从3维球体培养中分离出类似干细胞的细胞

干细胞分离仍然是一个主要的挑战，因为使用当前方法共同隔离祖先细胞。我们开发了一种新型无生物标志物的检测方法，从混合祖体中分离出静态干细胞。这种基于球形的标签保留分析的主要优点是，它可以利用CFSE或远红标签，通过FACS从其子祖先中扩展和分离活干细胞。

虽然传统疗法可以根除大多数前列腺癌细胞，但癌症干细胞仍然由于治疗阻力而存在，从而推动疾病进展。干细胞样细胞分离将允许识别新的基因，这些基因可以在治疗上共同定位，以有效缓解疾病。我们的标签保留测定适用于从各种组织和细胞中分离的正常干细胞，以及癌症干细胞研究。

重要的是，这种测定适用于其他上皮细胞癌，如乳腺癌和结肠直肠癌。首先用两毫升2.5微克纤维素溶液涂上100毫米培养盘，并在室温下孵育过夜。然后吸气溶液，让培养皿在生物安全柜中晾干45分钟。

将前列腺上皮细胞生长介质的9毫升加入纤维素涂层的盘中，并在37摄氏度的二氧化碳培养箱中保持温暖。在37摄氏度的水浴中解冻一小瓶冷冻人类前列腺上皮细胞，并在10毫升温暖介质中重新给细胞。将电池悬浮液以500倍g离心5分钟。

然后吸气并丢弃上一液。将细胞重新悬浮在一毫升温暖的培养基中，用预热培养基将悬浮液的一毫升直接转移到纤维素涂层的盘中。然后在37摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育。

如果共同标记细胞，则准备 10 天 2D 培养的 BrdU 标记细胞，如文本手稿中所述。然后加入5微摩尔CFSE或远红，孵育细胞30分钟。孵育后，用染料小心吸气介质，用五毫升热 PBS 清洗细胞两次。

接下来，根据手稿指示，使用05%的三辛EDTA进行酶消化。将细胞以500倍g离心5分钟，然后丢弃上一代。细胞在冰冷的一对一地下室膜基质和培养基组合中重新被重新吸收，用于3D前球的形成。

要在 3D 地下室基质系统中准备表层培养，请将地下室膜基质在四摄氏度下解冻，并在使用前将基底膜基质放在冰上。然后轻轻加入一毫升的冰冷基底膜基质，加入同等量的冰冷培养基中。上下移液混合，注意不冒气泡。

在冰冷的一对一地下室膜基质和培养基质组合中，将5倍10至1/4的人类前列腺上皮细胞重新吸收，总体积为500微升。将溶液移入每井的底部边缘，并旋转板以均匀分布混合物。将板放在37摄氏度的二氧化碳培养箱中30分钟，使基质凝固。

然后覆盖它每井一毫升温暖的培养介质，确保不打扰环。要收获 CFSE 标记的 prostasphere，请用两毫升的分散和移液器上下混合多次，以替代介质。在37摄氏度下孵育板30分钟，消化基质，然后将球体混合物收集到15毫升离心管中。

将球体以 500 倍 g 离心五分钟，然后丢弃上一代。将颗粒重新放入 500 微升加热 05% trypsin EDTA 中，并将它们转移到 1.5 毫升离心管中。在37摄氏度下孵育球体5分钟，然后加入500微升热PBS，10%FBS。

用26米针通过一毫升注射器，完全分离球体。将细胞以500倍g离心5分钟。然后吸气并丢弃上一液。

将细胞重新用一毫升温暖的培养基中，用每毫升碘化钠一微克来染色死细胞，并在室温下孵育一分钟。重复离心，丢弃上经。然后用一毫升的温介质清洗细胞。

重复离心，丢弃上经。将细胞重新用一毫升温暖的培养基重新暂停，并通过35微米孔径细胞滤株卡帽过滤，将细胞收集在五毫升聚苯乙烯圆形底部管中。对多普辛分散的CFSE标记的蛋白酶球细胞执行FACS分析。

使用非标记细胞作为负对对，使用 CFSE 标记的细胞作为正对照，以设置门，运行样本以排序和收集分馏 CFSE 高和 CFSE 低细胞的子组。原发性正常人前列腺上皮细胞被放入纤维素涂层培养皿中，细胞生长在二D培养中保持。在通过基底膜基质转移到3D培养物时，分化的上皮细胞慢慢消失，只剩下前列腺干细胞。

2D培养中前列腺上皮细胞的双重标记，3D培养中的球体形成，显示了BrdU、CFSE和远红在同一标签保留细胞中的结离。双免疫着色表明，标签保留细胞表现出较低的细胞角蛋白14水平，减少细胞结蛋白E-cadherin，增加干细胞早期标记蛋白Wnt10b和ALDH1A1，增加自噬蛋白LC3，增加米奥辛国际IB。此外，基于球形的标签保留检测成功检测前列腺癌标本中的癌症干细胞。

CFSE标记保留干细胞和球体从人类前列腺癌标本中衍生出的球体显示的E-cadherin蛋白相对于非标记的祖细胞减少。在尝试此协议时，保持液体形式的矩阵对于培养介质制备非常重要。在四度下过夜，在配药矩阵之前将移液器提示冷藏在冰冷的PBS中。

使用基于球类的标签保留测定分离干细胞后，可以进行单细胞RNA测序和蛋白质组分析，以确定干细胞中的特定基因和新型生物标志物。通过基于球体的标签保留检测分离活体癌症干细胞，使研究人员有可能在体外生长癌症干细胞衍生的肿瘤，并筛选出新型抗癌药物。