用于登德里脊柱研究的串行块面扫描电子显微镜 （SBEM）

大脑中的每个神经元通过大约7000个突触与其他神经元细胞相连。除了哺乳动物大脑中的突触主要位于膜的小突起上，称为树突状脊柱。突触和树突状脊柱等的可塑性，诸如学习和记忆过程等重要大脑功能。

需要注意的是，只有电子显微镜才能全面了解树突状脊柱是否具有后合成输入。提供各种树突脊柱成像技术。然而，串行块面部扫描电子显微镜为高分辨率成像大量组织提供了独特的可能性。

基于串行块的扫描电子显微镜技术需要特殊的样品制备协议，它涉及与重金属的强烈对比。在灌注过程中，我的主要固定使我们能够使用相同的大脑进行减轻电子显微镜。老鼠被牺牲，并灌注了温和的原发性固定剂。

大脑被切成两半，一个半球被固定在免疫荧光专用固定剂，冷冻保护剂，使用低温统计切片，并处理免疫荧光研究。另一个半球被固定在电子显微镜固定，切片与振动器，并准备电子显微镜研究。用于基于序列块的扫描电子显微镜研究的大脑切片进行了对比，平嵌在树脂中，然后海马体的CA1区域被安装到针脚上，并用基于序列块的扫描电子显微镜成像。

视频中展示了黄色框中突出显示的协议部分。取入已修复的组织，切成100片微生物片，用冷磷酸盐缓冲器清洗5次，每次3分钟。准备4%的四氧化硫和3%的铁氰化钾的一对一混合物。

最终产品将变成棕色。将样品浸入这种混合物中。然后将样品放在冰上。

从这个阶段开始，保护他们免受光线照射是很重要的。用轻轻的摇晃孵育它们一个小时。同时，准备 TCH 解决方案。

混合 10 毫升双蒸馏水和 0.1 克 TCH。将其放入60摄氏度的烤箱中一小时。不时地挥动解决方案非常重要。

准备好后，将其冷却至室温。现在用双蒸馏水清洗样品五次，每次三分钟，然后浸入过滤的TCH溶液中。切片将变黑。

在室温下孵育20分钟。用双蒸馏水清洗样品五次，每次三分钟，用2%的四氧化硫化物孵育30分钟，这次是在室温下。再次，用双蒸馏水清洗样品五次，每次三分钟，并把它们放入过滤的1%或乙酸铵。

在四摄氏度的一夜之间孵化它们。第二天，从 D-阿斯巴丁准备开始。将硝酸铅与预热至60摄氏度的阿斯酸溶液混合。

将混合物放入60摄氏度的水浴中，用一个摩尔氢氧化钠将pH值调整到5.5。用铅阿斯巴甜关闭小瓶，在60摄氏度下离开30分钟。解决方案应该清晰。

如果变成多云，必须丢弃它，需要准备一个新的。同时，用气体双蒸馏水清洗样品五次，每次三分钟，并将它们放在60摄氏度的烤箱中30分钟。将样品浸入新制备的铅阿斯巴酸盐溶液中，在60摄氏度的烤箱中孵育20分钟。

准备环氧树脂。在添加加速器 DMP 30 之前，称重配料并混合树脂至少 30 分钟。用乙醇的分级稀释来准备病毒。

然后将样品从烤箱中取出，然后用双蒸馏水再洗五次，每次三分钟。同时，将树脂与100%乙醇按一对一的比例混合，获得50%的树脂。混合好。

在此之后，每次稀释乙醇时脱水样品五分钟。请记住，样品绝不能完全干燥。先在 50% 树脂中渗透样品 30 分钟，然后在 100% 树脂中渗透一小时，然后在一夜之间再次浸入新鲜的 100% 树脂中。

第二天，将样品放入新鲜的100%树脂中一小时，然后嵌入氟聚合物嵌入片之间。准备已脱脂的嵌入片，并放置玻璃滑梯，用作支撑。将一块嵌入片放在玻璃滑梯上，在上面放一滴树脂，然后使用木棍小心地转移样品。

用第二块盖住它。尽量避免气泡。要温柔，因为组织非常脆弱。

小心地将另一个玻璃滑梯放在嵌入片的顶部，并在 70 摄氏度下将样品在烤箱中治愈至少 48 小时。分离层，用剃须刀刀片切开嵌入的样品的一块。将其转移到石蜡上。

这将最大限度地降低因静电而丢失样品的危险。拿一个已经脱脂乙醇的铝针。混合导电环氧树脂井，并用少量环氧树脂将样品安装到销中。

在 70 摄氏度下治疗导电环氧树脂 10 分钟。用钻石刀修剪样品块的每一侧，然后擦亮块的表面，直到组织暴露。使用导电涂料将样品磨到针脚上并治愈它。

为了尽量减少充电，还应发现样品上涂有一层薄薄的黄金或金铂。将带样品的引脚放入基于串行块的扫描电子显微镜的腔室中。将样品对齐到刀上，然后关闭腔室并设置参数。

收集一叠图像。使用上述方法，获得了小鼠脑组织的图像。海马体一个区域的大图像被拍摄，成像设置在地层半径图的中心。

获得了一叠图像，并分割了感兴趣的对象，如树突状脊柱和突触。通过清晰可见的膜和突触囊泡以及保存完好的线粒体获得了高质量的组织形态。PSD 95抗体的免疫荧光研究证实，轻度原发性固定和传统固定4%PFA具有可比性。

呈现协议允许获得脑组织图像，使用串行块为基础的扫描电子显微镜，高质量的组织形态学，和12个可见膜促进10正确的分割和重建。我的主要固定使使用相同的大脑分析PSD 95免疫荧光和电子显微镜成像树突脊柱成为可能。在这里，我们使用 PSE 9，500 萌芽。

但是，其他也可以使用。