从肉鸡雏鸡胚胎中分离出前脂肪细胞

原代前脂肪细胞是了解控制脂肪细胞代谢的分子途径的有价值的实验系统。鸡胚胎提供了从脂肪细胞发育的最早阶段分离前脂肪细胞的机会。该方法经过优化，产生具有高活力和增加的分化能力的细胞，可用于雏鸡早期脂肪生长发育胚胎的功能分析。

鸡和人类之间的脂肪分化过程具有高度的可比性。因此，分离的前脂肪细胞可以作为与人类和家禽相关的研究的双重模型。开始用70%乙醇拭子胚胎体。

然后为了防止过滤过程中的干扰，在消化后的后续步骤中用无菌纱布轻轻擦洗皮肤表面以除去羽毛。然后切掉两腿和腹部区域之间的皮肤，露出一对股骨脂肪库。用一只手用弯曲的镊子将皮肤固定在腿周围，轻轻去除股骨皮下脂肪。

用另一只手。之后，使用弯曲的镊子轻轻地将长筒从腿部拉开。将组织转移到含有5毫升收集培养基的15毫升管中，并在脂肪垫的另一侧重复解剖。

现在，将收集的脂肪垫转移到含有灭菌溶液的60毫米培养皿中，并通过旋转培养皿几次来短暂冲洗。然后通过将脂肪垫转移到含有PBS的60毫米培养皿中来冲洗灭菌溶液。轻轻旋转盘子，然后再次用PBS清洗。

为了消化脂肪组织，将它们转移到含有预热酶溶液的15毫米管中。然后将一把长直剪刀浸入管中，最后将溶液中的脂肪组织切成尽可能小的碎片。将切碎的组织和酶溶液转移到25毫升高压灭菌的烧瓶中。

用石蜡膜包裹烧瓶，并将烧瓶置于37摄氏度的轨道振荡器培养箱中进行消化。消化后，轻轻地上下移液以充分混合。然后通过移液将250微米的组织过滤器过滤到15毫升管中，以除去任何未消化的组织和碎片。

现在，通过用4毫升生长培养基冲洗烧瓶来除去粘附在烧瓶上的细胞，并将细胞悬浮液过滤到相同的15毫升管中。接下来，通过再次移液生长培养基来冲洗过滤器，以除去过滤器中捕获的任何细胞。在室温下以300倍G离心5分钟，以沉淀细胞级分并吸出上清液而不干扰细胞沉淀。

将沉淀轻轻重悬于一毫升红细胞裂解缓冲液中，通过移液充分混合并在室温下孵育五分钟。然后通过向含有细胞的管中加入五毫升生长培养基来稀释细胞，并通过移液轻轻混合它们。现在，将细胞移液到40微米的细胞过滤器上，并将它们过滤到一个新的50毫升管中。

然后用另外五毫升的生长培养基冲洗过滤器，并通过在室温下以300倍G离心7分钟来沉淀细胞。小心地吸出上清液。通过移液将剩余的细胞沉淀重悬于一毫升生长培养基中 为了确定细胞密度和活力，通过移液将每个样品的10微升混合在台盼蓝中。

将10微升混合物加载到血细胞计数器上并计数细胞。24、48和72小时后对前脂肪细胞的分析显示细胞形态和数量正常。前脂肪细胞的脂肪生成诱导显示脂质液滴的快速分化和积累。

在分离过程中对前脂肪细胞的积极处理导致细胞损伤和低细胞数量。尽管采取了预防措施，仍可观察到微生物污染。用油红O染色脂质表明前脂肪细胞在脂肪诱导下迅速开始形成脂质液滴，并且随着时间的积累在24，48和72小时内观察到。

使用脂质和DNA染色定量相对于细胞数的脂质积累。脂质积累和细胞增殖都随着时间的推移而增加。当组织部分被消化时间过长时，可以观察到低细胞数或受损细胞。

因此，建议不要超过一个半小时的消化。分离的前脂肪细胞可用于基因表达研究。可以获得足够的RNA用于cDNA合成和后续的qPCR或RN酶。