果蝇视觉系统中低丰细胞的纯化

此方法可以帮助解决生物学中的关键问题，例如如何生成不同的细胞类型并组织成具有特定功能的更高阶结构。该技术的主要优点是，它有助于有效纯化在果蝇视觉系统中低丰度存在的细胞，用于转录和基因组分析。在协议第六周的星期二，解剖前45分钟，从4摄氏度中取回一小瓶木瓜粉，并在室温下孵育。

接下来，在室温下将完全施耐德的中、CSM 放在 Eppendorf 管中，以添加到帕帕因粉末中。解剖前5至10分钟，使用注射器将室温CSM直接通过瓶盖添加到每毫升100单位的浓度中。要混合，首先反转小瓶，捕捉卡在瓶盖内侧的任何粉末，然后上下移液。

混合试剂后，在水浴中将水在烧杯中摄氏37度。然后将小瓶放在烧杯中 30 分钟，以激活木瓜，并确保小瓶不会漂浮。当木瓜蛋白孵育时，从冰柜中取回一种蛋白解酶混合物，并在室温下孵育。

活化30分钟后，在室温下孵育木瓜。在第六周的星期二，用干净的钳子解剖冷CSM中上演的瞳孔大脑。在10分钟内解剖尽可能多的大脑，将大脑集中到一滴新的冷CSM中。

在视叶和中央大脑的交界处捏捏，切断视叶。接下来，将叶添加到包含 500 微升 1x RS 的微管底部。一个用于实验组织的微管，一个用于负对照组织。把管子放在冰上。

在一小时内解剖尽可能多的叶。将解剖的视叶汇集在单个微管中，以消除微管之间转移过程中的组织损失。使用 P200 移液器小心地将 1x RS 从微管中去除，留下足够的溶液来覆盖叶。

小心地在管的一侧添加 500 微升 1x RS。让叶沉淀到管的底部，然后移液200微升。排出混合物，观察叶移动，让叶再次沉淀。

对于这两个样品，等离子600微升的激活，室温木入微管。接下来，创建分离解决方案。将 4.2 微升室温蛋白聚解酶混合到 600 微升的木瓜溶液中，获得每毫升 0.18 WU 的最终浓度，并上下移液混合溶液。

然后小心地从每个样品中去除 1x RS，并将 300 微升分离溶液添加到叶中。在25摄氏度下孵育样品。1，000 RPM，在微管热混合器中持续 15 分钟。

在 5 分钟和 10 分钟的时间点，停止热混合器，让叶沉入微管的底部。移液200微升的解决方案和混合。孵育15分钟后，等待叶落到底部，小心地从叶上去除分离溶液，而不干扰叶。

用1xRS清洗叶两次。小心地添加 500 微升 1x RS，而不会干扰叶。然后小心地移液 200 微升，轻轻排出溶液。让叶沉入底部并重复。

接下来，用500微升的CSM洗涤每个样品两次。小心地取出 CSM，再向管子中添加 200 微升的 CSM。使用 P200 移液器，通过上下移液，直到溶液均匀，从而扰乱组织。

使用 P200 移液器，通过 30 微米网盖将电池悬浮液过滤成冰上 5 毫升传真管。并确保整个暂停通过。加入 500 微升的 CSM，冲洗分离微管。

将溶液过滤到传真管中。最后，小心地脱下传真管的盖子。使用 P200 收集网状过滤器下方的溶液，并将其添加到传真管中其余悬架中。

免疫染色叶的共体显微镜，具有针对DSRed和GP的抗体，以及24B10抗体作为拉米纳和梅杜拉神经皮的参考，证实L3是光学叶中由DSRed和GP标记的唯一细胞类型。记录了10万个事件的事实数据，其中29.9%的事件是潜在的单打。不同大小的细胞的双精度根据粒度和大小被封闭后，剩余的单个细胞，L3神经元，在P1中出现紧密的簇，与背景细胞分离得很好。

按照这个程序，其他方法，如RNA-seq或AAC-seq可以执行，以解决生物学问题，分别通过分析基因表达或染色质组织。这项技术大大提高了研究人员利用果蝇视觉系统作为模型探索复杂组织发育和功能基础的遗传机制的能力。