基于 rna 的人原代成纤维细胞重组成诱导多能干细胞

由于其高效率，该方法可以进一步推进诱导多能干细胞，或IPSC作为研究人类疾病和开发新型干细胞疗法的工具。该协议的主要优点是能够从原发性人类成纤维细胞（包括难以重新编程、相关疾病、老年细胞和衰老成纤维细胞）中生成高质量的无 IPSC。该方法的成功取决于成纤维细胞的最佳RNA转染效率。

调整转染缓冲液的pH值是实现这一目标的关键过程。首先，使用500毫升和100毫升室温预热瓶新鲜减少血清介质来准备转染缓冲液。通过将 pH 米玻璃电极插入缓冲液中，测量 500 毫升瓶中介质的基 pH 值，并在读取 pH 之前等待长达一分钟。

要调整pH，在500毫升瓶中加入三到四毫升的一个氢氧化钠。合上瓶子，混合好。等待五分钟后，打开瓶子，将 pH 仪表的电极插入缓冲液中。

等待 pH 仪表上的读数稳定。继续添加少量一摩尔氢氧化钠，直到 pH 达到 8.15 至 8.17，确保在这个过程中多次校准 pH 米。使用 0.22 微米真空过滤系统过滤消毒转染缓冲液。

将灭菌缓冲液分成五毫升管，空气空间最小。验证要重新编程的成纤维细胞在 40% 到 60% 的汇合。将四毫升 DPBS 转移到 15 毫升锥形管中，并添加 100 微升重组人类层压素 521。

通过上下移液彻底混合。每孔添加一毫升稀释的重组人类层压素521到六孔板的三口井中。在37摄氏度下孵育这种涂层板两小时。

在孵育过程中，温暖6毫升的成纤维细胞膨胀介质和4毫升的电镀介质至37摄氏度。以基本FGF补充电镀介质，最终浓度为每毫升100毫微克，B18R最终浓度为每毫升200毫微克。小心地从40%到60%的成纤维细胞中吸出花的介质。

用五毫升的 DPBS 冲洗细胞。加入三毫升的三丁普辛EDTA，轻轻摇动板，用三辛EDTA覆盖细胞。吸气过量的液体，留下约500微升的三辛，并在37摄氏度下孵育成纤维细胞3分钟。

从培养箱中取出盘子后，用力小心地敲击板的一侧，以清除细胞。查看显微镜下的细胞，检查它们是否分离。向分离的细胞中加入五毫升的成纤维细胞扩张介质，以中和尝试素EDTA。

将细胞收集在15毫升锥形管中，并混合好。使用血细胞计计算细胞，然后将12，000个细胞移液到先前准备的预加热电镀介质的四毫升中。从培养箱中取出涂层板后，从井中吸入稀释的层压素521，确保井面不干燥。

轻轻重新悬浮在电镀介质中的细胞，并将一毫升的细胞悬浮液添加到每个涂层井中。将镀金细胞放入三气组织培养箱中，将低氧或氧气设置为 5%，然后通过上下交替，然后左右运动之间交替，轻轻而彻底地分散细胞，并重复运动两次，确保不旋转板。一夜之间孵育细胞。

同时，在15毫升锥形管中加入4毫升重新编程介质，并将其放在低O两个培养箱中，并用松动的帽子在一夜之间平衡。在转染前至少一小时，从低O两个培养箱中去除平衡重新编程介质。将 bFGF 添加到每毫升 100 毫微克的最终浓度中，将 B18R 添加到每毫升 200 毫微克的最终浓度中，并混合良好。

一次工作一个井，使用一毫升移液器去除花掉的介质。代之以一毫升的重新编程介质，辅以bFGF和B18R。将带细胞的板移回低氧培养箱。

要开始成纤维细胞转染，首先在室温下平衡转染缓冲液的等分约一小时。从负80摄氏度中去除一个33微升的修改 MRNA 和 14 微升的 MIRNA 仿等，并加热到室温约 3 到 5 分钟，直到解冻。在微模糊中短暂地旋转它们。

将转染试剂加热至室温约三至五分钟。反转管子两到三次，混合试剂，并在微模糊中短暂旋转。将279微升室温转染缓冲液转移到无RNA微离心管中，并加入31微升转染试剂。

通过移液彻底混合，在室温下孵育一分钟。将132微升的室温转染缓冲液加入33微升的改性 MRNA 等分，轻轻移液器混合。将 102.6 微升的室温转染缓冲液添加到 MIRNA 模拟的 14 微升等分中，轻轻移液器混合。

为了准备改性 MRNA 的转染组合，添加 310 微升转染缓冲液中的 165 微升，将转染试剂混合到转染缓冲液的 165 微升中，再加 165 微升转染缓冲液，加入改性 MRNA 混合。移液器混合。为了准备MIRNA模拟的转染混合物，添加116.6微升的310微升转染缓冲液，转染试剂混合到116.6微升转染缓冲液，MIRNA模拟混合。

混合良好，在室温下孵育15分钟，使转染缓冲液与修改的 MRNA 和 MIRNA 模拟复杂。从低氧培养箱中取出带细胞的板。在每一个井上滴明智，每井添加100微升，包含复杂、经过的 MRNAs 的转染混合物。

轻轻但彻底搅拌板向上向下，然后左右运动，以分散转染复合物。在每井中加入66.7微升的转染混合物，其中包含复杂的MIRNA模拟在每一个井的降法。轻轻但彻底搅拌板向上向下，然后左右运动，以分散转染复合物。

将带转染细胞的板放入含低氧的三气培养箱中。通过轻轻但彻底地向上向下搅拌板，然后向右移动，分散转染复合物。在第二天改变培养库之前，在培养箱中孵育转染细胞16至20小时。

将四毫升重新编程介质添加到 15 毫升锥形管中，并将其放在低 O 两个培养箱中，并用松动的盖在一夜之间进行平衡。第二天上午，用新的预平衡介质替换含有介质的转染介质，并辅以bFGF和B18R，继续按照协议中所述的转染方案。成功电镀到六井格式的井中重新编程后，成纤维细胞显得非常稀疏。

第一次成功转染后24小时，成纤维细胞失去了主轴形状，采用了更圆润的形态。在整个前三次转染过程中，细胞密度逐渐和持续增加，在第七天至第八天之间出现明显的增殖爆发。到了第10天，细胞出现大体汇合。

第一批IPSC菌落早在第11天就出现了。到了第15天至第17天，IPSC菌落变得庞大而明显，明显不同于周围和完全重新编程的成纤维细胞。多能标记 TRA-1-60 的免疫着色确认了高重新编程效率。

次优电镀密度是本协议中重新编程效率降低的最常见原因。如果电镀密度过低，则出现大细胞状男爵斑块，而 IPSC 菌落未形成。在重新编程的细胞稀释通过后，IPSC作为单菌落生长，很容易与成纤维细胞区分。

它们包装松散，单个细胞的细胞质面积相对较大。在四到七天中，IPSC 大量扩散，形成了一个特征紧密的群体，具有明确的边缘。菌落内的单个细胞显示出一个较大的核部分，具有突出的核糖。

重新编程患者成纤维细胞后，产生的IPSC可以分化成各种体细胞，以阐明疾病导致机制或开发新的再生细胞为基础的治疗。