هذا البروتوكول مهم لأنه يجعل من الممكن تحديد التفاعل بين النبات والفطريات. بالإضافة إلى تلوين البكتين ، فإنه يوضح أيضا عيوبا في بوليمر جدار الخلية الممرض ويسمح بتحديد هياكل الفطريات. يمكن إجراء هذه التقنية البسيطة وغير المعقدة باستخدام المجهر الضوئي ولا تتطلب أي معدات باهظة الثمن مثل المجهر الإلكتروني الماسح.
بالإضافة إلى ذلك ، إنها تقنية سريعة تحصل على تمييز ممتاز للهياكل النباتية للدراسات النسيجية. تحدد هذه التقنية التفاعل بين النبات والفطريات. وبالتالي ، فإنه يتعاون لتشخيص الأمراض التي تسببها الفطريات الحيوية والميتة مثل صدأ القهوة و cercosporiosis.
للبدء ، قم بالحصاد وعينة أوراق 10 ملليمتر مربع تقريبا في المنطقة الوسطى من الآفة باستخدام مشرط وملقط ، واغمرها في 30 ملليلتر من محلول كارنوفسكي المثبت. قم بإخضاع عينة الورقة لفراغ منخفض من 500 إلى 600 ملليبار لمدة 15 دقيقة باستخدام مضخة زيت ، أربع مرات على الأقل لزيادة نفاذية المحلول المثبت في أنسجة الورقة. بعد التثبيت ، اغسل عينة الورقة ثلاث مرات في مخزن مؤقت 0.5 M cacodylate مخفف في الماء المقطر لمدة خمس دقائق لكل منها ، ثم انقلها إلى سلسلة إيثانوليك متدرجة لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز إيثانول.
لنقل العينات تدريجيا إلى ميثاكريلات الجليكول ، اصنع المحلول A عن طريق خلط غرام واحد من مسحوق ميثاكريليت الجليكول مع 100 ملليلتر من الراتنج الأساسي تحت التحريض المغناطيسي. ثم ، اغمر العينات بنسبة واحد إلى اثنين من المحلول A و 100٪ من الإيثانول لمدة ثلاث ساعات. اغمر العينات بنسبة واحد إلى واحد للمحلول A: 100٪ إيثانول لمدة ثلاث ساعات ، ثم غمرها في راتنج أساسي نقي لمدة يومين إلى أربعة أيام.
أخضع العينة لفراغ منخفض أربع مرات على الأقل في اليوم لمدة 15 دقيقة، يليها الدوران. امزج 15 ملليلتر من المحلول A مع ملليلتر واحد من المصلب في كوب مع الدوران لمدة دقيقتين لإنتاج محلول البلمرة B.ضع 1.2 ملليلتر من محلول البلمرة B هذا في قوالب بلاستيكية. باستخدام معول خشبي ، انقل عينات الأوراق المصابة من الراتنج الأساسي النقي إلى المحلول B وتجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة.
تأكد من توجيه عينات الأوراق بسرعة عموديا على القوالب البلاستيكية حيث يصبح الحل B لزجا بسرعة. عندما يتم تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق ، انتظر لمدة 30 دقيقة ثم انقل القالب البلاستيكي إلى غرفة بلاستيكية أو زجاجية تحتوي على هلام السيليكا لمنع الرطوبة. بمجرد بلمرة الراتنج وعينة الورقة بعد ساعتين إلى ثلاث ساعات ، افصل الكتلة الناتجة عن القالب البلاستيكي عن طريق صنفرة قاعدة الكتلة بملف صنفرة.
ثم ، قم بلصق الكتلة على قطعة من الخشب. قطع الكتلة إلى أقسام سميكة خمسة ميكرومتر باستخدام ميكروتوم دوار مجهز بشفرات فولاذية ثمانية سنتيمترات. ضع الأقسام على شرائح زجاجية مغطاة بالماء المقطر.
ثم ، انقل الشرائح إلى صفيحة ساخنة لتجف عند 40 درجة مئوية وعزز التصاق الأقسام بالشرائح الزجاجية. بعد التجفيف، قم بتسمية الشرائح الزجاجية باسم مرجع الكتلة ورقم الشريحة. غطي الأقسام بملليلتر من القطن الأزرق بنسبة 5٪ في لاكتوفينول وقم بتسخينها على صفيحة ساخنة عند 45 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر. قم بتلطيخ الماء بملليلتر من 0.01٪ من الروثينيوم الأحمر في الماء لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر.
ضع قطرة من الماء المقطر فوق الأقسام وقم بتغطية الأقسام بقسيمة غطاء لإجراء تحليل مجهري خفيف. في طريقة التلطيخ المزدوج ، ظهرت Hyphae Hemileia vastatrix التي تحتوي على جدران الخلايا ومحتوى البروتوبلاست الكثيف باللون الأزرق الداكن في كل من الحمة الإسفنجية و palisade. كما أظهرت الخلية الأم الهوستوريوم والهوستوريا لونا أزرق داكنا.
تلطيخ العداد مع الروثينيوم الأحمر توزيع فطري محدد بوضوح في المساحات بين الخلايا. أثناء التفاعل ، كسرت الخلية الأم Hemileia vastatrix haustorium جدار الخلية المضيفة وطورت رقبة هاوستوريال محاطة بمركبات بكتيكية. لا يمكن للتغليف الوردي والأحمر الغني بالبكتين للرقبة الهاوستوريالية أن يمنع التكوين الهاوستوري.
في بعض الحالات ، قام التغليف الغني بالبكتين بتغليف الهاوستوريوم بشكل غير كامل. وفي بعض الحالات ، يتم تغليف الهاوستوريوم بالكامل. يحافظ جدار الخلية الغني بالبكتين على السلامة عند حدود الآفة ، حيث لا توجد الفطريات.
أظهرت طريقة التلطيخ المزدوج وجود hyphae بين الخلايا. في مناطق التفاعل ، يبدو أن جدران خلايا البكتين تفقد سلامتها بسبب الذوبان. تم العثور على الهياكل التناسلية مثل conidia في البشرة المحورية.
تم العثور على سيركوسبورا كوفيكولا Hyphae في الغرفة تحت الجلد كهياكل تجعيد الشعر ، ويبدو أن حمة الباليسيد في منطقة الآفة تخضع لتحلل جدار الخلية. تجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة. وينبغي إجراء المزيد من الدراسات النسيجية المرضية على الصدأ والجمرة الخبيثة وداء السيركوسبوريوسيس والتفحم وغيرها من التفاعلات بين النباتات والفطريات النباتية والميتة والمستحثة بيولوجيا للتحقيق في الاستخدام المحتمل لهذه التقنية في النظم المرضية المختلفة.
