbarin 1A. Timmende Muster von anderen als den zwei Banden bei 18S in Proben unter unterschiedliche biologische Behandlungen RNA Banden stark kann zeigen, daß diese Bänder nicht vor Abbau führen, stellen aber die biologische Zusammensetzung der RNA-Moleküle in den spezifischen Gewebetypen in der Versuchsanordnung gewählt. Die Bioinformatik Workflow skizzierten kann ein Benutzer mit einigen Befehlszeile und Scripting-Fähigkeiten, um eine Liste der differentiell exprimierten Gene von Illumina Sequenzierung Daten repliziert RNA-Bibliotheken erzeugt aus zwei kontrastierenden Versuchsbedingungen zu erhalten. Während dieses Beispiel betrifft Gene durch Photoperiode unterschiedlich exprimiert, kann dieser Workflow jeder Versuchsanordnung mit zwei oder mehr Behandlungen angewendet werden, in jedem Organismus. Es gibt viele andere Möglichkeiten, um auf eine Liste von differentiell exprimierten Genen zu gelangen; jedoch ist dieses Protokoll wahrscheinlich der einfachste Ansatz für den Anfänger sein. Mehr aberfahrenen Bioinformatiker Vielleicht möchten Sie zusätzliche Maßnahmen, um die Nachbarschaft und Redundanz ihrer Montage zu verbessern. Biologen mit wenig bis gar keine Erfahrung Bioinformatik können auch komplette zumindest einen Teil dieser Pipeline im iPlant 40 Discovery-Umwelt, die eine freie grafische Benutzerschnittstelle angesteuert Analyseumgebung ist. Es ist wahrscheinlich, dass iPlant Funktionalität wird in Zukunft größer sein, um vollständige RNA-Seq-Pipelines von De-novo-Transkriptom Baugruppen aufnehmen wachsen. Schließlich ist zu beachten, dass der hervorragende Bedienungsanleitung gründlich diskutiert die viele Möglichkeiten, Kantenschneider 41 (Tabelle 1) für differentielle Expressionsanalyse zu verwenden. In einigen Fällen kann die Fehlanordnungen chimären Contigs erzeugen. Es gibt verschiedene Methoden, die dazu beitragen können, diese Fehlanordnungen identifizieren, beispielsweise Uchime 42. , Aus den Erfahrungen der Vergangenheit, ist die Anzahl der erkannten Chimären jedoch äußerst gering (&lt;0,1%); daher employinga Chimäre Erkennungsprogramm möglicherweise nicht den zusätzlichen Aufwand. Die Verarbeitung mit hohem Durchsatz, der nächsten Generation Sequenzierungsdaten erfordert die Fähigkeit, 1) speichern große Mengen von Daten (für ein einzelnes Projekt,&gt; 500 GB); 2) zu manipulieren große Dateien, die nicht in der traditionellen Textverarbeitungsprogrammen oder Tabellenkalkulationsprogrammen geöffnet werden können; 3) Durchführung von Analysen, die große Mengen des RAM, beispielsweise für die de novo Anordnung erfordert; und 4) Analyse großer Datenbestände, sei es durch Programme, die von einer Befehlszeilenschnittstelle (die die Möglichkeit, diese Programme zu installieren, die oft nicht trivial ist) oder durch die Analyse Suiten mit grafischen Benutzeroberflächen (erfordert angetrieben zB Galaxy 43 oder 40 iPlant ). Forscher mit einigen Kenntnisse in Unix-Kommandozeile und einer Skriptsprache wird den größten Nutzen aus Zugang zu einem lokalen Rechencluster zu gewinnen - entweder Universität Besitz, über einen Mitarbeiter oder für den eigenen Labor gekauft. Zum Beispiel kann die above Workflow wurde mit einem Laboreigenen Macintosh (12 Kerne, 64 GB RAM, 1 TB Festplatte), und eine Universität eigenen Computer-Cluster für die Trinity Montage durchgeführt. Wenn ähnliche Ressourcen nicht verfügbar sind, können die Forscher noch iPlant drehen durchführen groß angelegte Analysen ohne Kosten und mit relativ niedrigen Investitionen in die Ausbildung durch die grafische Oberfläche Umwelt. Doch diejenigen, die Durchführung und Interpretation der Analysen müssen noch die Voraussetzungen der einzelnen Programme verwendet zu verstehen.

Rapid advances in next-generation sequencing (NGS) technologies are providing exciting opportunities to probe the molecular underpinnings of a wide range of genetically complex ecological adaptations in a broad diversity of non-model organisms1&#8211;3. This approach is extremely powerful because it establishes a basis for population and functional genomics studies of organisms with an especially interesting and/or well-described ecology or evolutionary history, as well as organisms of practical concern, such as agricultural pests and disease vectors. Thus, NGS technologies are leading to rapid advances in the fields of ecology and have the potential to address problems such as understanding the mechanistic bases of biological responses to rapid contemporary climate change4, the spread of invasive species5, and host-pathogen interactions6,7.
The extraordinary potential of NGS technologies for addressing basic and applied questions in ecology and evolutionary biology is in part due to the fact that these approaches can be applied to any organism at a moderate cost that is feasible for most research laboratories. Furthermore, these approaches provide genome-wide information without the requirement of a priori genetic resources such as a microarray chip or complete genome sequence. Nevertheless, to maximize the productivity of NGS experiments requires careful consideration of experimental design including issues such as the developmental timing and tissue-specificity of RNA sampling. Furthermore, the technical skills required to analyze the massive amounts of data produced by these experiments, often up to several hundred million DNA sequence reads, has been a particular challenge and has limited the widespread implementation of NGS approaches.
Recent RNA-Seq studies on the transcriptional bases of diapause in the invasive and medically important mosquito Aedes albopictus provide a useful example of some of the experimental protocols that can be employed to successfully apply NGS technology to studying the molecular basis of a complex ecological adaptation in a non-model organism8&#8211;10. A. albopictus is a highly invasive species that is native to Asia but has recently invaded North America, South America, Europe, and Africa11,12. Like many temperate insects, temperate populations of A. albopictus survive through winter by entering a type of dormancy referred to as photoperiodic diapause. In A. albopictus, exposure of pupal and adult females to short (autumnal) day lengths leads to the production of diapause eggs in which embryological development is completed, but the pharate larva inside the chorion of the egg enters a developmental arrest that renders the egg refractory to hatching stimulus15&#8211;17. Diapause eggs are more desiccation resistant5,18 and contain more total lipids19 than non-diapause eggs. Photoperiodic diapause in A. albopictus is thus a maternally controlled, adaptive phenotypic plasticity that is essential for surviving the harsh conditions of winter in temperate environments. Despite the well-understood ecological significance of photoperiodic diapause in a wide range of insects20,21, the molecular basis of this crucial adaptation is not well characterized in any insect22. In organisms such as A. albopictus that undergo an embryonic diapause at the pharate larval stage, it remains a particularly compelling challenge to understand how the photoperiodic signal received by the mother is passed to the offspring and persists through the course of embryonic development to cause arrest at the pharate larval stage.
This protocol describes mosquito rearing, experimental design and bioinformatics analyses for NGS experiments (transcriptome sequencing) performed to elucidate transcriptional components of photoperiodic diapause in A. albopictus. This protocol can be used for additional studies of diapause in A. albopictus, can be adapted to investigate diapause in other closely related species such as other aedine mosquitoes that undergo egg diapause23, and is also more generally relevant to employing NGS approaches to study the transcriptional bases of any complex adaptation in any insect.

<table><tbody><tr><td>Incubator - Model 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Controlled environment room</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Walk-in controlled environment room built to custom specifications by Thermax Scientific Products. A larger alternative to an incubator. http://thermmax.com/</td></tr><tr><td>Cool Fluorescent bulb</td><td>Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Petri Dish 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper 20.5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>9.5 L Bucket</td><td>Plastican</td><td>Bway Products</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utility Fabric-Mosquito Netting White</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Orthopedic stockings</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>product no. 081420</td></tr><tr><td>Organic Raisins</td><td>Newman&#039;s Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Oviposition cups (brown)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>The product is actually an amber 125 ml bottle that we saw the top off of.</td></tr><tr><td>Recycled Paper Towels</td><td>Seventh Generation</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Modular Mates Square Tupperware Set</td><td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td>Glass Grinder</td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>These Tenbroeck tissue grinders break the eggs and release RNA into the TRI Reagent.</td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Apply 1 ml TRI Reagent per 50-100 mg of tissue. Caution &amp;#8212; this reagent is toxic.</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>This kit generates greater yield than traditional DNase treatment followed by phenol/chloroform cleanup, and it is simpler to use.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Apply liberally on the bench surfaces and any equipment that might be in contact with the RNA samples. The solution is slightly alkaline/corrosive, can cause irritation and is harmful when swallowed.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Place up to 12 RNA samples on one chip.</td></tr><tr><td>Hemotek Membrane Feeder</td><td>Hemotek&amp;nbsp;</td><td>5W1</td><td>This system&amp;nbsp; provides 5 feeding stations that can be used simultaneously. Includes PS5 Power Unit and Power cord; 5 FUI Feeders + Meal Reservoirs and O-rings; Plastic Plugs, Hemotek collagen feeding membrane; Temperature setting tool; and Plug extracting tool. The company&#039;s mailing address is: Hemotek Ltd; Unit 5 Union Court; Alan Ramsbottom Way; Great Harwood; Lancashire, UK; BB6 7FD; tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Digital Thermometer and Probe</td><td>Hemotek&amp;nbsp;</td><td>MT3KFU</td><td>MicroT3 thermometer and KFU probe. This is used to set the temperature of each FUI feeding unit.</td></tr><tr><td>Chicken Whole Blood, non-sterile with Sodium Citrate</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>The 500 ml of blood were frozen and stored in 20 ml aliquots at -80 &amp;#176;C for up to 1 year. Thaw blood at room temperature for at least 1 hr before using.</td></tr></tbody></table>

an experimental and bioinformatics protocol for rna-seq analyses of photoperiodic diapause in the asian tiger mosquito, aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

Fluorometrie zweier repräsentativer RNA Proben zeigten zwei Banden bei ca. 2000 nt (1A, B). Das Insekt 28S ribosomale RNA aus zwei Polynucleotidketten durch Wasserstoffbrücken, die sich leicht durch kurzes Erhitzen oder Agenten, die Wasserstoffbrückenbindungen 35 stören gestört zusammengehalten zusammen. Die resultierenden beiden Komponenten ungefähr die gleiche Größe wie der ribosomalen RNA 18S. Die zweite RNA-Probe zeigte eine hohe Abbauwerte (1B). Photoperiodische Behandlung von einer repräsentativen Gruppe von A. albopictus Moskitos zu hohen Diapause Einfalls Kurztag- aufgezogenen Mücken und niedrige Diapause Einfalls Langtagbedingungen aufgezogenen Mücken, obwohl es einige Unterschiede zwischen den Replikaten (Tabelle 2). Zum Beispiel replizieren SD2 zeigt niedriger (80%) Diapause Inzidenz als die übrigen Replikate (87,18% - 97,67%). Das Replikat hatte auch die kleinsten sampl<html> e Größe, so empfiehlt es sich, um eine ausreichende Anzahl von Eiern (&gt; 150) für die Messung der Diapause, um ein genaues Ergebnis zu erhalten, aufgehoben. Post-Sequenzierung lesen Reinigung auf einer repräsentativen Bibliothek von Erwachsenen A. albopictus Weibchen entfernt eine erhebliche Anzahl von Lesevorgängen (von 83.853.322 auf 52.736.065 Gesamt liest für einen Vertreter Bibliothek). Digitale Normalisierung weiter reduziert die Anzahl der gesamten liest zu 41.435.934. Ein Trinity Montage von diesen liest erzeugt 76.377 Contigs, mit einem N50 von 1879, mittlere Fläche zu Länge von 1.023,1 und eine maximale Fläche zu Länge von 20.892 (Abbildung 3). Differential Expressionsanalysen von einem ähnlichen Arbeitsablauf von Embryonen unter Diapause induzierenden Bedingungen bei 11 und 21 Tage nach der Eiablage ergab 3.128 differenziell exprimierte Gene zwischen diesen beiden Zeiträumen (4) aufgezogen. /ftp_upload/51961/51961fig1highres.jpg &quot;Breite =&quot; 600 Pixel &quot;/&gt; Abbildung 1: Fluorometrie Profile von Beispiel hochwertige (A) und von geringer Qualität (B) RNA Extraktionen von A. albopictus. Die x-Achse repräsentiert die Größe der Nukleotid-Fragmente, und die y-Achse stellt die Fluoreszenzmesswerte. Man beachte den Unterschied in der Y-Achsenskala zwischen den Tafeln (A) und (B). Pfeile markieren die Positionen der verschiedenen ribosomalen RNAs. Die scheinbaren Bands in der Nähe des grünen Markierungsband zeigen Abbau. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/51961/51961fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Zusammenfassung der Bioinformatik-Workflow von der Vorbereitung bis zur gelesen differentielle Expression Jedes Kästchen stellt einen Schritt in die Bioinformatik Abschnitt dieses Protokoll, begleitet von der entsprechenden Anzahl von einzelnen Protokolle Schritt.. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51961/51961fig3highres.jpg" /> Abb. 3: Histogramm der Fläche zu Längen von einer Trinity de novo Transkriptom Montage Die durchschnittliche Fläche zu Länge beträgt 1.023,1. Beachten Sie, dass die Verteilung der Fläche zu Länge ist stark verzerrt zu kürzeren Contigs; Dies ist typisch für de novo Transkriptom Montage. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/51961/51961fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Melden Sie 2 fach Wechsel vs. Fülle von TMM-normalisierten Genexpression Diapause pharate Larven auf 11 Tage vs. 21 Tage nach der Eiablage Jeder Punkt bezeichnet eine Unigene;. differentiell exprimierten unigenes sind rot. Unigenes mit höhere Expression um 11 Tage nach der Eiablage positive fach-Werte ändern, in demals unigenes mit höheren Ausdruck 21 Tage nach der Eiablage negative fold change Werte. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Programm / Ressourcen </td><td> Website URL (abgerufen 2014.01.13) </td></tr><tr><td> perl </td><td> http://www.perl.org/get.html </td></tr><tr><td> Python </td><td> http://www.python.org/download/ </td></tr><tr><td> ssaha2 </td><td> http://www.sanger.ac.uk/resources/software/ssaha2/ </td></tr><tr><td> NCBI UniVec Kern </td><td> ftp://ftp.ncbi.nih.gov/pub/UniVec/UniVec_Core </td></tr><tr><td> SolexaQA </td><td> http://solexaqa.sourceforge.net/ </td></tr><tr><td> FastQC </td><td> http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ </td></tr><tr><td> khmer </td><td> https://github.com/ged-lab/khmer </td></tr><tr><td> Dreieinigkeit </td><td> http://trinityrnaseq.sourceforge.net/ </td></tr><tr><td> DreieinigkeitNormalisierung Skript </td><td> http://trinityrnaseq.sourceforge.net/trinity_insilico_normalization.html </td></tr><tr><td> Assemblathon 2 Auswertungsskripte </td><td> https://github.com/ucdavis-bioinformatics/assemblathon2-analysis </td></tr><tr><td> BLAST + (die makeblastdb und blastx umfasst) </td><td> ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ </td></tr><tr><td> Zeilenumbruch </td><td> https://code.google.com/p/linebreak/ </td></tr><tr><td> RSEM </td><td> http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/ </td></tr><tr><td> Edger Benutzerhandbuch </td><td> http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf </td></tr><tr><td> R </td><td> http://www.r-project.org/ </td></tr><tr><td> Edger </td><td> http://www.bioconductor.org/packages/2.13/bioc/html/edgeR.html </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Programme und Ressourcen für t eingesetzter Bioinformatik Verfahren in diesem Protokoll. URLs aufgelistet sind den einfachen Zugriff auf jeden der in diesem Protokoll erforderlichen Ressourcen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Behandlung </td><td> Wiederholen </td><td> Anzahl der Eier vom 1. Luke </td><td> Anzahl der Eier vom 2. Luken </td><td> Nr embryonierten, nicht geschlüpften Eier </td><td> % Diapause </td></tr><tr><td> SD </td><td> 1 </td><td> 10 </td><td> 0 </td><td> 68 </td><td> 87,18 </td></tr><tr><td> SD </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 12 </td><td> 80,00 </td></tr><tr><td> SD </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 42 </td><td> 97,67 </td></tr><tr><td> SD </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 0 </td><td> 46 </td><td> 90,20 </td></tr><tr><td> SD </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 0 </td><td> 79 </td><td> 92,94 </td></tr><tr><td> LD </td><td> 1 </td><td> 79 </td><td> 4 </td><td> 9 </td><td> 9,78 </td></tr><tr><td> LD </td><td> 2 </td><td> 28 </td><td> 0 </td><td> 4 </td><td> 12,50 </td></tr><tr><td> LD </td><td> 3 </td><td> 92 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6.06 </td></tr><tr><td> LD </td><td> 4 </td><td> 30 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 14,29 </td></tr><tr><td> LD </td><td> 5 </td><td> 43 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 6,52 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Diapause Inzidenz Berechnungen Ergebnisse aus fünf Wiederholungen pro Photoperiode von Diapause Inzidenz Berechnungen. Die Zahl der geschlüpften Larven von zwei verschiedenen Schraffuren sind enthalten, ebenso wie die Zahl der nicht-schraffierten, embryonierten Eiern, die alle notwendig, Diapause Inzidenz berechnen sind.

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An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

13.2K Aufrufe.  Georgetown University. RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data. 

Serie: An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Forschung

Biologie

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

Umwelt

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of individual cell populations often makes it difficult to obtain enough material for molecular studies. For example, the accessory gland of the Drosophila male reproductive system contains two distinct secretory cell types. The main cells make up 96% of the secretory cells of the gland, while the secondary cells (SC) make up the remaining 4% of cells (about 80 cells per male). Although both cell types produce important components of the seminal fluid, only a few genes are known to be specific to the SCs. The rarity of SCs has, thus far, hindered transcriptomic analysis study of this important cell type. Here, a method is presented that allows for the purification of SCs for RNA extraction and sequencing. The protocol consists in first dissecting glands from flies expressing a SC-specific GFP reporter and then subjecting these glands to protease digestion and mechanical dissociation to obtain individual cells. Following these steps, individual, living, GFP-marked cells are sorted using a fluorescent activated cell sorter (FACS) for RNA purification. This procedure yields SC-specific RNAs from ~40 males per condition for downstream RT-qPCR and/or RNA sequencing in the course of one day. The rapidity and simplicity of the procedure allows for the transcriptomes of many different flies, from different genotypes or environmental conditions, to be determined in a short period of time.

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Here, we present a protocol to dissociate and sort a specific cell population from the Drosophila male accessory glands (secondary cells) for RNA sequencing and RT-qPCR. Cell isolation is accomplished through FACS purification of GFP-expressing secondary cells after a multistep-dissociation process requiring dissection, proteases digestion and mechanical dispersion.

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Genetik

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, morphology, and behavior drastically from aquatic larvae to terrestrial/aerial adults without pupal stage. Odonata adults have a well-developed color vision and show a remarkable diversity in body colors and patterns across sexes, stages, and species. While many ecological and behavioral studies on Odonata have been conducted, molecular genetic studies have been scarce mainly due to the difficulty in applying gene functional analysis to Odonata. For instance, RNA interference (RNAi) is less effective in the Odonata, as reported in the Lepidoptera. To overcome this problem, we successfully established an RNAi method combined with in vivo electroporation. Here we provide a detailed protocol including a video of the electroporation-mediated RNAi method as follows: preparation of larvae, species identification, preparation of dsRNA/siRNA solution and injection needles, ice-cold anesthesia of larvae, dsRNA/siRNA injection, in vivo electroporation, and individual rearing until adult emergence. The electroporation-mediated RNAi method is applicable to both damselflies (suborder Zygoptera) and dragonflies (suborder Anisoptera). In this protocol, we present the methods for the blue-tailed damselfly Ischnura senegalensis (Coenagrionidae) as an example of damselfly species and the pied skimmer dragonfly Pseudothemis zonata (Libellulidae) as another example of dragonfly species. As representative examples, we show the results of RNAi targeting the melanin synthesis gene multicopper oxidase 2. This RNAi method will facilitate understanding of various gene functions involved in metamorphosis, morphogenesis, color pattern formation, and other biological features of Odonata. Moreover, this protocol may be generally applicable to non-model organisms in which RNAi is less effective in gene suppression due to the inefficiency and low penetrance.

We provide a detailed protocol for electroporation-mediated RNA interference in insects of the order Odonata (dragonflies and damselflies) using the blue-tailed damselfly (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) and the pied skimmer dragonfly (Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzmethode in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...

Entwicklungsbiologie

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay in Adult Female<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Moskitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Köpfe

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with an attractive off-target profile at both cellular and organismal levels. It is recently reported that the CRISPR/CasRx system can be used to achieve ubiquitous and tissue-specific gene transcript reduction in Drosophila melanogaster. This paper details the methods from the recent work, consisting of three parts: 1) ubiquitous&#160;in vivo endogenous RNA targeting using a two-component CasRx system; 2) ubiquitous in vivo exogenous RNA targeting using a three-component CasRx system; and 3) tissue-specific in vivo RNA targeting using a three-component CasRx system. The effects of RNA targeting observed include targeted gene specific phenotypic changes, targeted RNA transcript reduction, and occasional lethality phenotypes associated with high expression of CasRx protein and collateral activity. Overall, these results showed that the CasRx system is capable of target RNA transcript reduction at the organismal level in a programmable and efficient manner, demonstrating that in vivo transcriptome targeting, and engineering is feasible and lays the foundation for future in vivo CRISPR-based RNA targeting technologies.

Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

This article outlines a detailed protocol for using the RNA-targeting Cas13D enzyme (RfxCas13D) in flies.

Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Immunologie und Infektion

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus on one or more gene families that are significant to the organism and study. In this protocol, we outline bioinformatic steps to generate a phylogeny and to quantify the expression of genes of interest. Phylogenetic trees can give insight into how genes are evolving within and between species as well as reveal orthology. These results can be enhanced using RNA-seq data to compare the expression of these genes in different individuals or tissues. Studies of molecular evolution and expression can reveal modes of evolution and conservation of gene function between species. The characterization of a gene family can serve as a springboard for future studies and can highlight an important gene family in a new genome or transcriptome paper.

The purpose of this protocol is to investigate the evolution and expression of candidate genes using RNA sequencing data.

Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Eine experimentelle und Bioinformatik-Protokoll für die RNA-seq Analysen der Photoperiodische Diapause in den asiatischen Tigermücke,

Zusammenfassung

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Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Ein FACS-basiertes Protokoll zur Isolierung von RNA aus den Sekundärzellen der Drosophila Male Accessory Dlands

Elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzmethode in Odonata

RNAi-vermittelte Gen-Knockdown und

Reinigung von Transcripts und Metaboliten aus

Ubiquitäres und gewebespezifisches RNA-Targeting in Drosophila Melanogaster mittels CRISPR/CasRx

Physiologische Aufnahmen und RNA-Sequenzierung der gustatorischen Anhangsgebilde der Gelbfieber-Moskito-

RNAi-Trigger Lieferung in

Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq