作为酶和抗原的非重组显示系统的孢子吸附

显示抗原或酶的活细菌孢子是功能活性纳米粒子，可用作粘膜疫苗或生物催化剂。原则上，任何蛋白质都可以有效地吸附到孢子上。这种技术很简单，不需要任何基因操作。

因此，不向环境中释放重组生物体。除了人类和动物的粘膜真空学外，显示酶的孢子还可以开发为可重复使用的生物催化器。首先在200微升结合缓冲液中用2-5或10微克的型号RFP的2-5或10微克的野生类型纯化孢子标记两次10至第九B.subtilis野生型纯化孢子，在摇床上用50毫摩尔柠檬酸钠补充一小时，温度为25摄氏度。

在孵化结束时，通过离心对结合混合物进行颗粒化，将超热剂转移到新的锥形管中，以便随后进行吸附效率分析。然后，每次洗涤用200微升的结合缓冲液洗两次孢子颗粒，在第二次洗涤后将颗粒重新用100微升的新鲜结合缓冲液中重新填充。对于表面蛋白提取，将每个吸附孢子的50微升重新吸收到50微升的2X二苯丙酸钠-二硫磷，使表面孢子蛋白溶解。

在65摄氏度下45分钟后，通过离心收集混合物，并在西印上运行每卷提取的蛋白质上清液的10微升，使用单克隆抗他抗体识别在MRFPN术语N-1inus的他的标签，以识别标记的表面蛋白质。要通过荧光显微镜对吸附分子进行定位和定量化，在PBS的95微升中加入5个吸附孢子再悬浮的微升，并在单个显微镜幻灯片上添加5微升。将聚 L-Lysine 处理的盖玻片放在每张幻灯片上，然后将一张幻灯片放在荧光显微镜舞台上。

然后，对于每个字段，保存相位对比度和荧光显微镜图像。对于图像分析，请在 ImageJ 中打开荧光显微镜图像，然后选择"图像"和"类型"以确认所有图像的八位格式。从"分析"菜单中，选择"设置测量"，并确认选择了"面积、集成密度"和"平均灰色"值。

使用绘图或选择工具围绕感兴趣的孢子绘制一条线，然后从"分析"菜单中选择"测量"。将出现一个弹出窗口，其中显示所选孢子的值堆栈。选择至少50个孢子后，选择几个没有任何孢子的区域，然后重复测量以获得背景荧光的读数。

获得多个背景测量后，将结果窗口中的所有数据复制到电子表格中，并计算选定孢子区域中集成密度的平均值和背景荧光值，以获得校正的每个细胞荧光总量。对于间接吸附效率评估， 以每微升0.5纳米的浓度进行六次纯化mRFP的两倍序列稀释，最终每稀释250微升，并适当实验每个保留的上清样品的100微升，包含吸附反应的未绑定mRFP分数，每微升100微升的附着缓冲液。接下来，将一个0.45微米切口的硝基纤维素膜切成9到10厘米大小，覆盖一个五样本六点的稀释区域，而不会延伸到点印装置垫片的边缘之外。

将预编织膜放在点印装置中。检查膜的正确尺寸，并清除夹在膜和垫片之间的任何气泡。按照制造商的说明组装点印装置，并覆盖设备未使用的部分，以防止空气通过这些孔。

当设备准备就绪时，将标准加载到两个最外部的通道中，将样品加载到中间通道中，每井每井适当稀释 100 微升。装入所有样品后，打开真空泵两分钟，然后停止真空，并允许样品通过重力过滤通过膜。10分钟后，用100微升PBS清洗每井。

再运行真空泵五分钟。当洗涤缓冲液完全从设备中排出时，当真空打开时，松开螺钉并小心地打开点印装置。然后，根据标准的西方印迹协议处理膜。

对于滤波器的密度分析，打开 ImageJ 并勾勒出每个点，使用"分析、测量"命令测量集成密度（如所示）。要对图像进行背景校正，请在空区域中绘制一个圆，并测量其集成密度，如所示。将标准点的综合密度与加载的蛋白质量关联，以获得校准线，并使用校准曲线推断每个样品点的 mRFP 浓度。

然后可以计算未绑定分数中剩余的 mRFP 的浓度。仅在含有吸附孢子提取物的通道中存在预期大小的蛋白质，这表明吸附反应是成功的。吸附效率的直接评价取决于已经使用的异质蛋白，在吸附反应的分馏后，可以通过荧光显微镜和细胞荧光测量对颗粒分数进行。

然后可以使用图像J对孢子上存在的荧光信号进行定量，如所示。通过对含有未绑定蛋白质的上清液分数进行点印迹分析，可以间接分析吸附效率，随后对未绑定蛋白质进行密度分析，可以间接计算吸附到孢子上的蛋白质数量。虽然，原则上，任何蛋白质都可以吸附用作粘膜疫苗或生物催化剂，但在实践中，吸附的效率取决于蛋白质位点和化学性质。