The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Anmerkung: Die Herstellung von Mikrofluid-Vorrichtung ist nicht notwendig, diesen Assay als Tröpfchen für dieses Protokoll mit vorhandenen kommerziellen Tropfenträgern 23,29 gebildet werden. 1. Stellen Sie die Tröpfchenbildungs ​​Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Vorbereitung Vorlagenform für die Kanäle mit der SU-8 Master Fabrication Protokoll dargelegt zuvor 31, aber mit einem Tröpfchengenerator Maskenmuster 32. </li><li> Fertigen Geräte in PDMS mit den Techniken der Softlithographie 32,33. </li></ol> 2. Bereiten Sie Reaction Mix für Schütt Droplet Anzeige Hinweis: Das Protokoll kann verwendet werden, um Nukleinsäuren unter Verwendung vieler Arten von Amplifikationsreaktionen zu quantifizieren. Als Beispiel werden die Reagenzien für MDA benötigt mehrerer Lambda DNA-Konzentrationen angegeben. Reagenz Einzelheiten sind in der Tabelle mit den spezifischen Reagenzien aufgeführt. Die Verteilung der Vorlage in den Tröpfchen hängt sufficient Mischen der Probe. <ol><li> Zu erhalten oder zu reinigen Phi29 DNA-Polymerase. <ol><li> Reinige Phi29 wie zuvor beschrieben 7 oder Kauf von Lieferanten. Die für die gezeigten Experimente verwendet Phi29 gereinigt. </li></ol></li><li> Herstellung von 10 ml Denaturierungspuffer aus 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA und 14 mM DTT. </li><li> Herstellung von 10 ml Neutralisierungspuffer aus 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0, und 9 mM Tris-Cl pH 8,0. </li><li> Bereiten Sie zwei Standards, einen Leerwert-Kontrolle (NTC), wie Nuklease-freies Wasser, und eine High-Vorlage Konzentration (ungefähr 4 pg / ul Lambda DNA). Denaturieren 3,3 ul jeder Standard mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Quench mit jeweils 3,3 ul Neutralization Buffer. </li><li> Denaturieren 3,3 ul der Vorlage von Interesse mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. Es wird mit 3,3 &amp; mgr;Neutralisierungspuffer. </li><li> Bereiten Sie 11 ul des Master-Gemisch pro Probe auf Eis. Die 2x MDA Reaktionsmastermischung besteht aus 2x Doppelstrang-DNA (dsDNA) bindenden Farbstoff, 2x qPCR Referenzfarbstoff, 50 uM randomisiert Oligo, 2 mg / ml BSA, 2x Phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 4,8 mM dNTPs, Nuklease-freies Wasser und 40 ug / ml Phi29 DNA-Polymerase. In Phi29 DNA-Polymerase, um den letzten Polymerase nicht begegnen pH-Werte viel höher oder niedriger als 7.5.Mix auch zu gewährleisten. </li><li> Optional: Für weniger False Positives, aussetzen Master-Mix mit UV-Licht vor der Bildung von Tröpfchen 34. <ol><li> Bereiten Sie 10 ul der Vormischung pro Probe in einem 0,5 ml oder 1,5 ml klare Röhrchen auf Eis. Die Vormischung besteht aus 55 &amp; mgr; M randomisiert Oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x Phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 5,3 mM dNTPs und Nuklease-freies Wasser. </li><li> Das Röhrchen wird in Wasser auf Eis, wie beschrieben, 34 und setzen mit UV-Licht (254 nm) mit einem Akku-sammelten Dosis von 5,7 J / cm 2. </li><li> Hinzufügen dsDNA-bindenden Farbstoff auf 1x, Referenzfarbstoff auf 1x und Phi29 bis 40 &amp; mgr; g / ml in der Vormischung. Gut mischen. </li></ol></li><li> Kombinieren Sie 10 ul der denaturierten Vorlage oder Standard und 10 ul Stammmischung. Gut mischen. </li></ol> 3. Tropfenbildung Hinweis: Tröpfchen kann sehr empfindlich auf statische Elektrizität und die Scherspannung zu sein. Kleidung, die statische Elektrizität verursachen können, zu entfernen, und erden Sie sich vor der Bildung von Tröpfchen. Griffrohre der Emulsion aus dem oberen Ende der Röhre so weit aus der Emulsion wie möglich. Pipetten-Emulsionen sehr langsam, vorzugsweise mit einer großen Bohrung Pipettenspitze. Bei der Abgabe von einem Pipettenspitze, beobachten Sie die Emulsion auf der Seite der Spitze, um Pipettiergeschwindigkeit bestimmen. <ol><li> Form Tröpfchen. Für die Experimente gezeigt, hat der Mikrofluidvorrichtung einen Öleinlass und zwei wässrige Einlässe mit einem Fluss-Fokussierung Übergang zur Erzeugung von Tröpfchen. Verwenden Sie zwei syringe Pumpen, um die Durchflussmengen von 55 ul Öl mit Tensid und einem 20 ul Reaktionsgemisch durch den mikrofluidischen Chip steuern zu 20.000 1 nl Tröpfchen zu erzeugen. </li><li> Anmerkung: Es ist möglich, Tröpfchen mit vielen Arten von Öl mit Tensid zu erzeugen, aber die Zusammensetzung wird Tröpfchenstabilität stark beeinflussen bei hohen Temperaturen und über die Zeit. Eine mögliche Kombination ist fluoriertes Öl HFE 7500 mit einem anionischen Tensid 19,35. </li><li> Erzeugen Tröpfchen in jeder Größe mit einem beliebigen Verfahren 13,36, sondern die Formatvariabilität der Tröpfchenpopulation wird den Groß Fluoreszenz und somit die Genauigkeit des Tests beeinträchtigen. Für die gezeigten Experimente waren monodisperse Tröpfchen mit einem Volumen von 1 nl. </li><li> Sammeln Sie alle der Tröpfchen und Öl in PCR-Röhrchen. Für jede Probe wurden 30 ul Aliquots von Öl in frischen PCR-Röhrchen mit Optokappen und übertragen 20 ul von Tropfen auf der Oberseite des Öl. Die konsistente Volumen sicherzustellen, der Assay als ackuratieren wie möglich. </li><li> Schließen Leitung Kopf fest, als lose Kappen wird das Öl zu verdampfen. </li></ol> 4. isothermen Amplifikation <ol><li> Unter Verwendung eines PCR-Thermocycler, qPCR Thermocycler oder Heizplatte, Inkubation der Proben bei 30 ° C für 7 h und inaktivieren für 1 min bei 75 ° C. Die Rohre der Tröpfchen können in einem Kühlschrank mit einer Folie für ein paar Stunden an dieser Stelle abgedeckt gelassen werden. </li></ol> 5. Datenerfassung und Auswertung <ol><li> Unmittelbar nach der Reaktion Inaktivierung, messen Farbstofffluoreszenz Ebenen für alle Proben mit der qPCR Thermocycler. Optimalen Filtereinstellungen werden auf die Farbstoff Anregungs- und Emissionsspektren ab. Für dieses Beispiel verwenden Sie die 492 nm-516 nm-Filter für die dsDNA-bindenden Farbstoff gesetzt und die 585 nm-610 nm-Filter für die Referenzfarbstoff eingestellt. Andere Fluoreszenzmesstechniken verwendet, um die Fluoreszenz zu quantifizieren. </li><li> Für jede Probe, die Trägerfluoreszenzintensität des dsDNA-bindenden Farbstoffdie Fluoreszenzintensität der Referenzfarbstoff. Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz, oder die normalisierte Fluoreszenz des Leerwert-Kontrolle, von allen Proben. </li><li> Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der korrigierten Fluoreszenzmessungen von den Standards. Der NTC-Standard ist der Fluoreszenz einer Probe mit 0% fluoreszierenden Tröpfchen (&quot;alle negativ&quot;) und die Hoch Matrizenkonzentration Fluoreszenzmessung ist die erwartete Fluoreszenz für eine Probe mit 100% Fluoreszenz Tröpfchen (&quot;alle positiv&quot;). Verwendung der entsprechenden Standardkurve vorherzusagen, die Zwischenverhältnisse der positiven und negativen Tröpfchen auf der Grundlage ihrer Groß Fluoreszenz. </li></ol> 6. Producing Droplets für Proof-of-Principle-Messungen <ol><li> Stellen Fluoreszenz (positiv) Tröpfchen: Vorbereiten eines PCR-Reaktionsgemisch, bestehend aus 0,1 ng Lambda-DNA, 1x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1x Referenzfarbstoff, 1,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP und 0,5 uM Primer. Thermozyklus der Mischung 30-mal (95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min), dann bilden Tröpfchen wie oben beschrieben. </li><li> Stellen nicht-fluoreszierenden (negativ) Tröpfchen: Vorbereiten eines PCR-Reaktionsgemisch, bestehend aus 1x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1x Referenzfarbstoff, 1,5 Einheiten Taq DNA Polymerase, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM dNTP, und 0,5 &amp; mgr; M Primer. Thermozyklus die Mischung 30-mal (95 ° C für 20 sec, 55 ° C für 20 sec, 72 ° C für 1 min), dann bilden Tröpfchen. </li><li> Bilden vorgemischten Tröpfchenverhältnisse <ol><li> Verteilen Sie 20 ul fluorierte Öl in qPCR Rohre, Deckel mit einem optischen Kappe, um Verdunstung zu verhindern. </li><li> Gently Pipette 10 ul der gut gemischten Tröpfchen in gewünschten Positiv: Negativ-Verhältnisse an der Spitze des Öls. In den gezeigten Ergebnissen, positiv: negativ waren Tröpfchenverhältnisse 1 (alle positiv), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 und 0 (alle negtive). </li></ol></li><li> Messen Farbstofffluoreszenz Ebenen für alle Proben mit der qPCR Thermocycler. Für dieses Protokoll, verwenden Sie die 492 nm-516 nm-Filter für die dsDNA-bindenden Farbstoff gesetzt und die 585 nm-610 nm-Filter für die Referenzfarbstoff eingestellt. <ol><li> Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz. Weitere Normalisierung durch die Fluoreszenz des &quot;alle positiven&quot; Probe. </li></ol></li><li> Erstellen Sie eine lineare Standardkurve unter Verwendung der normierten Fluoreszenzmessungen von den &quot;alle positiv&quot; und &quot;aller negativen&quot; Proben. Verwendung der entsprechenden Standardkurve vorherzusagen, die Zwischenverhältnisse der positiven und negativen Tröpfchen auf der Grundlage ihrer Groß Fluoreszenz. </li><li> Das Experiment wiederholt für jedes Verhältnis (n = 3) mit unabhängigen Tröpfchenbildung und Mischen für jede Wiederholung. </li></ol> 7. Proof-of-Principle MDA Experiment <ol><li> Messen Sie die Konzentration von Lambda DNA-Stammlösung mit einer specphotometer. <ol><li> Berechnen Sie die Template-Konzentration notwendig, um durchschnittlich 10 Templatmoleküle pro Tröpfchen. Aus diesem Protokoll annehmen Tropfenvolumen sind 1 nl und 1 ng des Lambda-DNA enthält etwa 1,9 × 10 7 Kopien. Daher werden 10 Vorlagen pro Tröpfchen 10 Kopien pro nl oder 526 fg Lambda DNA pro ul sein. Die Vorlage wird verdünnt werden ~ 6x, wenn Tröpfchen gebildet werden, damit die ursprüngliche Vorlage höchsten Konzentration 3,2 pg / ul sein. </li></ol></li><li> Seriell verdünnt das Lambda DNA auf 3,2 pg / ul mit Denaturierungspuffer und gleichen Volumen Neutralization Buffer. Für einen Verdünnungsfaktor von 0,1, zu kombinieren 10 ul Probe mit 45 ul Denaturierungspuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. In 45 lL Neutralisierungspuffer zu stillen. </li><li> Weiteren Verdünnung der Probe wie in Schritt 7.2 beschrieben, um den Rest der Proben für den Versuch zu machen. Die anfänglichen Vorlage Konzentrationen in den Reaktionen gezeigt, waren 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg und fg 1,6 pro Mikroliter. Hinweis: Die endgültige Vorlage Konzentrationen nach Mastermix Zusätzlich waren 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag und 263 ag pro Mikroliter. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 und 0,005 erwarteten Lambda Kopien pro Tröpfchen auf. </li><li> Generierung und Analyse Tröpfchen aus jeder Probe wie in Schritten von 2,5 bis 5,3 beschrieben. </li><li> Erwerben Sie die gezeigten Fluoreszenzbilder (Abbildung 2,3) mit einer Digitalkamera montiert auf eine Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop mit einer 10-fach Objektiv bei RT. Erwerben zwölf Sichtfelder für jede Probe. Correct Fluoreszenzbilder durch ein Hintergrundbild mit einer Leuchtstoffschieber erhalten. </li><li> Verwenden Sie einen enthaltenen Kammer zur Abbildung 37, wie die Emulsion Öl wird schnell verdunsten. </li><li> Analysieren Sie einzelne Tröpfchen Intensitäten unter Verwendung eines ImageJ Makro (Supplemental Code-Datei). <ol><li> Wählen Sie einen Schwellenwert Fluoreszenzintensität, die am besten trennt nicht fluoreszierenden Tröpfchen in der NTC-Bilder von den fluoreszierenden Tröpfchen in den Hoch Matrizenkonzentration Bilder. Für jede unbekannte Probe, die Berechnung der Bruchteil der Tropfen mit einem Fluoreszenz-Intensität oberhalb der Schwelle. </li></ol></li></ol> 8. PCR und MDA Groß Reaktionen <ol><li> Bereiten PCR-Reaktion. <ol><li> Seriell verdünnt Matrizen-DNA mit einem Verdünnungsfaktor von 0,1. Für jede Verdünnung, zu kombinieren 10 ul-Vorlage mit 45 &amp; mgr; l Denaturierungspuffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 3 min. Kombinieren Sie die Verdünnung mit 45 &amp; mgr; l Neutralization Buffer. </li><li> Es werden 20 &amp; mgr; l PCR-Mastermix pro Probe. Die PCR-Reaktion 1,1x Stammischung besteht aus 60 Einheiten / ul Taq DNA-Polymerase, 11 mM Tris-HCl, 55 mM KCl, 1,65 mM MgCl 2, 0,22 mM dNTP, 1,1 x dsDNA-bindenden Farbstoff, 1,1x Referenzfarbstoff und 550 nM jeder Primer. </li><li> Kombinieren Sie 2 ul verdünnt Vorlage und 20 ul Mastermix. Hinweis: Die endgültige Vorlage Konzentrationen in ter Reaktionen gezeigt PCR waren 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag und 0 g Lambda-DNA pro Mikroliter und wurden dreifach durchgeführt. </li><li> Thermozyklus PCR-Reaktion in qPCR-Maschine mit dem folgenden Programm. Laufen 40 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 57 ° C für 20 sec, 72 ° C für 30 s, bevor 2 min bei 72 ° C für 2 Minuten und Halten bei 4 ° C. </li><li> Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz vor der weiteren Analyse. </li></ol></li><li> Bereiten MDA Reaktion. <ol><li> Verdünnte Proben wie in Schritt 8.1.1 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie 11 ul des Master-Gemisch pro Probe auf Eis. Die 2x MDA Reaktionsmastermischung besteht aus 2x dsDNA-bindenden Farbstoff, 2x Referenzfarbstoff, 50 uM randomisiert Oligo, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA Polymerase Reaktionspuffer, 4,8 mM dNTPs, Nuklease-freies Wasser, und 40 ug / ml phi29 DNA-Polymerase. </li><li> Fügen Sie den Phi29 DNA-Polymerase, um 40 ug / ml reicht, um die Polymerase d sicherzustellen,oes nicht begegnen pH-Werte viel höher oder niedriger als 7,5. Gut mischen. </li><li> Denaturieren 3,3 &amp; mgr; l verdünnt Vorlage mit 3,3 ul Denaturierungspuffer in einem qPCR Rohr. Inkubieren bei Raumtemperatur für 3 min. 3.3 ul Neutralization Buffer. </li><li> Mähdrescher 10 ul der denaturierten Template und 10 ul der Stammmischung. Gut mischen. </li><li> Führen MDA Reaktion in qPCR-Maschine mit dem folgenden Programm. </li><li> Halten bei 30 ° C für 4 Stunden, messen Fluoreszenz jedes 7,5 min. </li><li> Inaktivierung bei 75 ° C für 1 min. </li><li> Normalisieren dsDNA Bindungsfarbstofffluoreszenz unter Verwendung von Referenzfarbstofffluoreszenz. Weiter normalisiert durch die maximale Fluoreszenz für jede Probe. </li></ol></li></ol>

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The Broad Institute may move to file a patent application that includes aspects of this work.

Digital Assays sind leistungsfähige Methoden, die den Nachweis von seltenen Zellen und Zählen der einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digital Assays sind noch nicht routinemäßig in analytischen Labors zu den Kosten von Spezialausrüstung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden angewendet, die teilweise. Hier beschreiben wir einen Endpunkt digitalen Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten analogen Auslese Verwendung eines Standard quantitative Echtzeit-PCR-Maschine. Diese Methode ist schnell zu Set-up, und das Auslesen ist viel einfacher als Tröpfchen Zählverfahren. Unser Test verliert das Einzelmolekül (Single-Tröpfchen) Empfindlichkeit einzelner Tröpfchen Messungen für die Einfachheit der Massen-Endpunkt-Messung unter Verwendung von Standard-Instrumentierung. In unserer digitalen MDA Experiment konnten wir nicht unterscheiden, weniger als 1 positive Tröpfchen pro 200 negativen Tröpfchen aus Hintergrund, trotz Bestätigung durch Fluoreszenzmikroskopie, die das tatsächliche fraRésol positiver Tröpfchen als erwartet (Abbildung 4). Die Empfindlichkeit und den Hintergrund in der Masse Fluoreszenzmessgrenze der Empfindlichkeit der Massenmessung Assay für niedrige positive Tröpfchenfraktionen. Wenn höhere Empfindlichkeit erforderlich ist, wird ein digitales Auslese empfohlen. Unterschiede in der Ölstand oder Großtropfenvolumen kann großen Einfluss auf die Probe Fluoreszenzdaten. Auch die Normalisierung mit einem Referenzfarbstoff kann sich nicht entschließen, für die Unterschiede Ölmengen zu machen in der Fluoreszenz liest. Es ist möglich, dass die Optimierung Assayvolumen, instrument Erfassungsparameter, Mikrovertiefungsgeometrie oder optischen Filtern kann die Testqualität zu verbessern. Die Empfindlichkeit und den dynamischen Bereich des digitalen Groß Assays kann auch durch Optimierung der Partitionsgröße verbessert werden. Größere Tröpfchen ergeben eine größere Menge von fluoreszierenden Produkten aus jedem Template-Molekül, die helfen können, zu überwinden instrumentale Hintergrund und verbessert die Empfindlichkeit für niedrige Eingangskonzentrationen. Amdie andere Hand, kleinere Tröpfchen ermöglichen die Isolierung von mehr Moleküle pro Volumen untersucht. Wenn Matrizenkonzentration ist höchst unterschiedlich Proben können kleine und große Tröpfchen Reaktionen parallel durchgeführt, um den Assay dynamischen Bereich 39 erweitern. Mäßiger Tropfenvolumina sind auch für eine genaue Messung erforderlich ist. Viele kundenspezifische mikrofluidische Lösungen existieren für die rasche Bildung monodisperser Tropfen aus einer Probe, die beide in Serie 19,40 und parallel 41,42. Während nur wenige ermöglichen die Tröpfchenerzeugung aus mehreren getrennten Proben parallel würden einfache Modifikationen an bestehenden Konstruktionen für die gleichzeitige Erzeugung von Tröpfchen einer beliebigen Anzahl von Proben ermöglicht. Zum Beispiel kann die Bio-Rad ddPCR System 23 gilt gleichmäßigen Druck an den Einlässen aus einer Reihe von unabhängigen Tröpfchen Entscheidungsträger, ermöglicht die gleichzeitige Tröpfchenbildung von mehreren Proben. Unsere Großauslese Methodik greift SchlüsselVorteile der partitionierten digitalen Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung und dient zur quantitativen WGA gut geeignet. Hier, auf quantitative WGA, die sehr anfällig für Hintergrund Verunreinigungen konzentrierten wir aufgrund seiner fehlenden Sequenzspezifität 7. Darüber hinaus ist die unbekannten und möglicherweise breiter Molekulargewichtsverteilung der Produkte von der quantitativen Echtzeit-Assays WGA Interpretation erschweren in Anwendungen, bei denen die Anzahl der Originalvorlagen von Interesse ist. Digitale Assay Formatierung wendet sich sowohl diese Probleme. Verunreinigungen werden in den einzelnen Reaktions Partitionen enthalten sind, verhindern, dass die Dominanz von niedrigem Molekulargewicht von Analyten hochmolekularen Verunreinigungen, wie sie bei einem herkömmlichen Echtzeit-Assay erfolgen. In den 2B und 4B, mögliche Verunreinigungen, als helle Flecken innerhalb der Tröpfchen zu sehen ist, werden ausgesondert und nicht verstärken oder wesentlich zur Gesamtfluoreszenz. Ferner dasin digitaler Assays erzeugte Signal ist proportional zu der Anzahl von Vorlagen, nicht die Größe der Vorlagen oder ihrer Verstärkungsrate. Obwohl unsere Methode beruht auf Standards, um den Groß digitale Messung zu kalibrieren, die Verpflichtung zur Probe übereinstimmt und Standardeigenschaften können erheblich gelockert werden. Quantitative WGA wird häufig verwendet, um Verunreinigungen in WGA Reaktionen 7,34 quantifizieren und ist das empfindlichste Verfahren bekannt, um die Anwesenheit von DNA des unbekannten Sequenz zu quantifizieren, so dass die Methode sehr vielversprechend in der Anwendung so unterschiedlichen Bereichen wie der pharmazeutischen Qualitätskontrolle, Forensik und Astrobiologie. Großdigitalanzeige können andere digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR profitieren, durch die Beschleunigung, Parallelisierung und Vereinfachung Assay Auslesen.

Digitale Assays zur Nukleinsäurequantifizierung (digital PCR) 1-4 und Basis Ordnung (Sequenzierung) stark beeinflussen die Lebenswissenschaften und der Medizin. Digitale Assays stellen die Quantifizierung molekularer zählt auf einer absoluten Skala (nicht relativ zu einer Kontrolle) und bietet hohe Empfindlichkeit und ermöglicht einfache Vergleiche zwischen den Experimenten und entscheidend, so dass der Bau von großen Datenbanken mit vergleichbaren Daten 5 (Tabelle 1). Im Laufe der letzten 15 Jahre, Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) entstanden neben PCR als allgemeines Instrument für die Nukleinsäure-Amplifikation. Wie PCR ist WGA nützlich für analytische und präparative Anwendungen durch Verstärken Minute Probenelemente bis zu einer Höhe, die leicht nachgewiesen oder für spätere Analysen wie Basensequenzierung verwendet werden kann. Im Gegensatz zur PCR ist WGA nicht speziell auf eine bestimmte DNA-Locus, sondern ermöglicht Amplifikation aller Sequenzen in der Probe, einschließlich der unbekannten Sequenzen.Dieser fundamentale Unterschied zwischen der PCR und WGA macht die Verfahren zueinander komplementär und gibt Anlass zu verschiedenen Herausforderungen in ihrer Anwendung. Die hohe Ausbeute an WGA Reaktionen 6 ermöglicht Routine-Amplifikation von genomischer DNA aus einzelnen Molekülen 7. Einzelzellen 8 und andere niederBiomasseProben 9 für die Quantifizierung oder eine weitere Analyse. Die großen Herausforderungen mit WGA Chemie verbunden sind seine extreme Empfindlichkeit gegenüber Verunreinigungen und die ungleichmäßige Verstärkung über einzelne Templatmoleküle 6. Allerdings WGA ist an Popularität gewinnt als Single-Cell-Sequenzierung wurde als &quot;Killer-Applikation&quot; des WGA-Technologie 10 und Template-Quantifizierung durch WGA taucht ist in vielen Anwendungsbereichen 7 wichtig. Instrumentation für digitale Nukleinsäure Quantifizierung wurde zuvor in einer Vielzahl von mit Ventilen und ventillose mikrofluidischen forma beschriebents 11-14 einschließlich tröpfchenbasierten Assays 15,16 (Tabelle 2). , Kommerzielle mikrofluidische Systeme für die digitale Analyse erfordern jedoch Spezialausrüstung für die Reaktionsaufbau und Produkterkennung 17. Benutzerdefinierte Ventil versehenen Mikrofluidik sind flexibel, erfordern aber präzise Mikrofabrikation und pneumatischen Steuerungen 18. Während es relativ einfach ist, monodisperse Mikrotröpfchen zur Emulsionsbasis digitale Assays 19,20 zu machen, ist Digitalanzeige technisch aufwendig und erfordert entweder große Weitfeld-Bildgebung (ähnlich beliebten Next-Generation-Sequencing-Technologien) 21,22 oder High-Speed-Flow-basierte Tröpfchenerkennung 23-25. Im Idealfall, eine digitale Assay wäre einfach vom Set-up, um auszulesen, reduzieren die Notwendigkeit für komplexe Instrumentierung und so eine große Anzahl von Proben schnell ausgelesen werden. Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen von digitalen Tröpfchen Assays, die einen herkömmlichen Echtzeit-PCR verwendet instrument zur Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen. Für digitale WGA Assays für welche analoge Echtzeit-Amplifikationsassays (die ausgezeichnete Ergebnisse liefern für PCR) sind problematisch, besonders vorteilhaft, während der neue Ansatz kann auf digitale PCR-Assays angewendet werden, ist es. WGA gemeinhin Proben mit Templat-Molekülen, die unterschiedlich in Sequenz, Länge und Basengehalt angewandt. Diese unterschiedlichen Templat-Molekülen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit 6 verstärkt, was die Verwendung einer Referenz (&quot;standard&quot;) Probe mit passenden Eigenschaften. Oft ist eine solche Standard verfügbar sind oder die Eigenschaften der eingehenden Proben unbekannt sind. Die Heterogenität des Eingangsmaterials und längenabhängigen Eigenschaft des WGA-Chemie 26 die Interpretation der Ergebnisse erschweren auch durch die Schaffung von Mehrdeutigkeit, was wird quantifiziert - die Eingangsmasse, Eingangs Anzahl der Moleküle, die eine Kombination der beiden, oder auch nicht. Fsprünglich, die nicht-sequenz Spezifität macht quantitative mehrere Displacement Amplification (MDA) mehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen als quantitative PCR, da Schadstoffmoleküle einer beliebigen Sequenz haben ein Potential, sich einzumischen. Mikrofluidischen digitale Assays Adresse Kontamination durch Trennung Templatmoleküle und die Verringerung der Reaktionsvolumina, so dass weniger Schadstoffe abgetastet werden. Hier verwenden wir ein beliebtes isothermen WGA-Methode, MDA 27. Zu beachten ist, mehrere andere WGA Chemie einschließlich PicoPlex und MALBAC 28 hängen entscheidend von Anfangs isotherme Strangverdrängungsschritte. Isothermen Stufen verstärken die Herausforderung der Anwendung von analogen Echtzeit-Assays für die quantitative WGA. WGA weder vollständig während der Einrichtung verhindert werden, was zu unerwünschten variable Vorverstärkung, noch diskretisiert (&quot;getaktet&quot;) in einer Weise, wo die Replikation des heterogenen Moleküle vollständig durchgeführt und gestoppt werden, bevor der nächste Zyklus wie PCR 11 </sup&gt; (1). Ein digitales Testformat für WGA empfängt typische Reaktions Setup-Verfahren aufgrund der Segregation von jedem Molekül zur Zählung im Assayendpunkt (so Vorverstärkung beeinflußt die Treffer) Originalausleseeinrichtung Genauigkeit würde weitgehend unabhängig von Variationen in der Amplifikationseffizienz ist. Der Test ist abhängig von Tröpfchen in Öl mit einheitlichen Mengen hergestellt, wie der Signalpegel pro Tröpfchen in der Assay-Endpunkt wird auf dem Tröpfchenvolumen abhängen, und wir wollen nicht, dass die Konsistenz der Ergebnisse auf Mittelung über eine Verteilung der Tröpfchengrößen abhängen. Erstellen monodisperse Tröpfchen ist heute ein Standardverfahren (etwa 3.500 monodisperse Tröpfchen Papiere sind seit 2013 erschienen), erfordert aber mikrofluidischen Instrumentierung 25. In der Tat haben mehr als sechs Unternehmen entwickelt unabhängige kommerzielle Produkte, die auf die Produktion von solchen Tröpfchen verlassen und Tröpfchenherstellung mikrofluidischen Chipsim Handel erhältlich 23,29. Für diese Studie verwendeten wir kundenspezifische Mikrofluidvorrichtungen in-house (siehe Protokoll) hergestellt. Spritzenpumpen zu fahren Flusses durch die Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich, aber alternativ mit einem einzigen Einmalspritze zur Vakuum angetriebenen Strömungs substituiert werden, um die Kosten von 30 reduzieren.

<table><tbody><tr><td>Evagreen Dye</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td><td>New England Biotechnologies</td><td>B0269S</td><td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td></tr><tr><td>Lambda DNA</td><td>New England Biotechnologies</td><td>N3011S</td><td>Heated to 50 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C and quenched on ice prior to dilution</td></tr><tr><td>Randomized MDA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-NNNNN*N-3&#039;</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&amp;rsquo; and 5&amp;rsquo;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>UltraPure Nuclease-free water</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)</td></tr><tr><td>ROX reference dye</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR optical strip caps</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (25 micromolar each)</td><td>Agilent Technologies</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Barrier pipette tips</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad oil for evagreen</td><td>Bio-rad</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Digitale Assays sind leistungsfähige Methoden, die Detektion von seltenen Zellen und Zählung von einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digitale Assays noch nicht routinemäßig angewendet wird, aufgrund der Kosten und spezielle Ausstattung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen der digitalen Tröpfchentests unter Verwendung einer herkömmlichen Echtzeit-PCR-Instrument, um Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen. Wir charakterisieren die Leistung des Schüttauslese Assays unter Verwendung synthetischer Gemische Tröpfchen und Tröpfchen digitalen Multiple Displacement Amplifikation (MDA) Assay. Quantitative MDA besonders profitiert von einer digitalen Reaktions Format, aber unsere neue Verfahren gilt für alle digitalen Assay. Für etablierte digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR dient dieses Verfahren zu beschleunigen und zu vereinfachen Assay Auslesen. Unsere Großauslesemethode bringt die Vorteile der partitioned Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung. Die wichtigsten Einschränkungen des Schüttauslesemethode verglichen mit Tropfenzählen Plattformen und die Notwendigkeit für eine Standardprobe reduzierten dynamischen Bereich, wobei die Anforderungen an diese Norm sind weniger anspruchsvoll als für einen herkömmlichen Echtzeit-Experiments. Quantitative Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) wird verwendet, um für Kontaminanten in WGA Reaktionen testen und ist das empfindlichste Art und Weise, um die Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit unbekannten Sequenzen zu erkennen, was das Verfahren sehr vielversprechend in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen einschließlich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Astrobiologie.

Während herkömmliche Bulk / Echtzeit-Auslesen kann sowohl für quantitative PCR und quantitative Assays WGA (Figur 1) verwendet werden, digital quantitative Assays bieten Vorteile (Tabelle 1). In dem beschriebenen Verfahren ausgelesen wir digitalen Assays in Mikrotröpfchen-Format mit einer einfachen Schüttendpunktmessung (Abbildung 2). Während dieses Verfahren breit anwendbar, konzentrieren wir uns auf quantitative WGA (MDA), da dieses Verfahren stellt besondere Herausforderungen für herkömmliche Echtzeit-Assays. Um zu überprüfen, ob unsere Echtzeit-PCR-Instrument könnte unterschiedlicher Fraktionen von fluoreszierenden Mikrotröpfchen in Öl dispergiert zu erkennen, haben wir den Groß Fluoreszenz der synthetischen Mischungen von fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Tröpfchen (Abbildung 2). Der Groß Fluoreszenz und positive Tropfenzahl (unabhängig durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht) skaliert linear mit der Eingangsbruchteil der Leuchtstofftröpfchen, wie erwartet (Abbildung 3a). Das Experiment wurde dreimal durchgeführt, wobei unabhängig die Tröpfchenbildung und das Mischen für jeden Satz. Um die theoretischen Quantifizierung Leistung für &quot;unbekannt&quot; Proben zu bewerten, haben wir lineare Standardkurven unter Verwendung von ausschließlich positiven und völlig negative Kontrollproben. Mit solchen tröpfchenchargenspezifische Standardkurven, berechneten wir den Anteil der synthetischen positive und negative Tröpfchengemische auf Basis von jeder Probe Groß Fluoreszenz. Die Ergebnisse zeigen eine gute Leistung in Tröpfchenverhältnis Quantifizierung auf zwei Klotz des Dynamikbereichs (R 2 = 0,984; 3B). Die Eingangs Analytkonzentration wird leicht aus der Fraktion von positiven oder negativen Tröpfchen 38 berechnet. Um unsere Methode in einem echten quantitativen WGA-Test zu testen, maßen wir Fluoreszenzstufen und Bruchteil positive Tröpfchen einer digitalen Tröpfchen MDA-Test mit Lambda-DNA über einen wi<html> de Konzentrationsbereich (Abbildung 4). In 4B sind repräsentative Fluoreszenzbilder der Tröpfchen gezeigt. Sowohl Schütt Fluoreszenz und positive Tröpfchen Fraktion aus den digitalen Samples zu skalieren MDA wie bei der Mittelvorlage pro Tröpfchen zu erwarten, was darauf hinweist, dass der Großauslesegetreu Ergebnis auffangen eines digitalen Assay (R 2 = 0,927). Wir wiederholten das Experiment für jede Konzentration, unabhängige Bildung von Tröpfchen und Durchführung von WGA für jede Wiederholung. <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/52925/52925table1.jpg" /> Tabelle 1. Zusammenfassung der Echtzeit-und digitalen Assays. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52925/52925table1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> able2.jpg &quot;/&gt; Tabelle 2. Zusammenfassung der bestehenden Methoden zur Quantifizierung von Nukleinsäuren. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52925/52925table2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig1.jpg" /> Abbildung 1 quantitative Echtzeit-PCR und MDA von Lambda-DNA. MDA nicht durch Temperaturwechsel wie PCR diskretisiert, und ist anfällig für Vorverstärkung, wenn nicht sorgfältig auf Eis hergestellt. Dabei wurden quantitative PCR und MDA mit steigenden Konzentrationen von Lambda-DNA durchgeführt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52925/52925fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig2.jpg" /> Figure 2. Schematische Darstellung der analogen Auslese von Tröpfchen und repräsentativen Bilder. (A) Die positiven und negativen Tröpfchen wurden aus fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Reagenzien in einer Mikrofluidik-Vorrichtung generiert. Negativen Verhältnisse: Die Tröpfchen wurden in verschiedenen positiven vorgemischt. Großfluoreszenzwerte wurden mit einem Standard-Echtzeit-Thermocycler gemessen und Bruchteil des positiven Tröpfchen wurde durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. (B) Repräsentative fluoreszierenden überlagert Bilder der zunehmenden Verhältnissen von positiven Tröpfchen (Maßstab = 200 &amp; mgr; m). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52925/52925fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bulk-Fluoreszenz und Fluoreszenzanteil von Kombinationen von separat hergestellten positiven und negativen droplets. (A) Fluorescent (positiv) und nicht-fluoreszierenden (negativ) Tröpfchen wurden vorgemischt in unterschiedlichen Verhältnissen. Vergleich der Eingangsbruchteil des positiven Tröpfchen mit dem gemessenen Massenfluoreszenz und gemessene positive Tröpfchenanteil (n = 3, Balken repräsentieren +/- SD). Die punktierte Linie die erwartete Fluoreszenzfraktion bei einer linearen Beziehung. (B) Vergleich der vorhergesagten Verhältnisse auf Basis von Standards, um die erwartete Fluoreszenzeingangsfraktion. Die Linie zeigt die erwarteten Wert bei einer linearen Beziehung. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52925/52925fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52925/52925fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bulk-Fluoreszenz und Fluoreszenzbruchteil eines Tropfens digitale MDA-Test. Digitale MDA wurde mit incre geführtAsing Konzentrationen Vorlage Lambda DNA (n = 3, Fehlerbalken stellen SD) und gemessen, wie in 2A beschrieben. Die Linie zeigt die erwartete Fluoreszenz Fraktion unter Verwendung der Poisson-Verteilung, die Daten aus unserem Experiment modellieren. b) Vertreter fluoreszierenden überlagert Bilder von Tröpfchen nach der Reaktion Inaktivierung (Maßstab = 200 &amp; mgr; m) zur Erhöhung erwartet Lambda DNA-Moleküle pro Tröpfchen (NTC, 0,005, 0,05, 0,5, und 10). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52925/52925fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a>

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Biology

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Serie: Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in potentially heterogeneous specimens. Nucleic acids can be detected via several established approaches, including analytical methods that are spectrophotometric (e.g., A260), fluorometric (e.g., binding of fluorescent dyes), or colorimetric (nucleoside-specific chromogenic chemical reactions).1 Though it cannot readily distinguish RNA from DNA, the A260/A280 ratio is commonly employed, as it offers a simple and rapid2 assessment of the relative content of nucleic acid, which absorbs predominantly near 260 nm and protein, which absorbs primarily near 280 nm. Ratios &lt; 0.8 are taken as indicative of 'pure' protein specimens, while pure nucleic acid (NA) is characterized by ratios &gt; 1.53.
However, there are scenarios in which the protein/NA content cannot be as clearly or reliably inferred from simple uv-vis spectrophotometric measurements. For instance, (i) samples may contain one or more proteins which are relatively devoid of the aromatic amino acids responsible for absorption at &asymp;280 nm (Trp, Tyr, Phe), as is the case with some small RNA-binding proteins, and (ii) samples can exhibit intermediate A260/A280 ratios (~0.8 &lt; ~1.5), where the protein/NA content is far less clear and may even reflect some high-affinity association between the protein and NA components. For such scenarios, we describe herein a suite of colorimetric assays to rapidly distinguish RNA, DNA, and reducing sugars in a potentially mixed sample of biomolecules. The methods rely on the differential sensitivity of pentoses and other carbohydrates to Benedict's, Bial's (orcinol), and Dische's (diphenylamine) reagents; the streamlined protocols can be completed in a matter of minutes, without any additional steps of having to isolate the components. The assays can be performed in parallel to differentiate between RNA and DNA, as well as indicate the presence of free reducing sugars such as glucose, fructose, and ribose (Figure 1).

A suite of colorimetric assays is described for rapidly distinguishing protein, RNA, DNA, and reducing sugars in potentially heterogeneous biomolecular samples.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Forschung

Chemie

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Genetik

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biotechnik

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Biologie

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Medizin

<meta charset="utf8"></head><body>Standardisiertes Protokoll für die Quantifizierung des viralen Genoms mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of AAV genome copy number in vector preparations is essential for bioprocess optimization and dosage calculation in both preclinical and clinical studies of AAV-based gene therapy products. Currently, a consensus protocol for AAV viral genome titration is lacking. Here, we present a digital droplet PCR (dd_PCR) protocol for the quantification of viral genomes in purified vector samples. Samples are treated with DNase I to eliminate unpackaged contaminant DNA. DNase-treated samples are then mixed with an appropriate primer-probe set (designed according to the target AAV genome) and PCR reagents, and then loaded into a droplet generator. The prepared droplets are transferred into a PCR plate, where PCR amplification is performed and analyzed. The viral genome titer is calculated based on the concentration (copies/&#181;L), accounting for sample dilutions. A successful measurement shows a clear separation of the positive and negative droplet clouds, has at least 10,000 accepted droplets, shows a value between 10 copies/&#181;L and 10,000 copies/&#181;L, and has a coefficient of variation (CV) between repeats lower than 20%. Reliable viral genome titration will aid in the development of safe and effective AAV-based gene therapy products.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Optimierung der digitalen Tröpfchen-PCR-Methode für eine genaue Quantifizierung des adeno-assoziierten viralen Genoms

Precise quantification of adeno-associated virus (AAV) vector genome copies is critical, but a standardized protocol has yet to be established. This protocol describes a validated method for preparing purified AAV samples and conducting digital droplet polymerase chain reaction (dd_PCR) to reliably quantify the viral genome titer.

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 water-in-oil droplets, and the PCR occurs in the individual droplets. The dd-PCR has several advantages over conventional real-time qPCR, including increased accuracy in detecting low-abundance targets, omitting reference genes for quantification, eliminating technical replicates for samples, and showing high resilience to inhibitors in the samples. Recently, dd-PCR has become one of the most popular methods for accurately quantifying target DNA or RNA for gene expression analysis and diagnostics. Circular RNAs (circRNAs) are a large family of recently discovered covalently closed RNA molecules lacking 5' and 3' ends. They have been shown to regulate gene expression by acting as sponges for RNA-binding proteins and microRNAs. Furthermore, circRNAs are secreted into body fluids, and their resistance to exonucleases makes them serve as biomarkers for disease diagnosis. This article aims to show how to perform divergent primer design, RNA extraction, cDNA synthesis, and dd-PCR analysis to accurately quantify specific circular RNA (circRNA) levels in cells. In conclusion, we demonstrate the precise quantification of circRNAs using dd-PCR.

This protocol describes the detailed method of digital droplet PCR (dd-PCR) for precise quantification of circular RNA (circRNA) levels in cells using divergent primers.

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Integration von Nass- und Trocken Bench Prozesse werden so optimiert Gezielte Next-Generation Sequenzierung von Low-Qualität und Low-Menge Tumorbiopsien

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Quantifizierung von Adeno-assoziierten viralen Genomen in gereinigten Vektorproben durch digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR