Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Akt-Aktivierung und Phosphorylierung in lebenden HepG2-Zellen zu quantifizieren. Die Förster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das wertvolle Einblicke in die Insulinsignalwege und die Stoffwechselregulation in Krebszellen liefert.

Die metabolisch regulierte Akt-Aktivierung ist ein kritischer Knotenpunkt in der Insulinsignalkaskade und liefert wertvolle Einblicke in die Beziehung zwischen Diabetes und Krebs. Um die Akt-Aktivität in HepG2-Zellen genau zu quantifizieren, haben wir ein robustes, reproduzierbares Protokoll entwickelt, das den Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mit genetisch kodierten Akt-spezifischen Biosensoren verwendet. Dieses Protokoll beschreibt detaillierte Schritte für die Zellkultur, die Vorbereitung der Bildgebungsschale und die Transfektion von HepG2-Zellen zur Expression von FRET-basierten Biosensoren sowie spezifische Richtlinien für die Hardware- und Softwarekonfiguration von konfokalen Laserscanning-Mikroskopen. Die Ergebnisse zeigten einzigartige Muster der Insulinsignalübertragung in HepG2-Zellen, die einen irreversiblen Schalter aufweisen, der durch eine konstitutive Akt-Aktivierung mit einer definierten Einschaltschwelle, aber ohne Abschaltschwelle gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu weisen Myotuben einen reversiblen Schalter auf. Die anhaltende Akt-Aktivierung in HepG2-Zellen deutet auf Mechanismen hin, die der Insulinresistenz und der metabolischen Dysregulation in Leberzellen zugrunde liegen, mit breiteren Implikationen für das Verständnis des Fortschreitens von Stoffwechselstörungen und Krebs. Dieses Protokoll bietet einen wertvollen Rahmen für die Erforschung von Akt-bezogenen Signalwegen und zellulären Verhaltensweisen in verschiedenen Krankheitskontexten.

Diabetes mellitus stellt eine große globale gesundheitliche Herausforderung dar, die durch Insulinresistenz und eine gestörte Glukosehomöostase gekennzeichnet^{ist 1}. Ein umfassendes Verständnis der Insulin-Signalwege ist entscheidend für die Aufklärung der Pathophysiologie dieser Krankheit, da Insulin eine zentrale Rolle für den Glukosestoffwechsel, das Zellwachstum und das Überleben spielt². Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Insulinsignalisierung verschiedene Krebsarten signifikant beeinflusst, was die Insulinresistenz mit dem Fortschreiten des Tumors und schlechten Patientenergebnissen in Verbindung bringt 3,4,5,6. HepG2-Zellen, eine häufig verwendete hepatozelluläre Karzinomzelllinie, dienen als wertvolles Modell für die Untersuchung der Insulinresistenz und des Zusammenspiels zwischen metabolischer Dysregulation und Krebsentstehung⁷. Traditionell haben Forscher die Insulinreaktionen als abgestuft angesehen; Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass einzelne Zellen bistabile Reaktionen aufweisen können, die bei bestimmten Insulinkonzentrationsschwellen deutliche Übergänge zwischen Nichtreaktion und vollständiger Reaktion aufweisen ^8,9.

Die Förster-Resonanzenergietransfer-Bildgebung (FRET) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Verteilung von Biomolekülen in lebenden Zellen¹⁰. Durch die Extraktion von Informationen aus der Molekulardynamik bietet FRET Einblicke in Prozesse wie die Akt-Aktivierung in Echtzeit und ist damit eine unschätzbare Technik für die Untersuchung lebender Zellen^11,12. Diese bildgebende Methode hat sich bei der Untersuchung der zellulären Dynamik als unverzichtbar erwiesen, insbesondere bei Stoffwechselerkrankungen und Krebs, bei denen präzise molekulare Wechselwirkungen entscheidend sind¹³. FRET ermöglicht auch die Echtzeitüberwachung molekularer Wechselwirkungen und gibt Aufschluss über Mechanismen wie Insulinresistenz und Tumorprogression^14,15. FRET-Biosensoren sind in der Krebsforschung von entscheidender Bedeutung für die Untersuchung von Tumormikroumgebungen, Arzneimittelresistenzen und Stoffwechselstörungen¹⁶. FRET-Detektionsmethoden wie sensibilisierte Emission (SE), Akzeptorbleichen (AB), Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) und Spektroskopie bieten jeweils deutliche Vorteile bei der Quantifizierung molekularer Wechselwirkungen¹⁷. SE misst den Energietransfer zwischen Donor- und Akzeptor-Fluorophoren, was zu einer messbaren Verschiebung der Emissionsspektren führt, die mit der Nähe wechselwirkender Biomoleküle korreliert¹⁸. AB verwendet selektives Photobleaching des Akzeptorfluorophors und verfolgt Änderungen der Donorfluoreszenz, was es den Forschern ermöglicht, die Interaktionskinetik und die Entfernungen zu beurteilen¹⁹. FLIM bewertet die Fluoreszenzzerfallsraten des Donorfluorophors, die direkt von der FRET-Effizienz beeinflusst werden, um präzise nanoskalige Messungen molekularer Wechselwirkungen zu ermöglichen²⁰.

Mit Hilfe von FRET-Techniken haben wir kürzlich bistabile Insulinreaktionen in C2C12-abgeleiteten Myoröhrchen 8,9,21,22,23,24 nachgewiesen. Die unterschiedlichen Ein- und Ausschaltschwellen für die Akt-Aktivierung, wie wir entdeckt haben, deuten darauf hin, dass die abgestufte Ganzkörper-Insulin-Dosis-Wirkungs-Beziehung über die Komplexität der subzellulären Signalkaskade hinwegtäuscht, die mit dem Insulinstimulus beginnt und in einer Alles-oder-Nichts-Reaktion auf Einzelzellebene gipfelt 21,22,23,24. Um das Vorhandensein von Bistabilität in anderen Zelltypen zu testen, stimulierten wir HepG2-Zellen mit Insulin und zeichneten ihre Reaktion mit Hilfe von Einzelzell-FRET-Bildgebung auf. Wir stimulierten HepG2-Zellen mit unterschiedlichen Insulinkonzentrationen und überwachten die Akt-Aktivität auf Einzelzellebene mit einem Akt-Biosensor. Der Akt-Biosensor besteht aus einem verstärkten cyanfluoreszierenden Protein (ECFP)²⁵ als Donorfluorophor und der hellsten Variante des gelb fluoreszierenden Proteins (YPet)²⁶ als Akzeptorfluorophor, verbunden durch einen Evoli-Linker, der die Peptidsequenz SGRPRTTTFADSCKP enthält. Dieses Peptid fungiert als Substrat für phosphoryliertes Akt (pAkt), das aus der humanen Glykogensynthase-Kinase 3β (GSK3β) optimiert ist. Im unphosphorylierten Zustand überschreitet der räumliche Abstand zwischen den Donor- und Akzeptorfluorophoren den Förster-Radius, was den Energietransfer hemmt. Bei Insulinstimulation kommt es zu einer Akt-Phosphorylierung, die zur Phosphorylierung von SGRPRTTTFADSCKP führt. Dieser Prozess induziert eine Konformationsänderung, die Donor und Akzeptor in den Förster-Radius bringt, wodurch FRET²⁷ ermöglicht wird. Infolgedessen korreliert die Intensität des FRET-Signals mit der Menge an phosphorylierten Akt-Molekülen und ermöglicht die Echtzeit-Quantifizierung von insulinvermittelten zellulären Reaktionen.

Dieses Protokoll, das ursprünglich entwickelt wurde, um die Insulinsignalisierung in C2C12-abgeleiteten Myotuben zu untersuchen, wurde erfolgreich auf HepG2-Zellen angewendet und auf verschiedenen Hardware- und Softwareplattformen eingesetzt, was seine Anwendbarkeit, Anpassungsfähigkeit und Vielseitigkeit unter Beweis stellt. HepG2-Zellen weisen eine konstitutive Akt-Aktivität auf, was sie zu einem idealen In-vitro-Modell für die Untersuchung leberspezifischer Insulinsignalwege und Stoffwechselprozesse macht. Die wichtigsten Funktionen des Protokolls werden Schritt für Schritt im Abschnitt Protokoll beschrieben.

Abbildung 1 bietet einen Überblick über die experimentellen Schritte der FRET-Lebendzellbildgebung zur Überwachung der Akt-Phosphorylierung in einzelnen HepG2-Zellen.

1. Plasmidaufnahme, -vermehrung und -reinigung

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die wesentlichen Schritte für die Erfassung, Amplifikation und Reinigung des Plasmids beschrieben, die für die Einzelzell-FRET-Analyse erforderlich sind.

1. Verwenden Sie das Plasmid pEevee-iAkt-NES-YPet (Abbildung 2A).
   HINWEIS: Das Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. Kazuhiro Aoki vom National Institute for Basic Biology (NIBB), Japan, zur Verfügung gestellt.Plasmidkarten für die FRET-Biosensoren, die für die Akt-Überwachung verwendet werden, und ihre jeweiligen Steuerungen sind in Abbildung 2 dargestellt. Der pEevee-iAkt-NES-ECFP (Spender; Abbildung 2B) und pEevee-iAkt-NES-Ypet (Akzeptor; Abbildung 2C) Plasmide werden als Kalibrierungskontrollen bei FRET-Experimenten verwendet⁹.
   HINWEIS: Abbildung 3 zeigt die Zusammensetzung und den Mechanismus des intramolekularen FRET-Biosensors.
2. Um das Plasmid zu vermehren, führen Sie eine bakterielle Transformation mit chemisch kompetenten E. coli-Zellen durch (siehe Materialtabelle). Die transformierten Zellen werden auf Luria-Bertani (LB)-Agar mit 100 μg/ml Ampicillin aufgetragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wählen Sie eine Ampicillin-resistente Kolonie aus und kultivieren Sie sie in LB-Bouillon, die mit 100 μg/ml Ampicillin zur Plasmidamplifikation ergänzt wurde.
3. Um die Plasmid-DNA aufzureinigen, verwenden Sie ein kommerziell erhältliches Plasmid-DNA-Aufreinigungskit (siehe Materialtabelle), um eine hohe Reinheit und Ausbeute zu erzielen. Beurteilen Sie die DNA-Qualität durch Messung der Absorptionsverhältnisse (A260/A280 und A260/A230) mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle). Verhältnisse zwischen 1,8-2,0 und 2,0-2,2 gelten als optimal. Überprüfen Sie die Integrität des Plasmids durch Agarose-Gelelektrophorese, um sicherzustellen, dass es für die Transfektion geeignet ist.

2. Ablauf der Zellkultur

HINWEIS: Führen Sie alle Zellkulturverfahren in einer Laminar-Flow-Haube durch, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten und eine Kontamination zu vermeiden. Der Arbeitsablauf der HepG2-Zellkultur ist in Abbildung 4 dargestellt. Das komplette Medium für HepG2-Zellen besteht aus Minimum Essential Medium (MEM), 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM L-Glutamin-Ergänzung, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin und 2,5 μg/ml Antibiotika-Antimykotika-Lösung (siehe Materialtabelle, Tabelle 1).

1. Tauen Sie gefrorene HepG2-Zellen schnell auf, indem Sie das Fläschchen in einen 37 °C Thermomixer oder ein Wasserbad stellen, bis es vollständig aufgetaut ist.
2. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 mL vollständigem Wachstumsmedium (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Erwärmen Sie das gesamte Wachstumsmedium vor der Verwendung auf 37 °C, um einen Temperaturschock für die Zellen zu minimieren.
3. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren.
4. Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipettenspitze mit breiter Bohrung an, um eine Störung des Zellpellets zu vermeiden.
5. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL frischem Vollwachstumsmedium.
6. Die Zellsuspension wird in einen 75 cm² großen Gewebekulturkolben überführt.
7. Der Kolben wird bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert.
   HINWEIS: Beobachten Sie die Zellen in den nächsten 24-48 Stunden, um die Anheftung zu bestätigen und die Erholung zu beurteilen. Stören Sie die Zellen mindestens 4 Stunden lang nicht, um eine korrekte Anheftung zu gewährleisten, bevor Sie das Medium wechseln. Vermeiden Sie es, den Inkubator in den ersten 4 Stunden häufig zu öffnen, da dies die Zelladhäsion stören kann. Befolgen Sie die institutionellen Biosicherheitsprotokolle und verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA), um während aller Zellkulturverfahren eine sichere Arbeitsumgebung zu gewährleisten. Subkultur von HepG2-Zellen, wenn sie eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen, um optimale Wachstumsbedingungen aufrechtzuerhalten und eine Überfüllung zu verhindern, die sich auf die Lebensfähigkeit und das Wachstumspotenzial der Zellen auswirken kann.
8. Für die Subkultivierung aspirieren Sie das Medium und spülen die Zellen einmal mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
9. Fügen Sie 1 ml 0,25 % Trypsin hinzu, um die Zellmonoschicht zu bedecken (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Trypsin für eine optimale Aktivität auf 37 °C vorgewärmt ist. Übertrypsinisieren Sie die Zellen nicht, da dies die Lebensfähigkeit beeinträchtigen kann. Überwachen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um die Ablösung zu bestätigen.
10. Bei 37 °C ca. 5 min inkubieren.
11. Wenn sich die Zellen lösen, fügen Sie 2 ml vollständiges Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren, und sammeln Sie die Zellen durch Pipettieren.
12. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig, um die Klumpen aufzubrechen und eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
13. Geben Sie 3 ml vollständiges Medium in jeden neuen Kolben und übertragen Sie die Zellen dann in einem Teilungsverhältnis von 1:2 auf jeden Kolben.
    HINWEIS: Für frühe Passagen teilen Sie die Zellen in einer Verdünnung von 1:2. Nach den Passagen 4-5 können je nach Bedarf Verdünnungen von 1:4 oder 1:5 durchgeführt werden.
14. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂.
    HINWEIS: Überprüfen Sie die Zellen nach 24 Stunden, um die Anheftung zu bestätigen und die Wiederherstellung zu beurteilen.
15. Für die Routinekultur wechseln Sie das Nährmedium alle 2-3 Tage oder früher, wenn sich der pH-Indikator von rosa zu gelb ändert, was auf eine Versauerung hinweist.
    HINWEIS: Lassen Sie das Medium nicht zu sauer werden, da dies die Zellen schädigen kann.
16. Überprüfen Sie die Zellmorphologie regelmäßig unter dem Mikroskop, um die Zellgesundheit zu gewährleisten.
    HINWEIS: Für die kurzfristige Lagerung hepG2-Zellen bei -80 °C einfrieren; Für die Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff lagern. Die Zusammensetzung des in diesem Versuch verwendeten Gefriermediums ist in Tabelle 2 dargestellt.

3. Beschichten von Bildgebungsschalen mit Poly-L-Lysin

1. Verwenden Sie 1 ml einer 0,1 mg/ml-Poly-L-Lysin-Lösung pro Bildgebungsschale, um die gesamte Oberfläche zu bedecken (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Passen Sie die Poly-L-Lysin-Konzentration basierend auf den spezifischen Anforderungen des Zelltyps an.
2. Schütteln Sie die Schale vorsichtig, um eine gleichmäßige Beschichtung der Kulturoberfläche zu erzielen.
   HINWEIS: Stellen Sie während des gesamten Prozesses sterile Bedingungen sicher, um eine Kontamination zu vermeiden.
3. Inkubieren Sie die Gerichte über Nacht bei Raumtemperatur (RT).
4. Überschüssige Poly-L-Lysin-Lösung durch Pipettieren aus den Schalen aspirieren.
5. Spülen Sie die Oberfläche dreimal mit PBS ab und ruhen Sie jedes Mal 5 Minuten lang (siehe Materialtabelle). Entfernen Sie das ungebundene Poly-L-Lysin vollständig aus der Bildgebungsschale, um eine Hemmung des Zellwachstums zu verhindern. Spülen Sie die Platten vorsichtig ab, um ein Abkratzen oder Beschädigen des Glasbodens zu vermeiden.
6. Trocknen Sie die beschichteten Bildgebungsschalen mindestens 3 h lang bei 37 °C an der Luft.
7. Verwenden Sie die beschichteten Bildgebungsschalen sofort oder lagern Sie sie bis zu 2 Wochen bei 4 °C.

4. Transfektion von HepG2-Zellen

HINWEIS: Die HepG2-Transfektionsmethode ist in Abbildung 5 dargestellt.

1. Satieren Sie HepG2-Zellen 24-48 Stunden vor der Transfektion in vorbeschichteten Bildgebungsschalen, um sicherzustellen, dass sie eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreichen.
2. Tauen Sie das Transfektionsreagenz und das Plasmid, das für den FRET-Biosensor kodiert, auf Eis auf. Gründlich vortexen und vor Gebrauch eine kurze Drehung (z.B. 5.000 x g für 5 s) durchführen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Transfektionsreagenz und das Plasmid vor der Verwendung vollständig aufgetaut sind.
   ACHTUNG: Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen, da dies die Wirksamkeit des Transfektionsreagenzes verringern kann.
3. Geben Sie 8 μg Plasmid, das für den FRET-Biosensor mit dem Reaktionspuffer kodiert, bis zu einem Endvolumen von 100 μl. Mischen Sie gut, indem Sie 5 s lang bei hoher Geschwindigkeit (ca. 3.000-5.000 x g) vortexen.
   HINWEIS: Geben Sie immer ein Plasmid in den Puffer, bevor Sie das Transfektionsreagenz auf Polymerbasis hinzufügen. Mindestens 50 μl der Lösung müssen aus dem Reaktionspuffer bestehen (siehe Materialtabelle).
4. 2,4 μl des Transfektionspolymers werden in das Röhrchen mit der verdünnten Plasmid-DNA gegeben. Gut mischen, indem 15 s bei hoher Geschwindigkeit (ca. 3.000-5.000 × g) vortexen.
   HINWEIS: Verwenden Sie immer 0,3 μl des Transfektionspolymers pro 1 μg DNA.
   ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass das Transfektionspolymer gründlich mit der Plasmid-DNA vermischt wird, um einheitliche Nanopartikelkomplexe zu bilden.
5. Inkubieren Sie die Mischung aus Biosensor und Polymer 15 Minuten lang bei 37 °C, damit sich Nanopartikelkomplexe bilden können.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Transfektionspolymer länger als 30 Minuten in Lösung zu halten, da dies die Transfektionseffizienz verringern kann.
   VORSICHT: Überwachen Sie die Inkubationszeit sorgfältig, um eine Überinkubation zu vermeiden, die zu einer verminderten Transfektionseffizienz führen kann.
6. Drehen Sie das Röhrchen 5 s lang bei 5.000 x g herunter, um den Inhalt am Boden zu sammeln, und geben Sie dann die gesamten 100 μl der Nanopartikel-Komplexlösung tropfenweise in das Zellkulturmedium. Den Teller zum Mischen vorsichtig hin und her wiegen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Nanopartikel-Komplexlösung tropfenweise hinzugefügt wird, um sie gleichmäßig auf dem Zellkulturmedium zu verteilen.
   ACHTUNG: Vermeiden Sie starkes Schaukeln, da dies zu Zellverdrängungen oder zu einer ungleichmäßigen Verteilung der Komplexe führen kann.
7. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 4 h bis über Nacht.
   HINWEIS: Die Inkubationszeit kann je nach experimentellem Bedarf angepasst werden, aber 4 h sind in der Regel ausreichend für eine effiziente Transfektion.
   ACHTUNG: Vermeiden Sie eine längere Inkubation (>16 h), da dies die Lebensfähigkeit der Zellen verringern kann.
8. Entfernen Sie die Nanopartikelkomplexe durch Aspiration aus den Zellen, ersetzen Sie sie durch 2 mL frisches vollständiges Wachstumsmedium und stellen Sie die Platte bis zum Zeitpunkt der Analyse wieder in den 37 °C-Inkubator. Die maximale Expression erreicht typischerweise 48 h nach der Transfektion.
9. Analysieren Sie die Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop für die Fluoreszenzbildgebung richtig kalibriert ist, um genaue Ergebnisse zu erhalten.
   VORSICHT: Minimieren Sie die Exposition der Zellen gegenüber intensivem Licht während der Bildgebung, um Phototoxizität zu vermeiden.

5. Hunger von HepG2-Zellen

HINWEIS: Nach Abschluss des Transfektionsschritts werden die Zellen vor der Insulinstimulation und der FRET-Bildgebung mit Serum ausgehungert. Dies minimiert die Aktivierung des Akt-Signalwegs aufgrund des im FBS vorhandenen Insulins und gewährleistet ein konsistentes Ausgangsniveau der Akt-Aktivität. Die Zusammensetzung des in diesem Versuch verwendeten Hungermediums ist in (Tabelle 3) beschrieben. BSA kommt in Pulverform. Um eine 0,1%ige (w/v) Lösung herzustellen, rekonstituieren Sie 0,1 g BSA in 3 ml DMEM und mischen Sie gründlich. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,45-μm-Filter und stellen Sie das Endvolumen durch Zugabe von DMEM auf 100 mL ein.

1. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Bildgebungsschalen zweimal für jeweils 5 min mit 1x PBS aus.
   HINWEIS: Die beiden PBS-Waschungen helfen, Restserum und Insulin oder Wachstumsfaktoren, die das Experiment beeinträchtigen könnten, vollständig zu entfernen.
2. Geben Sie 2 ml Hungermedium in die Bildgebungsschalen (siehe Materialtabelle). Geben Sie das Medium vorsichtig um den Rand der Schale herum, um zu vermeiden, dass sich die Zellen vom Glasboden lösen. Inkubieren Sie bei 37 °C für 4 h.
   HINWEIS: Die 4-stündige Inkubation ist optimal für die Synchronisierung des Zellstoffwechsels; Die Dauer kann jedoch je nach experimentellem Bedarf verlängert werden.

6. FRET-Lebendzell-Imaging für HepG2-Zellen

HINWEIS: Dieser Abschnitt enthält Anweisungen für die FRET-Lebendzellbildgebung zur Überwachung der räumlich-zeitlichen Dynamik der Akt-Phosphorylierung in einzelnen HepG2-Zellen. Es ist wichtig, den Mikroskopaufbau, die Handhabungsverfahren und die Bildgebungsbedingungen für lebende HepG2-Zellen zu optimieren, wie unten beschrieben. Der Mikroskopaufbau ist entscheidend für die Optimierung der Bildgebungsbedingungen für die FRET-Bildgebung. Befolgen Sie die Einrichtung der PC/konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) schrittweise gemäß den Anweisungen des Herstellers, um einen stabilen Betrieb zu gewährleisten. Die angepasste CLSM-Konfiguration für die FRET-Bildgebung ist in Abbildung 6 dargestellt.

1. Schalten Sie den Fernschalter ein, um das Mikroskop, den Computer, den Scanner, den Laserstart, den Piezotisch und die Epifluoreszenz-LED-Lichtquelle mit Strom zu versorgen. Stellen Sie vor dem Einschalten sicher, dass alle Komponenten ordnungsgemäß angeschlossen sind, um mögliche Schäden zu vermeiden.
2. Drehen Sie den Schlüssel beim Laserstart auf die ON-Position und drücken Sie die Tasten, um beide für FRET erforderlichen Laser (457 nm und 514 nm Laserlinien) zu aktivieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die richtigen Filter und Einstellungen für eine optimale FRET-Abbildung vorhanden sind. Die Auswahl der Laserlinie sollte auf den Anregungs- und Emissionsprofilen des Biosensors basieren.
3. Schalten Sie die Steckdosenleiste ein, um den Computer und den Monitor, die an das Mikroskop angeschlossen sind, mit Strom zu versorgen.
   HINWEIS: Stellen Sie vor dem Einschalten sicher, dass alle Anschlüsse fest sind, um Schäden am Gerät zu vermeiden.
4. Melden Sie sich bei Windows an und starten Sie die Mikroskopie-Software.
5. Klicken Sie auf A1 für Aufnahme, um die Bildgebungseinrichtung zu starten. Wählen Sie die geeigneten optischen Konfigurationen basierend auf den Anforderungen des FRET-Experiments.
6. Passen Sie die Laserleistung und die Detektorempfindlichkeit nach Bedarf an, um optimale Bildgebungsbedingungen zu erzielen. Setzen Sie den Inkubator für den Mikroskoptisch vorsichtig ein und befestigen Sie ihn mit Schrauben.
   HINWEIS: Ziehen Sie die Schrauben nicht zu fest an, um Schäden am Inkubator oder am Mikroskoptisch zu vermeiden.
7. Füllen Sie das innere Wasserbad mit sterilem doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O). Installieren Sie die obere Heizung sicher und schalten Sie die Stromversorgung für die Bühnenheizung, die Badheizung und die Linsenheizung ein (Abbildung 7A).
   HINWEIS: Nicht überfüllen, um ein Verschütten in das System zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass alle Heizungen ordnungsgemäß funktionieren, um konstante Temperaturbedingungen für die Bildgebung von Lebendzellen aufrechtzuerhalten.
8. Verwenden Sie die 40-fach Öl-Immersionslinse für die Bildgebung (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die technischen Spezifikationen finden Sie auf der Website des Herstellers.
9. Wischen Sie die Objektivlinse mit Linsenpapier ab, das mit 95 % Ethanol angefeuchtet ist. Geben Sie ein kleines Tröpfchen Immersionsöl auf die Objektivlinse (Abbildung 7B). Stellen Sie die Bildgebungsschale mit den HepG2-Zellen auf den Mikroskoptisch und befestigen Sie sie mit der Halterung (Abbildung 7C).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Bildgebungsschüssel richtig ausgerichtet und gesichert ist, um Bewegungen während der Bildgebung zu vermeiden. Vermeiden Sie Druck auf die Linse, um Schäden sowohl an der Linse als auch am Glasboden der Schale zu vermeiden.
10. Schließen Sie die Kammer und inkubieren Sie die Zellen in der Lebendzellkammer für 1-2 Stunden, damit sie sich äquilibrieren können (Abbildung 7D).
11. Halten Sie während der Zeitrafferbildgebung in bestimmten Intervallen eine Pause ein, entfernen Sie das Medium vorsichtig (Abbildung 7E) und fügen Sie dann 1 ml frisch zubereitetes Medium mit der angegebenen Insulinkonzentration hinzu (Abbildung 7F, Materialtabelle).
    HINWEIS: Bereiten Sie eine 1 mg/ml-Insulinstammlösung vor, indem Sie 1 mg Insulin in 1 ml 10 mM Essigsäure auflösen. Die Lösung wird durch einen sterilen 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter filtriert und die Aliquote bei -20 °C gelagert.
12. Starten Sie das ND-Erfassungsfenster über das Menü Datei der Mikroskopiesoftware.
    HINWEIS: Die Einrichtung der ND-Erfassung ist in (Abbildung 8) dargestellt.
13. Wählen Sie die Registerkarte Zeit , um das Intervall, die Dauer und die gewünschten Schleifen für das Zeitraffer-Imaging festzulegen. Klicken Sie anschließend auf die Registerkarte XY und drücken Sie die Schaltfläche + Hinzufügen , um einzelne HepG2-Zellen für die Bildgebung einzubeziehen.
14. Wenn Sie mehrere Zellen hinzufügen möchten, suchen Sie geeignete Zellen, scannen Sie, optimieren Sie den Fokus und sperren Sie die Point Spread Function (PSF). Wiederholen Sie diesen Schritt für jede neue Zelle, die für die Bildgebung hinzugefügt wird. Scannen Sie mehrere Zellen an verschiedenen Stellen innerhalb der Bildgebungsschalen, um verschiedene Zielzellen für den Einschluss zu identifizieren.
15. Klicken Sie auf das rote X-Symbol , um die Auswahl von Zellen aufzuheben. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Z", um die Z-Position einzustellen. Nachdem Sie alle Parameter ausgewählt haben, geben Sie den Namen des Experiments in das Feld "Dateiname" ein.
16. Klicken Sie auf Durchsuchen , um den Zielordner auszuwählen, und aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen In Datei speichern. Klicken Sie auf die Registerkarte Jetzt ausführen , um die ND-Erfassung zu starten. Das ND-Aufnahmefenster zeigt den Fortschritt der Zeitraffer-Bildgebung in Echtzeit an, einschließlich der verstrichenen und verbleibenden Zeit.
17. Zeichnen Sie Ausgangswerte bis zu 30 Minuten lang auf, ohne die Zellen mit Insulin zu stimulieren.
18. Lokalisieren Sie geeignete Zellen, zoomen Sie hinein/heraus, um eine einzelne Zelle in den Fokus zu bringen, und wählen Sie Zellen mit hoher Fluoreszenzintensität aus. Fügen Sie die Zellen nacheinander hinzu, bis zu einem Maximum von 6 Zellen.
    HINWEIS: Begrenzen Sie die Anzahl der Zellen, um Verzögerungen bei der Bildaufnahme und das Einfrieren des Fensters während der Bildgebung zu vermeiden.
19. Legen Sie die Zeit und die Bildfrequenz für die Zeitrafferaufnahme fest. Starten Sie das Zeitraffer-Imaging.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Parameter, einschließlich Belichtungszeit und Laserleistung, optimiert sind, bevor Sie mit der Bildgebung beginnen.
20. Pausieren Sie die Bildgebung in regelmäßigen Abständen, nehmen Sie das Medium vorsichtig aus der Glasbodenschale und fügen Sie 1 ml Medium hinzu, das mit der entsprechenden Insulinkonzentration versetzt ist.
21. Setzen Sie die Bildaufnahme fort. Wiederholen Sie Schritt 6.20 bei Bedarf.
22. Klicken Sie am Ende des Experiments auf die Registerkarte Fertig stellen, um es zu schließen. Sichern und speichern Sie aufgenommene Bilder sicher für die Analyse.

7. Datenanalyse

1. Korrigieren Sie die vorverarbeiteten Zeitraffer-FRET-Bildgebungsdaten von Kontrollproben auf spektrales Übersprechen und CFP-Autofluoreszenz, was zu korrigierten FRET-Werten und präziser FRET-Effizienz führt. Verwenden Sie Bildgebungssoftware für die Erfassung, Verarbeitung und Analyse von FRET-Bildern gemäß den Protokollen, die in früheren Studien beschrieben wurden 27,28,29,30 (Abbildung 9).

8. Berechnungen des FRET-Wirkungsgrads

1. Um die FRET-Effizienz zu bestimmen, nehmen Sie sieben Bilder auf: Zelle (I_DA(D), I_DD(D), I_DA(A), I_AA(A), I_DD, I_AA und I_DA). Berechnen Sie den FRET-Wirkungsgrad mit der folgenden Formel:
   
   wobei_{FRET Corrected} aus der Gleichung erhalten wird:
   
   wobei d und a definiert sind als:
   
   
   Hier stellen I_DA, I_DD und I_AA Bilder von Zellen dar, die mit dem Biosensor transfiziert wurden. I_DA(D)  und I_DD(D)) SIND REINE SPENDER-KONTROLLBILDER, UND I_DA(A) und I_AA(A) sind reine Akzeptor-Kontrollbilder.

9. Bilderfassung

1. I_DA : Das Bild wird durch Donoranregung (434 nm) mit Akzeptoremission (530 nm) erhalten.
2. I_DD : Das Bild wird durch Donoranregung (434 nm) mit Donoremission (477 nm) erhalten.
3. I_AA : Das Bild wird durch Akzeptoranregung (517 nm) mit Akzeptoremission (530 nm) erhalten.
4. I_DA(D) und I_DA(A) : Erfassen Sie das Bild mit der gleichen Anregung und Emission wie I_DA, jedoch von Zellen, die nur den Donor bzw. den Akzeptor exprimieren.
5. I_DD(D) : Erfassen Sie das Bild unter den gleichen Bedingungen wie I_DD für die Nur-Spender-Kontrolle.
6. I_AA(A) : Ruft das Bild unter den gleichen Bedingungen wie I_AA ab, ist jedoch spezifisch für das Nur-Akzeptor-Steuerelement.

10. Korrektur des Hintergrunds

1. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware auf dem Computer. Rufen Sie in der oberen Menüleiste das Menü Datei auf. Wählen Sie Öffnen oder Datei öffnen aus den Dropdown-Optionen aus.
2. Navigieren Sie zu dem Verzeichnis, das die Zeitraffer-Bilddaten enthält. Suchen Sie das Zeitrafferbild, das analysiert werden muss (z. B. im nd2-Format).
3. Wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf Öffnen oder OK , um sie zur Anzeige und Analyse in die Software zu laden. Definieren Sie einen Interessenbereich (ROI) innerhalb der Zelle (oder verwenden Sie die gesamte Zelle als ROI) und notieren Sie den Grauwert jedes Pixels innerhalb dieses Bereichs.
4. Wählen Sie einen zellenfreien Bereich als Hintergrund und berechnen Sie dessen durchschnittlichen Grauwert. Erstellen Sie das korrigierte Bild, indem Sie diesen Hintergrunddurchschnitt vom Grauwert jedes Pixels innerhalb der Zellen-ROI subtrahieren.

11. Eliminierung des Durchblutens (Übersprechen) des Fret-Bleed-Throughs (Übersprechen)

HINWEIS: Die spektrale Überlappung zwischen der Donoremission und der Akzeptoranregung ist in Abbildung 3B dargestellt, die für den FRET-Wirkungsgrad und den Energieübertragungsprozess entscheidend ist. Das Durchscheinen in der FRET-Bildgebung im Zeitraffer ist eine große Herausforderung, die sich aus der spektralen Überlappung von Donor- und Akzeptorfluorophoren ergibt, was zu ungenauen Messungen führt. Das Übersprechen ist inhärent, da sich die Spektren sowohl der Donor- als auch der Akzeptorfluorophore bis zu einem gewissen Grad überlappen (Abbildung 3C, D). Dieses Problem wird durch Faktoren wie hohe Fluorophorkonzentrationen und unsachgemäße Filterkonfigurationen noch verschärft. Die Berücksichtigung des Durchblutens ist entscheidend für die Gewährleistung der Zuverlässigkeit von FRET-Messungen.

1. In einer früheren Studie finden Sie eine Methode zur Abschwächung von Durchblutungseffekten⁹.

12. Quantifizierung und statistische Analyse

1. Führen Sie statistische Analysen mit statistischer Analysesoftware durch.

Um die Akt-Aktivierung in HepG2-Zellen zu untersuchen, wurden die Zellen auf vorbeschichtete Bildgebungsschalen ausgesät und mit dem FRET-basierten Biosensor pEevee-iAkt-NES transfiziert (Abbildung 2A), der eine Echtzeitüberwachung der Akt-Phosphorylierung ermöglicht. Nach der Transfektion wurden die Zellen 4 Stunden lang in einem serumfreien Medium gehungert, um ihren Stoffwechselzustand zu synchronisieren und die Basalinsulinsignalisierung zu minimieren.

Die Zellen wurden anschließend unterschiedlichen Insulinkonzentrationen (0 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 400 pM, 100 pM und 0 pM) ausgesetzt, um den Insulinsignalweg systematisch zu aktivieren. Wie in Abbildung 10A gezeigt, wurde ein dosisabhängiger Anstieg der Akt-Phosphorylierung beobachtet. Bemerkenswert ist, dass bei 300 pM Insulin ein starker Anstieg der Phosphorylierung auftrat, was die Schwelle für die maximale Akt-Aktivierung markiert. Jenseits dieser Konzentration pendelten sich die Phosphorylierungsniveaus ein, wobei ein allmählicher Anstieg auf bis zu 500 pM beobachtet wurde.

Interessanterweise wurde die Akt-Aktivierung aufrechterhalten, wenn die Insulinkonzentrationen sequentiell von 500 pM auf 0 pM reduziert wurden, wobei die Phosphorylierungswerte erhöht blieben und nicht zum Ausgangswert zurückkehrten. Dieses Phänomen deutet auf eine konstitutive Akt-Aktivierung hin, was darauf hindeutet, dass die Akt-Phosphorylierung unabhängig von nachfolgenden Reduktionen der Insulinkonzentration aktiv bleibt, sobald die Aktivierungsschwelle bei 300 pM Insulin überschritten wird.

Die in Abbildung 10B,C dargestellten normierten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten. In diesen Experimenten, in denen die Zellen mit sequentiell steigenden Insulinkonzentrationen (0 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM und 500 pM) stimuliert wurden, gefolgt von einer schrittweisen Abnahme (500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM und 0 pM). Dieses Experiment zeigte ein ähnliches Muster der Akt-Aktivierung, was die dosisabhängige Reaktion und die anhaltende Akt-Aktivität über die Aktivierungsschwelle hinaus bestätigte.

Abbildung 1: FRET-Bildgebungs-Workflow in HepG2-Zellen Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Plasmidkarten von FRET-Biosensoren für das Akt-Monitoring. (A) pEvoli-iAkt. (B) pEevee-iAkt-NES-ECFP (Spender). (C) pEevee-iAkt-NES-YPet (Akzeptor). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.9 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zusammensetzung und Mechanismus des intramolekularen FRET-Biosensors. (A) Phospho-Akt phosphoryliert das Substratpeptid (SGRPRTTTFADSCKP), das die PBD-Bindung fördert und eine Konformationsverschiebung induziert, die einen Energietransfer vom Donorfluorophor zum Akzeptorfluorophor ermöglicht^27,31. (B) Spektrale Überlappung zwischen Donoremission und Akzeptoranregung. (C) Anregungsübersprechen entsteht aufgrund der Überlappung zwischen den Anregungsspektren von ECFP und YPet. (D) Emissionsübersprechen tritt aufgrund der Überlappung der Emissionsspektren von ECFP und YPet auf. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.9 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Arbeitsablauf in HepG2-Zellkulturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: HepG2-Transfektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Angepasste CLSM-Konfiguration für FRET-Bildgebung. (A) Wählen Sie die gewünschten Kanäle aus und konfigurieren Sie die Einstellungen im Blendenfeld. (B) Wählen Sie im Aplus-Einstellungsfeld die entsprechenden Kanäle aus, stellen Sie die Laserleistung und -intensität, die Pixelverweilzeit, die Lochblende und andere relevante Parameter ein. Lassen Sie den Offset standardmäßig auf "0" eingestellt. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.9 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Aufbau des Mikroskops und Probenvorbereitung für die Lebendzellbildgebung. (A) Installieren Sie den TOKAI HIT Stage Top Inkubator, um die Temperatur und den CO₂ -Gehalt zu regulieren. (B) Tragen Sie Immersionsöl auf die 40×Öl-Immersionslinse auf. (C) Montieren Sie eine 35-mm-Bildgebungsschale mit Glasboden auf dem temperaturgesteuerten Tisch. (D) Proben in der Lebendzellkammer vorinkubieren, um sie an die Umgebungsbedingungen anzupassen. (E) Entfernen Sie das Medium mit einer präzisen Schlauchpumpe. (F) Geben Sie mit einer feinen Pipettenspitze insulinhaltige Medien in die Schale. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.9 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Einrichten der ND-Erfassung für die Zeitraffer-Bildgebung. (A) Aktivieren Sie im Fenster "ND-Erfassung" die Option "Zeit", um das Intervall, die Dauer und die Anzahl der Schleifen für das Zeitraffer-Experiment festzulegen. (B) Klicken Sie auf die Option XY, um einzelne Zellen für die Bildgebung auszuwählen oder abzuwählen. (C) Aktivieren Sie die Option Z, um die Z-Position zu sperren, und klicken Sie auf "Ausführen", um das Experiment fortzusetzen. (D) Das ND-Fortschrittsfenster wird eingeblendet und zeigt den Echtzeitstatus des Experiments an. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.9 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Arbeitsablauf für die Analyse von FRET-Daten. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.9 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 10: Repräsentative Zeitrafferbilder und durchschnittliches normalisiertes FRET-Signalverhältnis der Akt-Phosphorylierung in einzelnen HepG2-Zellen. (A) HepG2-Zellen zeigten die maximale FRET-Effizienz, wenn sie mit 300 pM Insulin stimuliert wurden, was die Schwelle für eine maximale Akt-Aktivierung markierte. Es wurde ein allmählicher Anstieg der FRET-Effizienz beobachtet, als die Insulinkonzentrationen auf 500 pM anstiegen. Selbst bei einer schrittweisen Abnahme der Insulinkonzentration von 500 pM auf 0 pM in verschiedenen Intervallen blieb die anhaltende Akt-Aktivierung bestehen, was auf eine konstitutive Akt-Phosphorylierung hinweist. (B) FRET-Signal, das gegen die Insulinkonzentration aufgetragen wird und eine irreversible schalterähnliche Reaktion zeigt. (C) FRET-Signal, aufgetragen gegen die verstrichene Zeit, mit Fehlerbalken, die die Standardabweichung anzeigen. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Akhtar et ^al.8 übernommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: MEM Komplette Medienzusammensetzung.

Tabelle 2: Zusammensetzung des Gefriermediums.

Tabelle 3: Zusammensetzung des Hungermediums.

Das Protokoll für die FRET-Bildgebung in lebenden Zellen zur Überwachung der Akt-Phosphorylierung in HepG2-Zellen umfasst mehrere wichtige Schritte, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Der erste kritische Schritt ist die Zellkultur, die die routinemäßige Zellpflege, die Beschichtung von Bildgebungsschalen und die Zellaussaat umfasst. Die richtige Beschichtung ist für die Zelladhäsion bei Zeitraffer-Bildgebungsexperimenten unerlässlich, da sie eine stabile Zelladhärenz gewährleistet, eine Ablösung verhindert und die Drift minimiert, was zu inkonsistenten Daten führen kann ^9,32. Schwankungen in der Zelldicke oder subzellulären Strukturen können dazu führen, dass Teile der Zelle unscharf sind, was die Messgenauigkeit beeinträchtigt. Temperatur, pH-Wert und Ionenkonzentrationen beeinflussen die FRET-Signale und erhöhen die Variabilität 33,34,35. Die richtige Zellanheftung unterstützt die Zellgesundheit, erhält die Integrität der Signalübertragung und gewährleistet genaue FRET-Messungen. Die Transfektion von HepG2-Zellen mit dem FRET-basierten Akt-Biosensor ist ein kritischer Schritt, da die Transfektionseffizienz die Intensität und Konsistenz des FRET-Signals direkt beeinflusst³¹. Die transiente Transfektion führt jedoch von Natur aus zu einer Heterogenität in der Biosensorexpression. Diese Variabilität kann durch die Optimierung der Transfektionsbedingungen, die Implementierung strenger Kontrollen und die Auswahl von Zellen mit einheitlicher Fluoreszenzintensität minimiert werden. Die Sicherstellung einer homogenen Expression in der gesamten Zellpopulation ist unerlässlich, um konsistente und zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Die Kalibrierung sensibilisierter Emission (SE) unter Verwendung von Kontrollproben – wie z. B. Nur-Donor-, Nur-Akzeptor- und Donor-Akzeptor-Konstrukte – ist entscheidend für eine genaue Quantifizierung der FRET-Effizienz. Diese Kalibrierung korrigiert spektrales Übersprechen und erstellt konsistente Basismessungen, die eine präzise Dateninterpretation ermöglichen 28,36,37,38.

Während die SE-FRET-Methode wertvolle Echtzeit-Einblicke in die Dynamik der Akt-Phosphorylierung liefert, müssen mehrere Einschränkungen beachtet werden, um genaue und zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Spektrales Übersprechen zwischen Donor- und Akzeptorfluorophoren kann FRET-Signale verzerren, was die Verwendung mehrerer Kontrollproben erforderlich macht²⁸. Spektrales Durchbluten (SBT) und Einschränkungen der Schärfentiefe in der Mikroskopie beeinträchtigen die Genauigkeit der FRET-Analyse in Zellen mit unterschiedlicher Dicke oder Morphologie erheblich. Diese Herausforderungen erfordern fortschrittliche Korrekturmethoden, um die Messzuverlässigkeit zu erhöhen^27,39. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, müssen die Forscher die Expression von Donor/Akzeptor-Fluorophoren optimieren, Transfektionsverfahren verfeinern und robuste Kontrollexperimente durchführen, um unspezifische Signale zu korrigieren und eine präzise Datenerfassung sicherzustellen^28,39. Eine unzureichende Kontrolle dieser Faktoren könnte zu falschen Schlussfolgerungen führen, aber fortschrittliche Normalisierungstechniken, wie sie von Hoppe et ^al.40 und Zal und Gascoigne⁴¹ entwickelt wurden, können spektrale Interferenzen korrigieren und die Genauigkeit von FRET-Messungen in komplexen zellulären Umgebungen verbessern. Darüber hinaus ermöglichen fortschrittliche FRET-Normalisierungsmethoden, wie von Hochreiter et ^al.42 hervorgehoben, die quantitative Analyse von Proteininteraktionen, einschließlich Stöchiometrien und relativer Affinitäten in lebenden Zellen, und ermöglichen so ein tieferes Verständnis der Proteindynamik unter verschiedenen Bedingungen.

Zusätzlich zu diesen technischen Einschränkungen ist die Integration von Computermodellen von Signalwegen von entscheidender Bedeutung, um die Interpretation der SE-FRET-Ergebnisse zu verbessern. Diese Modelle bieten einen strukturierten Rahmen für die Interpretation komplexer biologischer Daten. Durch die Simulation von Signalnetzwerken können Forscher die Dynamik molekularer Wechselwirkungen und die Auswirkungen von Störungen besser verstehen, was zu genaueren Vorhersagen und Erkenntnissen führt 43,44,45,46. Zum Beispiel haben Studien des mTOR-Signalwegs bistabile Schalter in der Akt-Aktivierung identifiziert, bei denen die Signalübertragung zwischen unterschiedlichen stabilen Zuständen umschaltet, die für die Regulierung von Prozessen wie Zellproliferation und Überleben entscheidend sind^47,48. Solche Modelle unterstreichen die Komplexität des Akt-Signalwegs, insbesondere in Krebszellen, bei denen eine anhaltende Aktivierung das Fortschreiten der Krankheit vorantreibt. Durch die Integration von Echtzeit-SE-FRET-Bildgebung mit Computermodellen können Forscher tiefere Einblicke gewinnen, wie Rückkopplungsschleifen und zeitliche Verschiebungen in der Akt-Aktivität die zellulären Reaktionen beeinflussen, was zu einem umfassenderen Verständnis von Stoffwechselerkrankungen und Krebs beiträgt 13,48,49,50.

Die FRET-basierte Methode bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Signaldynamiken, insbesondere in metabolisch regulierten Signalwegen⁵¹. Im Gegensatz zu biochemischen Massenassays bietet die FRET-Bildgebung sowohl eine räumliche als auch eine zeitliche Auflösung auf Einzelzellebene und ermöglicht so die Echtzeitbeobachtung dynamischer Prozesse in lebenden Zellen. Diese Fähigkeit, molekulare Ereignisse auf Einzelzellebene zu verfolgen, bietet Einblicke in die zelluläre Heterogenität, was wichtig ist, um zu verstehen, wie sich metabolische Verschiebungen (z. B. durch Nährstoffverfügbarkeit, Insulinsignalisierung oder metabolischen Stress) auf die Dynamik der Akt-Signalgebung auswirken können. Im Vergleich zu anderen fluoreszenzbasierten Techniken ist FRET einzigartig empfindlich gegenüber Änderungen des Abstands zwischen interagierenden Proteinen und eignet sich daher ideal für den Nachweis subtiler oder vorübergehender Konformationsänderungen und Proteinwechselwirkungen ^8,9,52. Der Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET) und die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie mit FRET (FLIM-FRET) sind jedoch fortschrittliche Techniken zur Untersuchung von Proteininteraktionen, die jeweils einzigartige Vorteile in spezifischen experimentellen Kontexten bieten. BRET nutzt die Lumineszenz der Luciferase, um Probleme wie Photobleiche und Autofluoreszenz zu minimieren, was es besonders effektiv für die Quantifizierung der Membranproteinexpression macht⁵³. Umgekehrt ermöglicht FLIM-FRET eine hochauflösende Bildgebung und quantitative Analyse von Proteininteraktionen, insbesondere unter nativen Bedingungen, durch Messung von Änderungen der Fluoreszenzlebensdauer^54,55. Diese Methoden haben zwar Grenzen, bieten aber ergänzende Einblicke in spezifische experimentelle Kontexte.

Das FRET-basierte Protokoll zur Überwachung der Akt-Phosphorylierung in lebenden HepG2-Zellen bietet wichtige Einblicke in die zelluläre Signalübertragung, insbesondere im Zusammenhang mit Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes und Krebs. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung dynamischer Prozesse und verbessert das Verständnis der Rolle von Akt bei der Stoffwechselregulation und der Krankheitspathogenese 27,31,56. Die Anpassungsfähigkeit von Methoden zur Untersuchung der Akt-Aktivierung über verschiedene Zelltypen hinweg erhöht ihren Nutzen in der Krebsforschung erheblich. Diese Flexibilität ermöglicht es den Forschern, zelltypspezifische Signalmechanismen zu untersuchen, die zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Ziele führen können¹³. Darüber hinaus ermöglicht die Robustheit dieser Protokolle die Untersuchung anderer Signalwege und Proteininteraktionen, wodurch das Verständnis zellulärer Prozesse verbessert wird. Das Potenzial für eine Hochdurchsatz-Adaption dieser Methoden eröffnet neue Wege für die Wirkstoffforschung, insbesondere bei Krebs und Stoffwechselerkrankungen 12,13,56. Die Entwicklung neuartiger Biosensoren, die verschiedene fluoreszierende Proteine (FPs) verwenden, zusammen mit fortschrittlichen Techniken wie der Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) hat ein erhebliches Potenzial, den Nutzen von FRET-basierten Assays zu verbessern. Diese Innovationen verbessern die Empfindlichkeit, reduzieren das spektrale Übersprechen, ermöglichen Multiplex-Bildgebung und bieten quantitative Präzision, was die Anwendbarkeit von FRET in der biomedizinischen Forschung erweitert. Solche Fortschritte erleichtern die Untersuchung komplexer Signalnetzwerke, das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening und die Krankheitsmodellierung mit größerer Genauigkeit und Zuverlässigkeit.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SE-FRET zwar gewisse Einschränkungen aufweist, strenge Kontrollen und fortschrittliche Bildgebungsstrategien diese Herausforderungen jedoch angehen. Dies macht SE-FRET zu einem leistungsstarken und vielseitigen Werkzeug zur Aufklärung komplexer zellulärer Dynamiken. Seine Fähigkeit, die Einzelzelldynamik in Echtzeit zu beobachten, bietet deutliche Vorteile gegenüber Bulk-Assays und bietet Einblicke in molekulare Wechselwirkungen, die sonst unentdeckt bleiben könnten. Diese Fähigkeit ist besonders wichtig für die Untersuchung der Akt-Phosphorylierung, wo das Verständnis der räumlichen und zeitlichen Dynamik von Signalereignissen entscheidend für die Entwicklung zielgerichteter Therapien für Stoffwechselerkrankungen wie Insulinresistenz und Krebs ist.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Diese Arbeit wurde teilweise von der Natural Science Foundation of Shenzhen (JCYJ20240813113606009), der Shenzhen-Hong Kong Cooperation Zone for Technology and Innovation (HZQB-KCZYB-2020056), der National Natural Science Foundation of China (32070681), dem National Key R&D Program of China (2019YFA0906002) und dem Shenzhen Peacock Plan (KQTD2016053117035204) unterstützt.