Trophoblastenzellgewinnung aus Angiogenese-Röhrchenbildungsassay für die Analyse der Differenzierungsmarkerexpression

Das vorliegende Protokoll ermöglicht die Wiederherstellung von röhrenartigen Strukturen, die im klassischen in vitro Angiogenese-Röhrenbildungsassay gebildet wurden, bei dem Zellen, wie z. B. Trophoblastzellen, in kapillarartigen Strukturen über einer Schicht aus extrazellulärer Basalmembranmatrix organisiert sind. Die gewonnenen Strukturen werden zur RNA- und Proteinisolierung für verschiedene biochemische Analysen verwendet.

Während der Plazentaentwicklung dringen extravillöse Trophoblastenzellen (EVT) in die mütterliche Dezidua ein, um die Spiralarterien der Gebärmutter durch einen Prozess des mesenchymalen zu endothelartigen Übergangs umzugestalten. Traditionell wird dieser Prozess durch einen in vitro Tubenbildungsassay bewertet, bei dem sich die Zellen zu röhrenartigen Strukturen organisieren, wenn sie über ein polymerisiertes Basalmembranpräparat ausgesät werden. Obwohl mehrere strukturelle Merkmale in Mikrofotografien der Strukturen gemessen werden können, ist eine biochemische Analyse von Zellextrakten erforderlich, um die tatsächliche Bindung von EVT an den Phänotyp des Endotheltyps zu beurteilen. Das Abkratzen der Zellen aus der Kulturschale zur Gewinnung von RNA- und/oder Proteinextrakten ist keine Alternative, da die röhrenartigen Strukturen durch den Großteil der Proteine aus der polymerisierten Basalmembran stark verunreinigt sind. Daher ist eine Strategie erforderlich, um die Zellen von den Basalmembranproteinen vor der Herstellung von Zellextrakten zu trennen. Hier wird eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Rückgewinnung der röhrenartigen Strukturen aus dem in vitro Tubenbildungsassay und der anschließenden Analyse durch biochemische Techniken vorgestellt. Röhrenartige Strukturen, die von HTR8/SVneo-Zellen, einer EVT-Zelllinie, gebildet wurden, wurden durch eine kurze Inkubation mit PBS, das mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ergänzt wurde, von der polymerisierten Basalmembran befreit. Nach seriellen Wäschen kann ein gebrauchsfertiges Pellet aus gereinigten röhrenartigen Strukturen erhalten werden. Dieses Pellet kann anschließend zu RNA- und Proteinextrakten verarbeitet werden. Die qPCR-Analyse belegte die induzierte Expression von VE-Cadherin und_{alpha-v-Integrin}, zwei Endothelzellmarkern, in EVT-abgeleiteten röhrenartigen Strukturen im Vergleich zu Kontrollzellen, was mit der Induktion des Endothelzellmarkers CD31 übereinstimmte, der durch Immunfluoreszenz bewertet wurde. Die Western-Blot-Analyse der Proteinextrakte der röhrenartigen Strukturen zeigte die Überexpression von RECK in transfizierten HTR8/SVneo-Zellen. Diese einfache Methode ermöglicht es somit, Zellextrakte aus dem in vitro Röhrchenbildungsassay für die anschließende Analyse von RNAs und Proteinexpression zu erhalten.

Der Erfolg einer Schwangerschaft hängt von der richtigen Entwicklung der Plazenta und der Etablierung des Plazentakreislaufs ab. Eines der Schlüsselereignisse im Zusammenhang mit diesem Prozess ist der Umbau der Uterusspiralarterien (uSA)¹ von einem Blutgefäß mit hohem Widerstand und geringem Fluss zu einem Blutgefäß mit niedrigem Widerstand und hohem Fluss, wodurch die Durchblutung des mütterlichen Blutes in die Plazenta erhöht^{wird 2}.

Der Umbau von uSA wird durch spezialisierte Trophoblastzellen erreicht, die von der Blastozyste abgeleitet sind. Nach der Implantation des Embryos wandern die fetalen extravillösen Trophoblasten (EVTs) von der Implantationsstelle durch die mütterlichen Deziduen und den Uterus in Richtung uSA³. Dort induzieren EVTs die Migration und Apoptose der mütterlichen vaskulären assoziierten glatten Muskelzellen (VSMC) und der Endothelzellen (EC)⁴. Anschließend erhalten EVTs einen endothelähnlichen Phänotyp durch einen mesenchymal-endothelähnlichen Übergang (MELT)^5,6, der die VSMC und EC des Gefäßes^{ersetzt 7}.

Die Präeklampsie (LE) ist ein schwangerschaftsspezifisches Syndrom, das durch das Auftreten einer mütterlichen Hypertonie gekennzeichnet ist, begleitet von Proteinurie und/oder anderen Symptomen einer mütterlichen Endorgandysfunktion, die seit der 20^. Schwangerschaftswoche festgestellt wird⁸. Obwohl die genaue Ätiologie der Lungenembolie nicht vollständig verstanden ist, bezieht sich die am meisten akzeptierte Hypothese auf einen fehlerhaften uSA-Umbau⁹, der einen dauerhaften Zustand unzureichender Durchblutung der Plazenta erzeugt, begleitet von einer Plazentaschädigung durch Ischämie-Reperfusion, Hypoxie und oxidativen Stress, wodurch die Freisetzung von Plazentafaktoren an den mütterlichen Kreislauf aktiviert wird und die charakteristischen mütterlichen Symptome der Lungenembolie^{ausgelöst werden 9}. Daher ist es wichtig, die wichtigsten zellulären und molekularen Mechanismen zu bestimmen, die am uSA-Umbau durch Trophoblastzellen beteiligt sind.

Die Evaluierung des MELT von EVTs wird klassischerweise durch den in vitro Basalmembran-Matrix-Röhrenbildungsassay¹⁰ erreicht, bei dem einzelne Zellen migrieren und sich in zweidimensionalen Strukturen organisieren, die einem Blutgefäß ähneln. Dieses Protokoll erfordert die Aussaat von EVTs-Zelllinien auf einer dünnen Schicht polymerisierter extrazellulärer Matrix, die üblicherweise als Basalmembranmatrix bezeichnet wird, bei der es sich um eine kommerziell erhältliche extrazelluläre Matrix handelt, die aus einer gelösten Basalmembran besteht, die aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Maussarkom extrahiert und mit Laminin angereichert ist, sowie Kollagen IV, Heparansulfat-Proteoglykanen und Entactin/Nidogen¹⁰. Die Analyse der gebildeten röhrenförmigen Strukturen erfolgt in der Regel durch die Identifizierung von in Mikrofotografien etablierten Merkmalen (z. B. Anzahl der Verzweigungen oder Maschenindex) und die Quantifizierung dieser durch die ImageJ-Software (Angiogenesis analyzer plugin)¹¹. Obwohl diese Methode häufig verwendet wird, um die Bildung der röhrenartigen Strukturen zu beschreiben 12,13,14, beschränken sie sich auf die Charakterisierung der Organisation der Zellen, da es nicht möglich ist, diese Strukturen für die biochemische Analyse zu sammeln 12,13,14, hauptsächlich aufgrund der Unmöglichkeit, die Zellen/Röhren von der Basalmembranmatrix zu trennen, die eine große Menge verschiedener Proteine enthält. Daher ist es nicht möglich, den tatsächlichen Beitrag von zellulären Proteinen zu bestimmen, der notwendig ist, um die Expression zellulärer Proteine korrekt zu verstehen. Da die meisten Proteine in diesen Extrakten aus der Basalmembranmatrix stammen, erweist sich die Repräsentation der zellulären Proteine als sehr gering, so dass eine große Menge an Proteinen in ein SDS-Seitengel geladen werden muss, um sie mittels Western Blot zu analysieren, was die Auflösung und den Transfer der Proteine beeinflusst. Eine korrekte Analyse ist fast unmöglich. Dieser Überschuss an Proteinen, die aus der Basalmembranmatrix stammen, wirkt sich auch tiefgreifend auf die Extraktion von RNA mit der für die weitere Analyse erforderlichen Reinheit aus.

In diesem Bericht beschreiben wir eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode, die auf der PBS-EDTA-Behandlung basiert und die Freisetzung von röhrenartigen Strukturen aus der Basalmembranmatrix ermöglicht, die für die biochemische Analyse von Zellextrakten verarbeitet werden können. Diese Methode liefert große Mengen an Biomolekülen, RNA und Proteinen und ist mit der klassischen biochemischen Analyse, qPCR und Western Blot kompatibel. Wir schlagen vor, dass diese Strategie auf andere Assays anwendbar sein könnte, wie z.B. die subzelluläre Fraktionierung, die Bestimmung epigenetischer Marker durch Pyrosequenzierung oder Chromatin-Immunpräzipitationsassays. Kurz gesagt, besteht das Protokoll aus der Inkubation der röhrenartigen Strukturen in der Kulturschale mit PBS, das mit 50 mM EDTA bei 4 °C ergänzt wird, um die Basalmembranmatrix aufzulösen. Durch diese einfache Inkubation bleiben die röhrenförmigen Strukturen in Suspension, die nach einer Reihe von Waschgängen mit PBS zur Beseitigung des EDTA und des Überschusses an verdünnter Basalmembranmatrix als gebrauchsfertiges Pellet aus röhrenförmigen Strukturen und/oder einzelnen Zellen erhalten werden können. In den folgenden Abschnitten werden die Protokolle für den MELT-Assay und die Rückgewinnung röhrenartiger Strukturen beschrieben.

1. Vorbereitung auf den Assay

HINWEIS: Alle Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle Kunststoffmaterialien müssen steril und brandneu sein. Glasflaschen müssen durch Autoklavieren sterilisiert werden. Alle Materialien müssen vor ihrer Verwendung in der Laminar-Flow-Kabine mit 70%iger Ethanollösung sterilisiert werden. Das minimale Zellkulturmedium (RPMI) muss vor der Supplementierung mit fötalem Rinderserum (FBS) durch Filtration mit einem 0,22-μM-Filter sterilisiert werden. Tragen Sie bei der Arbeit mit biologisch gefährlichen Abfällen immer persönliche Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe, lange Haare, die nach hinten gebunden sind usw.).

1. Bereiten Sie das RPMI-1640-Medium (5 % FBS-vollständiges Wachstumsmedium) vor, indem Sie sterilisiertes RPMI 1640 und FBS in einer sterilen Glasflasche in den Laminar-Flow-Schrank geben. Für eine 5%ige FBS-Lösung fügen Sie 190 ml RPMI-1640 und 10 ml FBS hinzu. Erwärmen Sie den RPMI-1640 Media-5% FBS in einem temperaturgesteuerten Wasserbad bei 37 °C.
2. Bereiten Sie die Basalmembranmatrix wie folgt vor. Tauen Sie die Basalmembranmatrix langsam auf, indem Sie die Flasche 3 bis 4 Stunden lang bei 4 °C aufstellen und die MW-6-Schale vor der Verwendung 1 h lang bei -20 °C abkühlen lassen. Nach dem Auftauen die Basalmembranmatrix auf Eis halten. Im Laminar-Flow-Schrank wird die Basalmembranmatrix zu 70 % mit eiskaltem RPMI1640 ohne FBS verdünnt.
   HINWEIS: Die Basalmembranmatrix sollte bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert werden. Nach dem Auftauen muss alles bei 4 °C gearbeitet werden, um eine vorzeitige Polymerisation der Matrix zu vermeiden.
3. Bereiten Sie PBS-EDTA vor, indem Sie die entsprechende Menge EDTA in PBS auflösen, um eine Endkonzentration von 50 mM EDTA zu erreichen. Halten Sie die PBS-EDTA auf 4 °C.

2. Assay zur Röhrchenbildung

1. 60 μl/cm² der verdünnten Basalmembranmatrix wie in Schritt 1.2 angegeben zugeben. zu den Gerichten. Vermeiden Sie Blasen, die das für die Quantifizierung der röhrenförmigen Strukturen erforderliche Mikrofoto beeinträchtigen.
   HINWEIS: Bei einem Multiwell-6 (MW6, mit einer Fläche von 9,6 cm²) beträgt das Volumen 580 μl Basalmembranmatrix -70%.
2. Die Schalen mit Basalmembranmatrix für 2 h in einen Zellinkubator (5 % CO₂ und 37 °C) überführen, um die Polymerisation der Basalmembranmatrix zu fördern.
   HINWEIS: Bereiten Sie während der letzten 1 Stunde der Polymerisation die Zellsuspension der Zellen vor, die für den Assay verwendet werden, mit dem Ziel, die 2 Stunden der Polymerisation abzuschließen, wenn die Zellen bereit für die Aussaat sind.
3. 80.000 Zellen/^cm2 HTR8/SVneo (EVTs-Zelllinie), verdünnt in 2 mL RPMI-1640-5% FBS, über die polymerisierte Basalmembranmatrix und auch über die unbeschichteten Schalen als Kontrolle aussäen. Säen Sie die Zellen vorsichtig entlang der Wand des Brunnens aus, um eine Zerstörung der Basalmembranmatrix zu vermeiden.
   HINWEIS: Sorgen Sie für eine homogene Zellverteilung über das Matrigel, da sich sonst in Bereichen, in denen weniger Zellen vorhanden sind oder die Zellen überfüllt sind, keine Röhren bilden.
4. Übertragen Sie die ausgesäten Zellen für 12 h, 24 h und 48 h bei 5 % CO₂ und 37 °C in den Zellinkubator und die Kultur.
   HINWEIS: Normalerweise reichen 24 Stunden aus, um die röhrenförmige Struktur zu analysieren, aber wenn während dieses Prozesses eine kinetische Protein- oder RNA-Expression erforderlich ist, inkubieren Sie die Zellen für: 3 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden.

3. Zellrückgewinnung aus der Basalmembranmatrix

1. Sobald die gewählte Inkubationszeit erreicht ist (z. B. 12 h, 24 h, 48 h), nehmen Sie das konditionierte Medium zurück, um die Messung Ihrer Wahl durchzuführen.
2. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit eiskaltem 1x PBS, mindestens 3x, um Zelltrümmer zu entfernen. Wenn Mikrofotografien benötigt werden, gießen Sie 1 ml kaltes PBS in jede Vertiefung und machen Sie innerhalb von 10 Minuten Fotos.
3. Entfernen Sie PBS und geben Sie 700 μl PBS-EDTA in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 3-5 Minuten lang auf Eis.
   HINWEIS: PBS-EDTA löst die Basalmembranmatrix auf, so dass das gesamte Zellnetzwerk in Suspension bleibt.
4. Die Suspension des röhrenförmigen Netzwerks wird vorsichtig mit einer Mikropipette (p1.000) in einem 1,5-ml-Röhrchen zurückgewonnen.
5. Die Suspension wird bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Am Ende sollte ein weißes Kügelchen aus Zellen zu sehen sein.
6. Beseitigen Sie den Überstand durch Umkehren des Rohres und versuchen Sie, es so trocken wie möglich zu halten.
7. Fügen Sie 1 ml PBS bei 4 °C hinzu und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit einer p.1000-Mikropipette, um die Zellen zu waschen und die gelöste Basalmembranmatrix und EDTA zu entfernen. Wiederholen Sie dies mindestens 2x.
   HINWEIS: Diese Waschschritte sind entscheidend. Die verbleibende Basalmembranmatrix konnte als viskose Schicht über dem Zellpellet beobachtet werden. Wiederholen Sie die Wäschen, bis der größte Teil der Basalmembran-Matrixschicht entfernt ist.
8. Verwenden Sie das Zellpellet nach der letzten Wäsche direkt für die Protein- oder RNA-Extraktion. Alternativ können Sie das Pellet in 1 mL des PBS resuspendieren und je nach Bedarf in verschiedene Röhrchen verteilen: z. B. 300 μL für die RNA-Extraktion und die restlichen 700 μL für die Proteinextraktion usw.
9. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 x g für 10 min bei 4 °C, um das Zellpellet zu erhalten.
   HINWEIS: Die Teilung der Zellsuspension in PBS kann in dem gewünschten Verhältnis erfolgen, z. B. 1:1, 1:2 oder 1:3 zu RNA:Protein. Hier wird ein Verhältnis von 1:2 RNA:Proteinen verwendet. Lagern Sie zu diesem Zeitpunkt die Zellpellets, wenn sie nicht sofort benötigt werden, so trocken wie möglich bei -80 °C bis zu einem Monat.

Um das in diesem Bericht beschriebene Protokoll zu evaluieren, haben wir zunächst die röhrenartigen Strukturen generiert. Wie in Abbildung 1A gezeigt, erzeugten HTR8/SVneo-Zellen (EVT) nach 12 h, 24 h und 48 h Inkubation über der Basalmembranmatrix röhrenartige Strukturen. In den Kontrollschüsseln, in denen HTR8/SVneo im untersuchten Zeitintervall auf Kunststoff ausgesät wurden, wurden keine röhrenartigen Strukturen beobachtet. Nach der Aufnahme von M...

Der röhrenförmige Formationsassay ist ein weit verbreitetes Instrument zur Bewertung der Interaktion zwischen Zellen in angiogenen Prozessen¹⁹. Hier zeigen wir die angiogenen Eigenschaften von nicht-endothelialen Zellen, wie z.B. den EVTs, beim Umbau von vaskulären Uterusgefäßen, einem kritischen Ereignis während der Plazentation⁶. Obwohl die röhrenförmige Bildung sehr aufschlussreich über die Interaktion zwischen Zellen ist, ist e...

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Finanzierungsquelle FONDECYT 1221362, ANID, für JG. Convocatoria Nacional Subvención a la Instalación en la Academia, ANID, No. SA77210087 für ICW.