大鼠颌骨骨髓间充质干细胞的分离和培养技术

来自颌骨髓的间充质干细胞在多种分化、自我更新和免疫调节方面具有显着功能。它们已成为基因治疗、组织工程和再生医学中前体细胞的重要储存库。在这里，我们提出了一种分离大鼠颌骨髓间充质干细胞的独特方法。

骨髓间充质干细胞 （BMMSCs） 是一种具有多向分化电位的干细胞。与来源于颌骨的 BMMSCs 相比，来源于颌骨的 BMMSCs 具有更强的增殖和成骨分化能力，逐渐成为颌骨缺损修复的重要种子细胞。然而，下颌骨具有复杂的骨结构，松质含量低于附肢骨。使用传统方法很难获得大量高质量的颌源性骨髓间充质干细胞。本研究提出了一种用于分离和培养大鼠颌骨髓间充质干细胞 （JBMMSC） 的“基于生态位的干性方法”。采用全骨髓贴壁法结合骨切片消化法分离培养原代大鼠 JBMMSCs。通过细胞形态学观察、细胞表面标志物检测和多向分化诱导，将分离的细胞鉴定为 JBMMSC。通过这种方法提取的细胞呈现“成纤维细胞样”纺锤形。细胞很长，呈纺锤形，呈成纤维细胞状。流式细胞术分析显示，这些细胞的 CD29、CD44 和 CD90 阳性，但 CD11b/c、CD34 和 CD45 阴性，这与 BMMSCs 特征一致。这些细胞表现出很强的增殖能力，可以发生成骨、成骨和成软骨分化。本研究为在短时间内获得足够多、具有强分化能力的高质量JBMMSCs提供了一种有效、稳定的方法，可促进生物功能、再生医学及相关临床应用的进一步研究。

间充质干细胞 （MSC） 首先在骨髓中发现，显示出在培养物中形成粘附集落的能力和强大的成骨潜力¹。Pittinger 等人² 进一步发现了它们对骨骼、脂肪和软骨的多向分化潜力。尽管来自不同来源的所有间充质干细胞都具有多向分化的潜力，但与来自其他组织的间充质干细胞相比，骨髓间充质干细胞具有最强的软骨形成分化潜力，使其成为骨组织工程的最佳候选细胞³.然而，许多研究证明，来自不同来源的 BMMSCs 具有位点特异性特征和特性，例如成骨分化能力和细胞增殖活性 ^4,5。这可能是由于颌骨和阑尾骨或髂嵴⁶ 之间的胚层不同。

颌骨髓间充质干细胞 （JBMMSC） 起源于神经外胚层的神经嵴细胞，而股骨来源的 BMMSCs 起源于中胚层⁷。与来源于长骨和髂嵴的 BMMSCs 相比，JBMMSCs 具有更高的增殖率、ALP 活性和成骨电位⁸。此外，BMMSCs 在组织和器官中的应用效果可能因不同的细胞类型和环境而异⁹。颌骨缺损的修复主要取决于颌源间充质干细胞的募集。因此，研究 JBMMSCs 可为其在颌骨组织工程中的临床应用提供实验依据¹⁰.然而，基础研究和临床应用主要集中在源自阑尾骨和中轴骨的 BMMSCs¹¹。对 JBMMSC 的研究有限，这可能是由于下颌骨中松质骨含量低以及大鼠下颌的松质骨含量甚至更低¹²。因此，使用普通骨髓冲洗方法很难分离颌骨来源的骨髓间充质干细胞，该方法通常用于从附肢骨或髂嵴¹³ 中分离 BMMSCs。基于 Hong 等人 ¹⁴ 和 Cheng 等人 ¹⁵ 的方法，我们假设致密骨消化和骨髓冲洗方法的结合可以有效分离大鼠 JBMMSC。

本研究旨在建立一种分离大鼠 JBMMSCs 的有效方法，并为颌骨组织工程提供充足的种子细胞来源。

该方案得到了中国人民解放军总医院机构动物伦理委员会的批准。使用 13 周龄雄性 Wistar 大鼠进行实验。有关动物、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表。

1. 实验准备

1. 在高温高压下对所有手术器械进行消毒，包括眼科剪刀、镊子和骨咬合器。
2. 提前准备培养基。
   1. 制备含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素的 α-MEM 完全培养基。
   2. 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中制备 0.1% II 型胶原酶。
   3. 在一次性无菌 50 mL 离心管中制备 50 mL 含 1% 青霉素-链霉素的 PBS。

2. 大鼠 JBMMSCs 的分离和培养

1. 按照以下步骤分离大鼠下颌骨：
   注：为保持样品无菌，所有金属手术器械在使用前必须在酒精灯火焰下高温消毒至少三秒钟。
   1. 通过腹膜内注射用 2% 戊巴比妥钠 （2 mL/kg） 麻醉大鼠。
   2. 在呼吸频率降低且肌肉完全放松后，通过颈椎脱位（遵循机构批准的方案）处死麻醉大鼠。
   3. 将大鼠浸入 75% 乙醇中 30 分钟消毒，然后将其转移到超净台上。
   4. 将大鼠放在一次性无菌布上或无菌容器中，并保持仰卧位。
   5. 沿支切割和分离从口角到关节的皮肤和肌肉，然后用眼剪刀水平切割颞下颌关节盘和双侧外周韧带，将髁突与关节盂窝分离。
      注意：通过移动下颌骨并从外部观察髁突的位置来确定颞下颌关节的位置。
   6. 用剪刀从下切牙颊侧的前庭沟向左右两侧切割和分离下颌外侧的肌肉和结缔组织。
   7. 从舌系带到下颌骨后部区域切开下颌骨的舌肌。
   8. 从颅骨上取下下颌骨。
   9. 用眼科剪刀剪下门牙之间的联合，将下颌骨分成两半。
   10. 使用眼科剪刀和镊子小心地去除下颌骨上剩余的附着肌肉、筋膜和其他软组织。
2. 隔离 JBMMSC。
   1. 将咬牙的喙放在门牙与第一磨牙近中部分的交界处，用咬牙切断下切牙与下颌骨的连接处，将下门牙完全拔出。
   2. 去除所有带有骨咬合器的磨牙。
   3. 用骨咬合器切除下颌支，并通过沿最后一颗磨牙¹⁶ 的远端边缘分离下颌骨的中央部分来暴露骨髓腔。
   4. 用 1 mL 一次性无菌注射器吸取 α-MEM 完全培养基。将针头插入骨髓腔，用 α-MEM 完全培养基反复将骨髓冲洗到培养皿中，直到骨骼变白。
   5. 将骨髓冲洗溶液收集到 15 mL 离心管中，并在室温下以 800 x g 离心 3 分钟。
   6. 用移液管弃去上清液，用 10 mL α-MEM 完全培养基重悬细胞，然后将它们接种到新的 10 cm 培养皿中。
   7. 用咬合器将冲洗的下颌骨分成 1-3 mm³ 的骨片，并在 37 °C 下用 3 mL 的 0.1% II 型胶原酶在 200 rpm/min 的摇床中消化 90 分钟。
   8. 在室温下以 800 x g 离心消化的下颌骨 3 分钟，然后弃去上清液。
   9. 在 37 °C 下，在 5% CO₂ 加湿培养箱中，用 α-MEM 完全培养基培养收获的细胞和消化的骨片。
   10. 72 小时后用新鲜培养基更换一半的培养基，然后每 2 天完全更换一次。
       注意：前三天不要移动培养皿。
   11. 当贴壁细胞达到 80%-90% 汇合时，以 1：2 的比例传代贴壁细胞。在第二次传代培养期间去除骨片。使用 P2 或 P3 代的细胞进行实验。

3. 用于鉴定细胞表面标志物的流式细胞术

1. 在流式细胞术缓冲液中重悬 P2 代的 JBMMSC。使用自动细胞计数器对细胞进行计数，并将浓度调节至 3 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 向每个微量离心管中加入 100 μL 细胞悬液和 2 μL 单克隆抗体（CD11b/c、CD29、CD34、CD44、CD45 和 CD90）。在 4 °C^17,18 下孵育 30 分钟。
3. 用 200 μL 流式细胞术缓冲液洗涤样品两次，并在室温下以 250 x g 离心 5 分钟。去除上清液。
4. 向每个试管中加入 100 μL 流式细胞术缓冲液和 2 μL PE 标记的荧光二抗。在 4 °C 孵育 30 分钟。
5. 重复步骤 3.3。
6. 将 JBMMSCs 重悬于每管 300-500 μL 流式细胞术缓冲液中。
7. 使用流式细胞仪进行流式细胞术分析。
   注：使用同源抗体作为阴性对照，以消除由抗体的非特异性组合引起的背景染色。

4. 细胞增殖测定

1. 将 P3 代 JBMMSCs 以每孔 5 × 10³ 个细胞的密度接种到 96 孔板中。
2. 向每个孔中加入 10 μL CCK-8 溶液。
3. 将 96 孔板放入培养箱中 2 小时，并使用酶标仪测量吸光度（450 nm 处的 OD 值）。
   注意：连续 7 天每天在同一时间进行测试。

5. 菌落形成能力

1. 将第 3 代的 1000 个 JBMMSCs 接种到 10 cm 培养皿中，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下培养。
2. 每 3 天更换一次培养基。
3. 连续培养 15 天后进行结晶紫染色。
4. 接下来，用甲醇固定细胞 5 分钟，并用 2% 结晶紫染色 5 分钟。

6. JBMMSC 的多谱系分化

注意：使用 P3 生成的 JBMMSCs 进行多谱系分化。对照组用 α-MEM 完全培养基培养。

1. 进行成骨分化。
   1. 在六孔板中每孔接种 1 ×^{10 个 5} 个 JBMMSC。
   2. 当细胞汇合度达到 70% 时，将培养基更换为成骨诱导培养基。
      注意：每 3 天更换一次成骨诱导培养基。
   3. 成骨诱导 7 天后进行碱性磷酸酶 （ALP） 染色。
   4. 从六孔板中取出培养基，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   5. 在室温下用 ALP 染色溶液对细胞染色 30 分钟，并避光保存。
   6. 冲洗细胞直到没有染色溶液残留，并在显微镜下观察样品。
   7. 成骨诱导 21 天后进行茜素红染色。
   8. 用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟后，用茜素红染色液对细胞染色 5 分钟。
   9. 用 PBS 洗涤细胞，直到没有茜素红染色液残留。
   10. 在显微镜下观察钙结节的数量。
2. 进行成脂分化。
   1. 在六孔板中每孔接种 1 × 10^{个 5} 个 JBMMSC。
   2. 当细胞汇合度达到 70% 时，将培养基更换为成脂诱导培养基。
      注意：每三天更换一次成脂诱导培养基。
   3. 成脂诱导 14 天后进行油红 O 染色。
   4. 从六孔板中取出培养基，用油红 O 固定液固定细胞 20-30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   5. 取出固定液，用蒸馏水洗涤细胞两次。
   6. 将细胞浸入 60% 异丙醇中 20-30 秒。
   7. 去除 60% 异丙醇，用油红 O 染色对细胞染色 20-30 分钟。
   8. 去除染色液，用 60% 异丙醇冲洗细胞 20-30 秒，然后用蒸馏水洗涤。
   9. 用苏木精溶液对细胞核染色 1-2 分钟。
   10. 取出苏木精溶液，用蒸馏水洗涤细胞 2-3 次。加入油红 O 缓冲液 1 分钟，然后取出。
   11. 在显微镜下观察脂滴的数量。
3. 进行软骨形成分化。
   1. 在六孔板中每孔接种 1 ×^{10 个 5} 个 JBMMSC。
   2. 当细胞汇合度达到 70% 时，将培养基更换为软骨形成诱导培养基。
      注意：每 3 天更换一次软骨形成诱导培养基。
   3. 软骨形成诱导 21 天后进行 Alcian 蓝染色。
   4. 从六孔板中取出培养基，在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 30 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次。
   5. 在 37 °C 下用 Alcian 蓝染色细胞 1 小时。
   6. 冲洗细胞直到没有染色溶液残留，并在显微镜下观察它们。

7. 实时 PCR

1. 使用 RNA 提取试剂盒提取总 RNA，并用酶标记物测量 RNA 浓度（按照制造商的说明）。
2. 使用 500 ng RNA 合成 cDNA¹⁹。
3. 在实时系统上使用 10 μL qRT-PCR 混合物进行 qRT-PCR，其中含有 1 μL cDNA、3.5 μL 双蒸水、5 μL SYBR 和 0.5 μL 引物混合物 （0.1 μM）。
   注意：引物序列列于 表 1 中。热循环条件如下：50 °C 2 min，95 °C 2 min，然后是 95 °C 15 s、60 °C 2 min 的 40 次循环，然后从 60 °C 到 95 °C 以 0.5 °C 的增量循环 5 s，形成熔融曲线。
4. 使用 GAPDH 作为内部对照¹⁶.

细胞接种 72 小时后，大多数细胞呈悬浮和圆形，极少数细胞粘附在壁上（图 1B）。到第 5 天，贴壁细胞集落出现，呈现纺锤形或成纤维细胞样形状（图 1C）。到第 7 天，贴壁细胞达到 90% 汇合，形成具有少量间歇性悬浮细胞的“鱼群”形状（图 1D）。传代细胞生长迅速，每 3 天传代一次。细胞形态相对均匀，主要是纺锤形，汇合后呈涡状排列（图 1E-G）。

流式细胞术分析显示间充质干细胞表面标志物 CD90 、 CD29 和 CD44 表达水平高，阳性率分别为 97.2% 、 97.7% 和 95.7%。相反，造血干细胞表面标志物 CD45 、 CD34 和 CD11b/c 显示低表达，阳性率分别为 1.37% 、 0.66% 和 1.49% （图 2A）。培养 2 周后，JBMMSC 显示定植，结晶紫染色证明（图 2B）。它们在体外表现出稳定的扩增能力，细胞生长曲线遵循典型的“S 状”模式（图 2C）。细胞增殖过程包括潜伏期、对数生长期和平台期。2 天后开始快速增长，6 天后放缓。单个细胞表现出自我复制和增殖的特征。

细胞在^第 7 天表现出蓝紫色 ALP 染色颗粒，在^第 21 天表现出红色矿化结节。此外，在成脂诱导 14 天后，细胞显示红色珠状脂滴，而软骨形成分化诱导导致蓝色软骨样组织的形成（图 3A）。此外，成骨诱导 7 天后，JBMMSC 中 ALP 、 OCN 和 Runx2 的 mRNA 表达水平升高¹⁵ （图 3B）。

图 1：JBMMSC 的分离和培养。（A） 方案概述。（B - D）在原代培养物中分别培养 3 天、5 天和 7 天的细胞图像。（E-G）分别是 P1、P2 和 P3 细胞的图像。比例尺：100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

图 2：JBMMSC 的鉴定。 （A） 大鼠 JBMMSC 的流式细胞术分析结果。流式细胞术分析显示，这些细胞的 CD29、CD44 和 CD90 呈阳性，与 BMMSCs 的特征一致。相反，它们的 CD11b/c 、 CD34 和 CD45 呈阴性。（B） 用结晶紫染色的 JBMMSC 菌落的代表性图像（比例尺：100 μm）。（C） 细胞生长曲线显示细胞增殖速率。数据和误差线表示均值±标准差 n = 3。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：JBMMSC 的多系（成骨、成骨和成软骨）分化。 （A） 成骨诱导 7 天后，观察到 ALP 活性增加。成骨诱导后 21 天，许多矿化结节被茜素红染色为红色。油红 O 染色显示大量脂滴。Alcian 蓝染色突出显示了软骨形成诱导后诱导成软骨细胞的细胞。（B） 成骨诱导 7 天后 JBMMSCs 成骨相关基因 ALP 、 OCN 和 Runx2 的 mRNA 表达。（***P < 0.001， 与对照组相比）。数据和误差线表示均值±标准差 n = 3。比例尺：100 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

表 1：实时荧光定量 PCR 中使用的引物。

骨髓间充质干细胞 （BMMSCs） 是存在于骨髓中的非造血干细胞的一个亚群，其特征是具有自我更新能力、多向分化电位和造血支持功能。这些细胞在各种生理过程中起着关键作用，例如组织再生、血管生成和细胞活动的调节²⁰。因此，BMMSCs 经常作为最佳种子细胞来源用于组织修复和再生工程²¹。

颌骨髓间充质干细胞 （JBMMSC） 最初由 Matsubara 等人于 2005 年从人颌骨髓抽吸物中分离出来²²，与其他骨骼部位相比，由于颌骨的独特起源和发育途径，表现出独特的分化特征 ^4,23。鉴于支配颅面骨的不同发育和病理机制，由于其同源发育特征，在颅面骨缺损的修复中优先考虑 JBMMSC 似乎势在必行²³。此外，由于它们共享胚胎组织起源，JBMMSC 与口腔微环境的组织相容性增强^24,25。尽管有这些优势，但 JBMMSC 的标准化和安全分离方案仍然难以捉摸，对 JBMMSC 的研究仍然相对有限。

BMMSCs 的分离和培养目前缺乏标准化，常用的方法包括免疫磁珠分选、流式细胞术分选、密度梯度离心和全骨髓贴壁培养²⁶。其中，免疫磁珠法和流式细胞术分选法通过识别细胞表面的特异性抗原来分离细胞。然而，这些方法涉及繁琐的操作，需要专门的仪器，并且尽管产生高纯度的细胞，但仍可能影响细胞活性²⁷。密度梯度离心法通过离心和分层分离细胞，这会改变细胞微环境，导致细胞生长变慢和细胞衰老加剧²⁸。相反，全骨髓贴壁培养方法通过间歇性更换培养基并根据骨髓中不同细胞类型之间的不同贴壁能力传代来分离和纯化 BMMSCs。这种方法对细胞造成的损伤最小，并且易于执行¹⁶.

与股骨相比，颌骨体积更小，骨髓腔更窄，受到牙齿或牙周韧带细胞的干扰。骨髓冲洗粘附法需要的骨髓量相对较大，适用于大型动物和人类²⁹。通过应用传统骨髓冲洗方法提取的大鼠中的 JBMMSCs 数量罕见，增殖缓慢，质量差^30,31。骨髓中 JBMMSCs 的含量非常低，主要存在于致密骨和骨内膜中。Bu-Kyu Lee 等人³² 使用下颌骨抽吸物分离 JBMMSC，而 10 mL 骨髓血液用于下颌骨的总抽吸时间是髂嵴的 5 倍，下颌骨 MSCs 的初始产量是髂嵴的 3 倍。单独冲洗骨髓不能有效地分离致密骨和骨内膜中的细胞。

近年来，研究发现，致密骨是一种新的可靠 BMMSCs 来源，并衍生出一种相对简单的 BMMSC 分离方法，即骨切片消化培养法³³。通过该方法分离的 BMMSCs 具有高纯度³⁴。Guo 等人³⁵使用骨切片消化培养方法成功地从小鼠股骨中分离出骨间充质干细胞。Yamazaet ^al.12 和 Cheng et ^al.15 将骨切片消化培养方法应用于小鼠下颌骨髓间充质干细胞的分离，并通过细胞增殖、免疫表型和多系分化验证了 MSC 特性。本实验采用冲洗全骨髓粘附和骨切片消化相结合的方式分离和培养原代大鼠 JBMMSC。将骨髓从腔中彻底洗出，无需过滤，以保持骨髓中原始的细胞组成和生长因子。然后，将骨片切成小块并使用 II 型胶原酶消化，以促进细胞从骨碎片中爬出。最后，将骨片接种到培养皿上并培养，以使细胞从骨片中爬出。该组合方法使原代细胞的培养系统同时包含造血干细胞、松质骨和皮质骨的成分，能更好地模拟体内骨髓间充质干细胞的微环境，更有利于维持细胞原有的生物学特性。因此，这种方法被称为“一种基于生态位的干性方法”³⁶。Luet ^al.37 还强调了干细胞生态位在 BMMSCs 分离中的重要性，但它们只涉及骨髓中的微环境，而没有皮质骨。该方法已成功应用于从小鼠³⁸ 颌中分离骨髓间充质干细胞。

我们还用这种基于生态位的方法成功地分离和培养了大鼠 JBMMSC。首先，分离的细胞呈现成纤维细胞样形状， 并在体外粘附在塑料培养板上。其次，细胞阳性表达 CD90 、 CD29 和 CD44 表面标志物，负表达 CD45 、 CD34 和 CD11b/c。第三，细胞可以分化成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞。获得的细胞具有良好的形态、快速的增殖速率和分化能力，符合国际细胞治疗学会¹⁷ 提出的鉴定人源间充质干细胞的最低标准。

JBMMSCs 的分离已被开发并用于分离人类细胞。Matsubara 等人²² 最早在口腔手术期间从人肺泡骨髓样本中分离出 JBMMSC。在下颌骨穿刺过程中可能会出现并发症，包括对邻近组织的损伤、口腔细菌污染引起的感染等。Zong 等人³⁹ 冲洗松质骨标本块的骨髓腔以获得人 JBMMSC。Park 等人⁴⁰ 使用顺序消解法从种植体钻孔过程中获得的牙槽骨碎片中分离出人 JBMMSC。Mason 等人⁴¹ 直接从接受常规种植牙植入的患者的颌骨髓核心和抽吸物中分离出人 JBMMSC。从抽吸物或核心中分离细胞的成功率很高，联合用药的成功率也更高。然而，尽管上述方法已经成功地从人类中分离出 JBMMSC，但需要比较方法之间有效性的差异。目前，提出的这种方法仅用于小鼠和大鼠，还没有将该方法应用于人 JBMMSC 分离的研究。这种方法有局限性，尤其是当它应用于人类时。首先，这种结合骨髓冲洗和骨切片消化的方法比较复杂，需要的步骤更多。其次，复杂的过程对操作的无菌性提出了更高的要求，这对实验方案至关重要。第三，不可能冲洗人类颚骨的整个骨髓腔，因此有必要探索一些等效的方法，例如冲洗松质骨碎片。

综上所述，本研究基于“干细胞生态位”原理，采用骨髓冲洗和骨切片消化相结合的方式，成功分离培养大鼠 JBMMSC。细胞鉴定结果证实，该方法能够分离出足够、高纯度的 JBMMSC，为颚骨组织工程提供了充足的细胞来源，特别是在骨缺损修复方面，具有重要意义。

作者没有什么可披露的。

本研究得到了军委后勤部保健项目 （19BJZ22）、北京市自然科学基金 （7232154） 和第四军医大学临床研究项目 （2021XB025） 的支持。