我们的研究重点是色谱质谱在核酸、肽蛋白和 CDT 领域的应用。本实验的挑战在于分离 LNP 的多种组分，并测定浓度显著不同的组分和残留问题。该方案的优点是它以低成本实现了良好的分离、宽线性范围和对 LNP 的电流测定。
首先，设置一个高效液相色谱或 HPLC 系统，并耦合一个蒸发光散射检测器。按照色谱柱上的箭头方向安装色谱柱。将一端连接到自动进样器出口，另一端连接到蒸发光散射检测器入口。
制备 A 相，准确测量并转移 1， 387 μL 三乙胺，并将其溶于 1000 mL水中。充分混合并使用乙酸将 pH 值调节至 7。要制备 B 相，将 1， 387 微升三乙胺溶解在 1000 毫升甲醇中。
充分混合并用乙酸将 pH 值调节至 7。将 A 相和 B 相放入托盘中。启动 LabSolutions 软件并打开实时分析窗口。
单击“文件”并选择“新建”以创建新的方法文件，将液相色谱停止时间修改为 15 分钟，然后单击“应用于所有采集时间”。然后单击 Pump 并修改泵参数。选择分析模式为二进制高压梯度或 BGE，并将流速设置为 1 mL/min。
将初始泵 B 浓度设置为 80%将流动相梯度修改为 3 分钟时变为 80%，4 分钟时变为 85%，从 5.5 分钟到 12 分钟，在 100% 和 12.1 分钟时，让泵返回到 80%现在单击柱温箱，将柱温箱温度设置为 55 摄氏度。然后单击 ELSD 将漂移管温度修改为 40 摄氏度并保存方法。单击 Download and start up（下载并启动）以启动和平衡仪器。
精密称取四种脂质纳米粒子成分标准物质中的每一种 10 毫克。将每种成分溶解在 1 mL 甲醇中并涡旋直至完全溶解，得到每种组分浓度为 10 mg/mL 的储备液。使用移液器将 100 μL 每种储备液准确转移到样品瓶中。
加入 600 μL 甲醇并充分混合，制备浓度为 1000 μg/mL 的混合中间溶液。现在，将 20 μL 每种储备液准确转移到样品瓶中。加入 920 μL 甲醇并充分混合，制备浓度为 200 μg/mL 的混合中间溶液 2。
通过连续稀释制备一系列不同浓度的标准溶液。接下来，使用移液器将 100 μL 样品准确转移到样品瓶中。然后加入 900 微升甲醇并充分混合，以确保脂质纳米颗粒稀释 10 倍及其与核酸药物的解离。
将标准溶液和样品溶液放入液相色谱仪的自动进样器中。单击 Realtime Analysis 窗口的 Assistant 工具栏中的 Realtime Batch。接下来，单击 File 菜单中的 New 以创建新的批处理表。
在批次表中，输入样品瓶编号、托盘名称、数据文件以及标准溶液和样品溶液的进样体积。选择保存的方法文件，然后单击 File 菜单中的 Save batch file。等到液相色谱仪压力和色谱图的基线稳定。
然后单击助手工具栏中的 start real-time batch 开始数据采集。对于数据分析，请打开 LabSolutions 软件的浏览器窗口。将标准溶液数据拖动到定量结果视图中，以建立校准曲线。
通过单击方法视图中的 Edit 来修改数据处理参数。在积分参数窗口中，将积分算法更改为 I-PeakFinder，并将基线类型设置为 Base to Base。然后，在识别参数中，将识别方法更改为 band，并将默认带宽设置为 0.1 分钟。
要修改定量参数，请将定量方法更改为 External standard（外部标准）。将校准水平数设置为 7。然后选择指数校准曲线类型并修改化合物设置。
输入四种脂质纳米颗粒组分的名称和标准溶液浓度。双击峰顶点以更新保留时间。单击查看，完成数据处理参数的修改。
现在，将定量结果视图中的样品类型修改为标准计算点。根据浓度，将标准溶液的浓度设置为 1 到 7。建立校准曲线后，单击菜单栏中的 File（文件）并保存方法文件。
将示例数据拖动到浏览器窗口的定量结果视图中。观察样品中四种脂质纳米颗粒成分的显示浓度结果。LNP标准溶液分析实现了基线分离，四种组分的分离度均大于1.5，在高浓度标准溶液中未观察到残留。
四种组分的校准曲线在 5 至 250 μg/mL 的浓度范围内表现出超过 0.999 的相关系数，表明线性极佳。该方法表现出较高的重现性，基于重复进样 6 次（每次 10 μg/mL）标准溶液，保留时间小于 0.1% 的相对标准偏差和峰面积的相对标准偏差小于 2%。对用甲醇稀释 10 倍的实际 LNP 样品的分析显示，组分浓度从 150 μg/mL 到 1， 500 μg/mL 不等，在多个制造商中实现了始终如一的高分离和灵敏度。
