检测植物-真菌相互作用中果胶的双重染色方法

该协议非常重要，因为它可以识别植物 - 真菌相互作用。除了对果胶进行着色外，它还显示出病原体细胞壁聚合物上的缺陷，并允许识别真菌结构。这种简单而简单的技术可以使用光学显微镜进行，并且不需要任何昂贵的设备，例如扫描电子显微镜。

此外，它是一种快速技术，可以很好地区分植物结构以进行组织病理学研究。该技术确定了植物 - 真菌的相互作用。因此，它合作诊断由生物营养和坏死性真菌引起的疾病，如咖啡锈病和脑孢子虫病。

首先，使用手术刀和镊子在病变的中间区域收获约10平方毫米的叶样品，并将其浸入30毫升Karnovsky固定溶液中。使用油泵将叶样品置于500至600毫巴的低真空下15分钟，至少四次以增加固定溶液在叶组织中的渗透性。固定后，将叶样品在0.5M二甲肱酸盐缓冲液中洗涤三次，每次在蒸馏水中稀释5分钟，然后以每种乙醇浓度将其转移到分级乙醇系列中15分钟。

为了逐渐将样品转移到乙二醇甲基丙烯酸酯中，通过在磁搅拌下将一克乙二醇甲基丙烯酸酯粉末与100毫升碱性树脂混合来制备溶液A。然后，将样品浸入溶液A和100%乙醇的比例一至二中三小时。将样品浸入溶液A:100%乙醇的比例一比一中三小时，然后浸入纯碱性树脂中两到四天。

将样品置于低真空下，每天至少四次，持续15分钟，然后旋转。将15毫升溶液A与一毫升固化剂在烧杯中旋转两分钟，以产生聚合溶液B.将1.2毫升该聚合溶液B放入塑料模具中。使用木镐，将受损伤的叶子样品从纯碱性树脂转移到溶液B中，并避免使用镊子，因为它们会导致组织破碎。

确保快速定位垂直于塑料模具的叶片样品，因为溶液B会迅速变得粘稠。当叶片样品的垂直取向达到时，等待30分钟，然后将塑料模具转移到含有硅胶的塑料或玻璃室中以防止潮湿。一旦树脂和叶样品在两到三个小时后聚合，通过用打磨锉刀打磨块基，将产生的块从塑料模具中分离出来。

然后，将块粘在一块木头上。使用配备八厘米钢刀片的旋转切片机将块切成五微米厚的部分。将切片放在覆盖有蒸馏水的载玻片上。

然后，将载玻片转移到热板上以40摄氏度干燥，并促进切片与载玻片的粘附。干燥后，用块参考名称和载玻片编号标记载玻片。用乳酚中的两毫升5%棉蓝色覆盖切片，并在45摄氏度的热板上加热五分钟。

通过在装有蒸馏水的烧杯中洗涤载玻片三次来去除多余的染料。用两毫升0.01%钌红在水中染色一分钟。通过在装有蒸馏水的烧杯中洗涤载玻片三次来去除多余的染料。

在切片上滴一滴蒸馏水，并用盖玻片覆盖切片以进行光学显微镜分析。在双重染色法中，含有细胞壁的海米氏菌丝和致密原生质体含量在海绵状和栅栏状实质中均呈深蓝色。haustorium母细胞和haustoria也表现出深蓝色。

用钌红的计数器染色清楚地定义了细胞间空间中的真菌分布。在相互作用过程中，Hemileia vastatrix haustorium母细胞打破了宿主细胞壁，并发展出一个被乳酸化合物包围的宫颈。胸腺颈上富含果胶的粉红色包封不能阻止宫内膜形成。

在某些情况下，富含果胶的封装不完全包裹了haustorium。在某些情况下，haustorium是完全封装的。富含果胶的细胞壁在病变边缘保持完整性，真菌不存在。

双重染色方法证明了细胞间菌丝的存在。在相互作用区，果胶细胞壁似乎由于溶解而失去其完整性。在上轴表皮中发现了分生孢子等生殖结构。

在菌丝下腔室中发现孢子囊菌丝为卷曲结构，病变区域的帕利塞实质似乎发生细胞壁裂解。避免使用镊子，因为它们会导致组织破碎。应进一步研究锈病、炭疽病、脑孢子病、黑穗病和其他生物营养、半生物营养和坏死性植物-真菌相互作用的组织病理学研究，以研究该技术在不同病理系统中的潜在应用。