الخلايا الدهنية الأولية هي نظام تجريبي قيم لفهم المسارات الجزيئية التي تتحكم في استقلاب الخلايا الشحمية. توفر أجنة الدجاج الفرصة لعزل الخلايا الشهية من المرحلة المبكرة من تطور الخلايا الشحمية. تم تحسين هذه الطريقة لإنتاج خلايا ذات صلاحية عالية وزيادة القدرة على التمايز إلى خلايا دهنية ناضجة ، والتي يمكن استخدامها للتحليل الوظيفي لنمو الدهون في وقت مبكر من الحياة وتطور الجنين في الكتاكيت.
عملية التمايز الشحمي قابلة للمقارنة إلى حد كبير بين الدجاج والبشر. لذلك ، يمكن استخدام الخلايا البدائية المعزولة كنموذج مقترح مزدوج للدراسات ذات الصلة بالبشر والدواجن. لبدء مسحة جسم الجنين مع 70 ٪ من الإيثانول.
ثم لمنع التداخل أثناء الترشيح في خطوات لاحقة بعد الهضم فرك سطح الجلد بلطف مع شاش معقم لإزالة الريش. ثم قطع الجلد بين الساقين ومنطقة البطن للكشف عن زوج من مستودعات الدهون الفخذية. استخدم ملقط منحني بيد واحدة لتثبيت الجلد حول الساق وإزالة الدهون تحت الجلد الفخذية بلطف.
من ناحية أخرى. في وقت لاحق ، استخدم ملقط منحني لسحب المستودع برفق بعيدا عن الساق. انقل الأنسجة إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من وسائط التجميع وكرر التشريح للجانب الآخر من وسادة الدهون.
الآن ، انقل منصات الدهون التي تم جمعها إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على محلول تعقيم وشطفه لفترة وجيزة عن طريق تدوير الطبق عدة مرات. ثم شطف محلول التعقيم عن طريق نقل منصات الدهون إلى طبق بتري 60 ملم يحتوي على PBS. قم بتدوير اللوحة بلطف ومرة أخرى ، اغسلها باستخدام PBS.
لهضم الأنسجة الدهنية ، انقلها إلى أنبوب 15 ملم يحتوي على محلول إنزيمي قبل التدفئة. ثم اغمر زوجا من المقص المستقيم الطويل في الأنبوب وأخيرا قم بتقطيع الأنسجة الدهنية في المحلول إلى قطع صغيرة قدر الإمكان. انقل الأنسجة المفرومة والمحلول الأنزيمي إلى قارورة معقمة سعة 25 ملليلتر.
لف القارورة بفيلم البارافين وضع القارورة في حاضنة اهتزاز مدارية عند 37 درجة مئوية للهضم. بعد الهضم ، ماصة بلطف لأعلى ولأسفل لتخلط جيدا. ثم قم بإزالة أي أجزاء من الأنسجة غير المهضومة والحطام عن طريق التصفية من خلال مصفاة أنسجة 250 ميكرومتر في أنبوب 15 ملليلتر عن طريق السحب.
الآن ، قم بإزالة الخلايا الملتصقة بالقارورة عن طريق شطف القارورة بأربعة ملليلترات من وسائط النمو وتصفية تعليق الخلية في نفس الأنبوب الذي يبلغ حجمه 15 ملليلتر. بعد ذلك شطف المصفاة عن طريق سحب وسائط النمو مرة أخرى لإزالة أي خلايا محاصرة في الفلتر. جهاز طرد مركزي بسرعة 300 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوير جزء الخلية وشفط السوبرنات دون إزعاج بيليه الخلية.
أعد تعليق الكريات بلطف في ملليلتر واحد من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء ، واخلطها جيدا عن طريق السحب واحتضنها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتخفيف الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلترات من وسائط النمو إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا ومزجها بلطف عن طريق السحب. الآن ، ماصة الخلايا على مصفاة خلية 40 ميكرومتر وتصفيتها في أنبوب جديد 50 ملليلتر.
ثم شطف المصفاة بخمسة ملليلترات إضافية من وسائط النمو وقم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة. شفط بعناية supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية المتبقية في ملليلتر واحد من وسائط النمو عن طريق السحب لتحديد كثافة الخلية وقابليتها للبقاء، امزج 10 ميكرولترات من كل عينة باللون الأزرق التربان عن طريق السحب.
قم بتحميل 10 ميكرولترات من الخليط على مقياس الدم وقم بحساب الخلايا. أظهر تحليل الخلايا الشهية الأولية بعد 24 و 48 و 72 ساعة مورفولوجيا الخلايا الطبيعية وعددها. أظهر الحث الأديبوجيني للخلايا الدهنية الأولية تمايزا سريعا وتراكما لقطرات الدهون.
أدى التعامل العدواني مع الخلايا الدهنية أثناء العزل إلى تلف الخلايا وانخفاض عدد الخلايا. يمكن ملاحظة التلوث الميكروبي على الرغم من اتخاذ تدابير وقائية. يشير تلطيخ الدهون بالزيت الأحمر O إلى أن الخلايا الشهية تبدأ بسرعة في تطوير قطرات دهنية تحت التحفيز الشحمي المنشأ ويتقدم التراكم بمرور الوقت كما لوحظ في 24 و 48 و 72 ساعة.
تم قياس تراكم الدهون بالنسبة لعدد الخلايا باستخدام بقع الدهون والحمض النووي. زاد كل من تراكم الدهون وتكاثر الخلايا بمرور الوقت. يمكن ملاحظة انخفاض عدد الخلايا أو الخلايا التالفة عندما يتم هضم كسور الأنسجة لفترة طويلة جدا.
لذلك ، يوصى بعدم تجاوز ساعة ونصف من الهضم. يمكن استخدام الخلايا الدهنية المعزولة لدراسات التعبير الجيني. يمكن الحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي للاستخدام في تخليق cDNA ومتابعة qPCR أو RNAseq.
