内源性 果蝇 瞬时受体电位通道的纯化

在该协议中，我们演示了纯化过程以获得纯化的全长TRP通道，这是研究电生理性质的必要第一步，并获得全长果蝇TRP通道的结构信息。基于INAD蛋白复合物的采样机制，使用容量高得多的低成本镍珠，可以从飞头纯化足够量的TRP通道。演示该过程的将是我们实验室的技术人员刘宇阳。

首先，使用氯化钙热休克转化方法将pGEX 4T-1 TRP 1261-1265质粒转化为大肠杆菌BL21细胞。在10毫升的卢里亚贝塔尼培养基中接种单个菌落，并在37摄氏度下过夜生长。将10毫升的播种培养物加入一升卢里亚贝塔尼培养基中，并在37摄氏度下孵育。

细胞光密度达到0.5后，将细胞冷却至16摄氏度，加入0.1毫摩尔异丙基-β-D-1-硫代糖基糖苷。过表达后，通过离心沉淀一升培养的细胞，并重悬于40毫升磷酸盐缓冲盐水中。将重悬的电池装入高压均质机中，预冷至四摄氏度。

缓慢将均质机压力增加到800巴。打开入口选项卡，让重悬的细胞循环通过带有窄缝的阀门。将5毫升谷胱甘肽珠装入重力流柱中，并用50毫升磷酸盐缓冲盐水缓冲液洗涤珠子，共三次。

将离心细胞裂解物从高压均质机中以48， 384倍离心离心机的裂解物加入约40毫升的离心细胞裂解液到重力流柱中平衡的谷胱甘肽珠中，并在4摄氏度下孵育30分钟。每10分钟重悬谷胱甘肽珠。孵育30分钟后，打开色谱柱出口选项卡以分离磁珠和流通馏分。

丢弃流过部分，并用50毫升磷酸盐缓冲盐水缓冲液冲洗剩余的谷胱甘肽珠两次。向谷胱甘肽珠中加入15毫升洗脱缓冲液，每10分钟重悬珠。将GST标记的TRP 1261-1275片段洗脱到50 mL锥形管中，并将其装入尺寸排除柱中。

每管收集5毫升洗脱的蛋白质，并通过在冷冻离心机的超滤离心柱中离心将纯化的片段浓缩至一毫升。要纯化带有 His 标记的 NORPA 863-1095 片段，请使用镍珠按照前面演示的程序进行操作。在50毫升锥形离心管中收集成蝇，并在液氮中冷冻10分钟。

用手剧烈摇动冷冻管，并将混合物转移到三个按顺序堆叠的预冷不锈钢筛中。摇动筛子，然后用刷子将飞头从40目筛上扫下来。将它们转移到五毫升锥形管中，并将它们储存在零下80摄氏度。

使用预冷的研钵和研杵在液氮中均质化0.5克头部。将匀浆的头溶解在5毫升10X裂解缓冲液中，然后在4摄氏度下以20，817倍G离心20分钟。将自旋下清液在四摄氏度下进一步离心100， 000倍G60分钟。

在重力流柱中加入1毫升镍珠，用10毫升双蒸馏水在4摄氏度下洗涤珠子三次。用10列体积的裂解缓冲液平衡磁珠，在四摄氏度下三次。将500微升纯化的600微摩尔纯化的His标记的NORPA 863-1095蛋白加入镍柱中，并孵育色谱柱。

每10分钟重悬珠子。打开色谱柱出口水龙头以分离磁珠和流出级分，并用10毫升冷裂解缓冲液洗涤镍珠。然后，将果蝇头的冷上清液均质加入镍柱中。

孵育后，用10毫升裂解缓冲液洗涤磁珠，并向磁珠中加入500微升600微摩尔GST标记的TRP 1261-1275蛋白。从重力柱中收集洗脱的分数。用10毫升结合缓冲液洗涤镍珠。

然后，加入洗脱缓冲液并从重力流柱中收集洗脱分数。浓缩从果蝇TRP通道纯化中洗脱的级分，使用四毫升超滤离心柱。将样品注入大小排阻柱，并以合理的流速洗脱蛋白质。

GST标记的TRP 1261-1275片段在大肠杆菌细胞中表达，并使用谷胱甘肽珠和尺寸排阻柱纯化。同样，使用镍珠和尺寸排除柱对His标记的NORPA 863-1095片段进行表达和纯化。洗脱的TRP通道通过尺寸排阻色谱法从过量的GST标记的TRP 1261-1275肽中分离出来。

作为副产物，INAD，ePKC，NORPA 863-1095复合物是在TRP 1261-1275肽竞争后获得的。在尝试该方案时，要记住的最重要的事情是在液氮中均质化飞头，并在含有称为DDM的洗涤剂的缓冲液中溶解匀浆物。按照这个程序，我们还可以纯化整个INAD蛋白复合物，这可以用来研究它的组装和调控机制。

该方法的潜在未来应用将是使用冷冻电镜技术研究内源性果蝇TRP通道的结构信息。此外，在人工双层脂质膜中测量纯化的内源性果蝇TRP通道的电生理性质也是可行的。