该协议提供了一个高效的细菌显示系统，用于分离BirA的新变种，允许本地蛋白质的特定生物素化。该技术的主要优点是，它选择BirA变种使用高亲和力链球菌素的选择。这可确保删除非活动克隆，从而创建高效的选择过程。
首先，在质粒编辑器中，设计前底图，包括肽编码序列的反向补充的最后30个核苷酸，并将质粒结合核苷酸序列添加到其五个底端。设计反向底原，包括肽编码序列的反向补充的30个核苷酸，并将质粒结合核苷酸序列添加到其五个质端。然后，要建立20微升PCR反应，在薄壁PCR管中加入试剂。
将管子转移到热循环器上，然后根据手稿执行 PCR。接下来，在1%的加糖凝胶上运行五微升PCR反应，以确认6千基PCR产品的放大，然后根据手稿进行。现在，要合成具有BirA六核酸和反向底向的突变巨型基普器，在PCR管中，添加一个带准备好的目标肽序列的pBAD-BirA-eCPX的纳米图作为模板。
根据制造商的说明，设置 35 个 PCR 循环，退火温度为 60 摄氏度。然后，在1%的加糖凝胶上运行5微升的扩增反应，以验证984基对PCR产品的放大。使用商用 PCR 纯化试剂盒从扩增反应的其余 45 微升中净化 PCR 产品，并使用分光光度计对 DNA 产量进行定量测量。
在薄壁PCR管中，在制备的突变体中加入试剂，以制备样品反应。将反应混合物转移到热循环器中，然后根据手稿运行PCR。将放大反应储存在摄氏四度或冰上。
接下来，将一微升Dpn1限制酶直接加入放大反应，轻轻混合。旋转反应混合物，在37摄氏度下孵育两小时。两小时后，将T7快速lysY/Iq称大肠杆菌细胞在具有Dpn1反应两微升的管子中转化。
首先，用BirA库的1毫升，接种含有1%葡萄糖和100微克每毫升安皮西林的100毫升LB，并在37摄氏度下孵育，在200转/时摇晃。然后，接种5毫升LB，含有1%葡萄糖和100微克每毫升安他西林与100微升的过夜培养。孵育2小时30分钟，或直到培养达到约0.5的OD600。
接下来，通过体积L-arabinose、100微摩尔IPTG和100微摩尔生物素诱导eCPX和BirA表达，重量为0.2%。在 37 摄氏度下以 200 rpm 的速度摇动培养力一小时。在5000倍g下将培养物离心10分钟，然后取出上光。
将细胞重新浓缩在一毫升冰冷的PBS中，以5000倍g离心5分钟。丢弃上清液，将细胞重新储存在400微升的冰冷PBS中，并储存在冰上。然后，将10微升的重新暂停的细胞转移到1.5毫升的管标记输入中。
储存在冰上。接下来，将20微升的链球菌磁珠在一毫升的冰冷PBS中清洗，将管子放在台式磁性颗粒分离器中两分钟，小心地取出上清液。将链球菌磁珠重新悬浮在20微升的冰冷PBS中，将珠液转移到先前准备的390微升的再悬浮细胞中。
通过轻轻移液混合。然后，在4摄氏度下孵育30分钟。将带铁磁球的柱放在磁性粒子分离器中，用五毫升冰冷的PBS清洗。
将细胞和链球菌磁珠从管子转移到分离器中附加的柱中。一旦柱储液罐是空的，每次用500微升的冰冷PBS的总体积清洗柱。之后，从分离器上取下柱子，并将其放在 1.5 毫升管中。
将一毫升的冰冷PBS移到柱子上，然后使用柱塞对磁性标记的细胞进行免疫。然后，将1.5毫升的管子放入台式分离器中，用一毫升的冰冷PBS清洗磁性标记的电池。轻轻将磁性标记的细胞重新悬浮在一毫升的冰冷的 PBS 中。
将 10 微升的再分配转移到 1.5 毫升的管标记输出中。用磁性标记的细胞接种含有1%葡萄糖和每毫升100微克的LB，并在37摄氏度下孵育，在200 rpm时摇晃。第二天，将 LB 中 10 毫升的隔夜培养与甘油混合到 15% 的最终浓度，并储存在零下 80 摄氏度，使冰柜库存。
使用 100 微升的过夜文化进行下一轮选择。现在，在输入和输出样品中加入990微升的冰冷PBS，并分别将管输入10标记为负2，输出10到负2。在冰冷的 PBS 中对两个样品进行 10 倍的连续稀释，直到输入样品达到 10 到减 10，在输出样品中达到 10 到负 4。
板100微升样品从输入10到负6，输入10到负8，输入10到负10，输出10到负2，输出10到负3，输出10到负4在个别LB-ampicillin板，并在37摄氏度过夜孵育。早晨，数一数在盘子里有明显分离的殖民地的数量。将菌落计数与稀释因子相乘，获得每 100 微升的细菌浓度计数。
在此协议中，在生成了BirA变体、BirA和eCPX-AP表达式的随机变异库之后。细菌用亲和试剂孵育，废弃无约束细菌，将选定的细菌放大。pBAD-BirA-eCPX-AP表达细菌的西方印迹产生了一个22千吨石丁反应带，与eCPX在未诱导和诱导培养物中的分子量一致。
然而，他们并不在比拉六边/地。eCPX-AP表达细菌中强烈的表面生物素化在加入链球菌磁珠后引起聚集，并在管底形成颗粒，未用eCPX观察与莱辛至丙氨酸突变表达细菌。分析从链球菌素下拉的沉淀显示一个明确的22千多千吨斯特雷普他汀反应和反六氯他命带在样品从eCPX-AP培养，但不是eCPX-AP与莱辛到丙氨酸突变培养。
同样，在eCPX-AP中，与链霉素珠结合的细菌数量明显高于丙氨酸突变培养物的eCPX-AP。最重要的一步是严格清洗与链球菌束缚的细菌。严格的洗涤保证只选择含有表面显示生物素的细菌。
一旦观察到细菌的明显富集，分离的克隆可以进一步变异，从而发展出高活性的BirA变异，允许本地蛋白质的特定生物素化。
