研究多孔系统中细菌的运输对于污染、疾病传播和生物修复非常重要。对于在单个细胞中操作的数学模型中的这些实验，需要种群和微生物群落水平。在这里，我们介绍使用微流体设备和显微镜研究细菌运输的工具，以及结合流式细胞仪进行大型设备的研究。
微流体器件与显微镜和流式细胞学相结合，为研究不同空间尺度的细菌运输现象提供了一系列的可能性。为了充分探讨这一方案，建议在显微镜、基础图像处理、微流体器件设计、掌握流式细胞学方面具有以往的经验。本视频介绍了研究不同空间尺度细菌运输的两种方法。
第一种方法，基于微流体器件，依靠显微镜来计算单个细胞。该系统可用于研究从孔隙到整个多孔系统尺度的多个空间尺度的细菌传输。第二种方法，使用更大的流体设备耦合到自动分配器和流式细胞仪，可用于研究细菌运输现象的规模，整个多孔系统。
这些方法也可以部署在实验室规模的专栏研究以及小型实地调查中。首先，设计由圆矩阵组成的所需多孔几何体。根据所选几何形状，使用标准 SU-8 光刻法准备模具。
在干净的一次性容器中，将 90% 的弹性体添加到 10% 的固化剂中，将 90% 的弹性体添加到 90% 的弹性体中，然后用清洁工具混合两种试剂，从而准备 50 克 PDMS。涂抹 100 毫巴的真空 30 分钟，以去除溶解的气泡和气泡。将模具放入培养皿中，将 PDMS 倒入模具上，达到 2 到 5 毫米之间的所需高度。
用盖子盖住培养皿，并在60摄氏度下至少保持4小时。之后，让微流体装置冷却到室温。冷却后，用手术刀小心地取出 PDMS 所需的部分。
用胶带暂时密封 PDMS 通道的底部。使用直径为 0.5 毫米的冲孔机，穿透通道，创建入口和出口。从 PDMS 通道上拆下胶带，将通道与多孔侧朝上放置。
在室温下，用等离子体处理玻璃滑梯和 PDMS 表面约 45 秒。将预处理的 PDMS 通道放在预处理的玻璃滑轨上，并在 100 摄氏度的高温板上加热 30 分钟，然后从热板中取出微流体装置并将其冷却至室温。吸尘 30 分钟以去除 PDMS 中的空气。
要生产包含孔隙的基座，请使用高精度微铣刀从基基 PMMA 层中去除 0.5 毫米，然后铣削尺寸为 1.1 倍 1.1 毫米的凹槽，用于橡胶 O 形环。将两个螺纹孔作为入口和出口钻入流体装置的顶部，并钻出 12 个用于螺钉的孔。这用作流体装置的盖子。
清洁流体装置后，使用 12 个螺纹孔将底座和盖子拧在一起。从真空中去除微流体并将其放在显微镜舞台上。使用注射器泵用运动缓冲液饱和。
使用 Brightfield 显微镜或相位对比度，调整放大倍率以可视化单个细菌细胞，并专注于观察通道的中心。将光路设置切换到荧光显微镜。通过偏移和相机曝光时间调整对焦，以解决单个细菌细胞。
在这种情况下，100 毫秒。接下来，将进气管插入含有细菌悬浮液的两毫升管中。反转泵方向，然后以每分钟一微升的流量开始提取悬架。
扫描整个观察通道的横截面，每分钟记录一次图像。将图像导入所需的软件平台。在未记录任何粒子时，将背景记录为第一个图像的平均值。
从每个图像中减去背景以消除摄像机噪音和光学畸变。将图像裁剪到感兴趣的区域。确定等于细胞荧光像素强度的阈值，以便大于阈值的值包括细菌细胞。
使用图像处理从每张图片中减去阈值。将生成的图像进行双化，以便细菌细胞的值为 1，而背景的值为零。删除区域小于最小细菌细胞大小（以像素为单位）的像素聚类。
对二进制图像进行求和，以获取剩余群集的像素总数。将像素数除以细菌细胞的平均大小（以像素为单位）以获取细胞数的估计值。将计数转化为每毫升颗粒中的浓度。
要确定注射细菌悬浮液的浓度，用注射器将细菌悬浮液注射到清洁微流体装置的观察通道中。记录图像并计算前图所示的细菌影响浓度。通过利用内向细菌浓度C0对出流细菌浓度C进行标准化，并在C0与时间之间绘制C来可视化突破性曲线。
为了分析通过多孔基质传输的细菌的局部速度和轨迹，将显微镜阶段移动到感兴趣的区域，并调整焦点到微流体装置的中心。将光学配置设置为相位对比度或荧光显微镜。记录延时图像和曝光时间足够短，足以捕获细菌位移。
在这种情况下，50 毫秒。在足够多的时间内录制图片，例如三分钟。要消除每个图像的杂色，请减去背景，这是所有记录图像之和的平均值。
确定数值梯度的模数，并按其最大值将其规范化。将细菌坐标和图像采集时间记录到三列文件中。执行粒子跟踪分析以处理记录的数据并计算轨迹。
要获得沉积剖面，请记录之前整个多孔通道的复合图像，即背景，并在注射细菌悬浮液后通过微流体装置。从细菌注射后记录的图像中删除背景。计算沉积轮廓 D 作为细菌荧光信号沿多孔通道 x 长度的横向部分的总和。
将沉积轮廓可视化为局部荧光信号与多孔通道长度。要设置自动分配器，请将机器人分配器放在流体装置附近。将机器人分配器连接到运行 BCNC 的计算机，并确定正确的 com 端口。
在 BCNC 中，单击主页按钮将机器人分配器返回到主页位置。使用 50 厘米长、一毫米内径管将内侧泵与入口连接，并使用同一管将自动分配器与流出器连接。泵培养介质通过流体装置。
注意介质到达固定在机器人分配器上的出口管，并放置一个 96 井板，该板将收集流出。同时，激活机器人分配器，并通过PMMA流体装置以每分钟0.2毫升的流速注射细菌悬浮液。注射相当于几个孔隙体积的细菌悬浮液。
例如，流体装置体积的 30 倍。注射后，切换到无菌栽培介质，直到实验结束。完成96井板后，将板盖并储存在4摄氏度，直到流式细胞仪分析。
通过流式细胞学分析样品，通过将出流细菌浓度C与流入细菌浓度C0进行标准化，并在C0与时间上绘制C来可视化突破性曲线。在这项研究中，使用动量和非动性伪多莫纳斯pida KT2440，在PDMS微流体器件中进行了连续实验，并随机进行了一系列支柱。此处显示了与注射细胞浓度和孔径的细菌轨迹正常化的突破性曲线。
还对从PMMA中碾磨的大型流体装置进行了实验。将动量和非动性伪多孔基质注入有规律的分空多孔基质中。引人注目的是，在无生物膜的多孔环境中，动性和非动性伪多莫纳斯（KT2440）在突破性曲线的基础上表现出明显的不同运输行为。
在一个多孔基质与一个复杂的流生物膜群落一起殖民了48小时，这些在运动和非动性伪多莫纳斯（伪莫莫纳斯）之间突破曲线上的差异消失了。我们使用这个系统来研究溪流中的细菌运输，但这些工具可以很容易地调整，以研究其他工程和环境系统中的细菌运输现象。通过水合多孔介质的细菌传输在多个空间尺度上封装过程。
此处介绍的方法允许将孔径尺度的细菌局部位移与整个多孔介质的微观传输联系起来。
