利用单击化学辅助 rna-路特捕获 (无花果) 策略捕获和鉴定 rna 结合蛋白

这种方法，CARIC，通过提供RNA结合蛋白的全面普查，可以帮助回答基因序列后转录领域的关键问题。CARIC 的主要优点是能够捕获与各种RNA结合的蛋白质，如mRNA和非编码RNA。该方法可用于各种类型和生物体的研究RNA蛋白相互作用的工作。

首先，在37摄氏度的二氧化碳大气中，在37摄氏度的辅以DMEM中培养 HeLa 细胞。当细胞达到约80%的汇合时，用15毫升的预战新鲜培养剂取代每道菜上的培养培养。在每个菜中加入15微升100毫摩尔，最终浓度为1毫摩尔。

对于实验和没有紫外线控制样品，每盘添加 7.5 微升 100 毫摩尔 4 SU。用铝箔盖住盘子，使用先前的条件培养细胞16小时。在此之后，将先前数量的欧盟和/或四个 SU 的一半添加到相应的板中，然后继续培养两个小时。

要开始体内交叉链接，请去除培养培养剂，每次洗涤使用五毫升 PBS 用 PBS 洗三次 PBS。尽可能去除残留的 PBS。对于实验和没有四个SU控制样品，将盘子放在冰上，盖上盖子。

使用 UV 交链接器在 365 纳米和 2 个百分厘米平方下用紫外光照射细胞。对于无紫外线控制样品，请将盘子放在冰上，并保护它们免受光线照射。接下来，向每个菜中加入一毫升的预解缓冲液。

使用橡胶细胞提升器刮擦细胞，并在 15 毫升管中收集预解悬浮液。将预解缓冲液添加到含有从两个盘子的悬浮液的管子中，将总体积调整到六毫升。然后添加相等体积的 R 解解缓冲液。

用窄针通过注射器多次通过细胞的细胞，直到酸盐清晰均匀。在四摄氏度下用温和的旋转孵育利沙酸盐一小时。在此稀释20卷稀释缓冲液中的酸盐，并在15毫升的解流管中将其分成15毫升馏分，分子截止量为10千吨。

使用摆动铲斗旋转器，在 4000 倍 G 和 4 摄氏度下旋转管约 15 分钟，直到每个分数集中在小于 1 毫升的体积。在每个浓缩的利沙酸盐馏分中加入14毫升稀释缓冲液，并重复浓缩过程。然后结合分数，使用前面描述的浓度过程将它们浓缩成六毫升的体积。

首先准备文本协议中概述的反应组合。将此反应混合物添加到预清除的六毫升利沙酸盐中，并混合良好。加入162.5微升的还原试剂，混合好。

在室温下以800转/时在轨道摇床上孵育两小时。在此淬火后，加入5毫摩尔EDTA，并在室温下在轨道摇床上孵育5分钟。接下来，将反应混合物分成两个50毫升的管子，每根管中含有四卷预冷却的甲醇，并在负30摄氏度下孵育30分钟。

在4000倍G和4摄氏度的离心机15分钟。丢弃上流液，在颗粒中加入一至两毫升预冷却甲醇。上下移液以分解颗粒，确保颗粒最终完全悬浮，没有可见的块。

重复离心和再暂停过程两次。在此之后，仔细抽出残留的甲醇，确保不干扰颗粒。加入10毫升的重组缓冲液，上下移液溶解颗粒。

在4000倍G和4摄氏度的离心机10分钟。然后将上一液转移到新管中，确保收集 20 微升样品进行质量控制。将已清理和重组的样品转移到准备好的链球菌珠上。

在四摄氏度下孵育，温和旋转过夜。在 4000 次 G 下旋转珠子五分钟。将上一液转移到新管中，确保收集 20 微升样品进行质量控制。

用 10 毫升洗涤缓冲液 A. 在转速 12 rpm 和室温下温和旋转 10 分钟，清洗珠子。然后在4000次G下旋转珠子5分钟。取出上一液，再次重复洗涤和离心过程。

重复此洗涤过程以洗涤缓冲液 B 和洗涤缓冲液 C，如文本协议中所述。在此之后，用10毫升50毫升盐酸三酯洗涤珠子。将珠子在 4000 次 G 下旋转五分钟。

拆下上流液，将珠子均匀地分割在两个 1.5 微离心管之间。要开始躲避捕获的 RNP，在 400 微升洗涤、定居的珠子中加入 400 微升准备好的生物素洗脱缓冲液。在室温下以1500转/分的速度在轨道摇床上孵育20分钟。

然后在轨道摇床上孵育，热块在1500 rpm和65摄氏度，持续10分钟。将珠子在 7800 倍 G 下离心一分钟，然后收集 elud 的 RNP。向珠子添加400微升新鲜生物素洗脱缓冲液。

重复孵化和离心过程，收集第二个耳，并将两个耳管组合在一个15毫升管中。接下来，在组合的 RNP 流液中添加三卷稀释缓冲液，以降低 SDS 的浓度。使用 0.5 毫升超滤管，将样品浓缩到文本协议中概述的约 40 微升。

每微升 RNase A 添加 0.5 微克，并在 37 摄氏度下孵育两小时，以释放交对的 RNase 中的 RBP。收集两个微升的 RBC 进行质量控制。在优化 CARIC 协议时，质量控制步骤至关重要。

通过凝胶荧光分析对点击标记样品进行具有代表性的质量控制。只有双标记的样本在高分子量下显示一个强烈的涂片带，表示交联 RNP 的信号。通过省略四个 SU 或 EU 来取消 RNP 信号。它也可以通过消化与RNase A.In在某些情况下，在没有四个SU控制样本中观察到一个强大的涂抹带。

此频段表示标记的未交叉链接 RNase，在大多数情况下，该 RNase 在热加热期间会降解。通过西方印迹分析评估亲和力民意测验数据缺陷的质量控制，分析在下拉和下拉后显示样品中的生物素信号。对捕获的RSP进行银染色分析后发现，对于 HeLa 细胞，一般总捕获效率在输入蛋白的 0.05% 到 0.1% 之间。

在尝试此过程时，重要的是要记住，RNase 对核糖核素敏感。保持实验环境尽可能干净，以减少RNase的去生长。按照这个程序，使用质谱法进行蛋白质阿拉木图鉴定，可以预造铁结合蛋白。

开发后，CARIC 技术将为更全面地了解工作中邮政转录 OT 法规铺平道路。