تنقية البروتين المؤتلف من البكتيريا هي طريقة راسخة. ومع ذلك، قد تحدث العديد من المشاكل عند استخدام هذه التقنيات. وجود طرق لاستخراج البروتين من الأنسجة أمر جذاب بالتأكيد.
الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكن للمرء استخراج البروتين في شكله الفسيولوجي بما في ذلك جميع التأثيرات المتبادلة التي قد تؤثر على نشاطه القابل للطي والتحفيز. يمكن تكييف هذا النهج مع البروتينات الأخرى ذات الأهمية وتعديله للأنسجة الأخرى. البروتين النقي من الأنسجة قد يدعم تطوير الأجسام المضادة عالية الجودة والمثبطات الدوائية.
للبدء ، قم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل البروتين عن طريق خلط 250 ملليلتر من PBS مع فلوريد الصوديوم 50 ملليمولار ، وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل واحد ، وميكروغرام لكل ملليلتر أبروتينين ، وواحد ملليمولير تنشيط أورثوفانادات. قم بتصفية الحل باستخدام وحدة تصفية حقنة 0.22 ميكرومتر. تحضير أنابيب مع اثنين ملليلتر من المحلل التحلل لكل غرام من الأنسجة ووضعها على الجليد.
لإعداد عينة الأنسجة ، قم بتشريح الأنسجة التي يبلغ حجمها حوالي 100 ملليغرام على صفيحة زجاجية نظيفة مسبقا موضوعة على الجليد في صندوق رغوة البوليسترين. انقل قطع الأنسجة إلى الأنابيب المعدة للتحلل اللاحق. لإعداد محلول كبريتات الأمونيوم المشبع ، قم بتسخين 500 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج إلى 70 درجة مئوية.
أثناء التحريك ، أضف تدريجيا مسحوق كبريتات الأمونيوم حتى لا يذوب المزيد من كبريتات الأمونيوم. قم بتبريد هذا المحلول المشبع إلى درجة حرارة الغرفة وتخزينه عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. لتجانس أنسجة الكلى الخنازير ، سونيك التعليق ويفضل أن يكون ذلك عن طريق مسبار بالموجات فوق الصوتية مع الحفاظ على العينة على الجليد.
في حالة أنسجة كبد الفأر ، استخدم مجانسا كهربائيا واغسله بانتظام في PBS لمنع الانسداد مع الحفاظ على العينات على الجليد. خذ 20 ميكرولتر من العينات وتحقق تحت المجهر مما إذا كانت خلايا الأنسجة المتجانسة قد دمرت بشكل صحيح. خلاف ذلك ، كرر التجانس.
الطرد المركزي للأنابيب في 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. جمع supernatant في أنبوب جديد ووضعه على الجليد. قم لاحقا بتصفية supernatant باستخدام وحدات مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر.
Aliquot supernatant في دفعات 10 ملليلتر وتجميدها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين على المدى القصير أو عند ناقص 80 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول. قم بإعداد عينة 50 ميكرولتر ل SDS-PAGE أو تحليل اللطخة الغربية عن طريق إضافة 10 ميكرولترات من خمسة أضعاف مخزن عينة SDS إلى 40 ميكرولتر من supernatant ثم غليها عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تحضير هلام متقطع 12.5٪ بولي أكريلاميد SDS-PAGE وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
لإجراء تحليل SDS-PAGE ، قم بتحميل آبار الجل لاحقا بسلم علامة البروتين ، وخمسة نانوغرام من البروتين المؤتلف FAHD1 البشري كعنصر تحكم إيجابي ، و 20 ميكرولتر من العينة المراد تحليلها ، والآبار المتبقية مع 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعينة SDS-PAGE المحضر. قم بتشغيل المواد الهلامية SDS-PAGE عند 125 فولت باستخدام المخزن المؤقت SDS قيد التشغيل. بعد اكتمال SDS-PAGE ، قم بإجراء تحليل لطخة غربية ، وقم بفحص الأغشية باستخدام الجسم المضاد المتاح المرفوع ضد FAHD1.
بعد تحضير الأليكوتات الفائقة كما هو موضح سابقا ، إما العملية بعد الذوبان أو المعالجة مباشرة بعد استخراج البروتين دون تجميد العينة. قم بتصفية العينة باستخدام وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر لاستبعاد الرواسب المحتملة بعد الذوبان. قم بإعداد ستة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر على الجليد ، ثم انقل 250 ميكرولتر من العينة إلى كل أنبوب.
إعداد سلسلة تخفيف من كبريتات الأمونيوم في الأنابيب المحضرة وتشكيل الحجم النهائي إلى 1،000 ميكرولتر مع المخزن المؤقت لتحلل البروتين. احتضان العينات عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على دوار الأنبوب. باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة ، جهاز طرد مركزي بسرعة 10،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية ونقل جميع المواد الفائقة بعناية إلى أنابيب منفصلة.
قم بتجفيف الكريات الناتجة بالهواء وإعادة تعليق كل منها في 1000 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. لكل زوج من الكريات المعاد تعليقها و supernatant من الخطوة السابقة ، امزج 40 ميكرولتر مع 10 ميكرولترات من خمسة أضعاف المخزن المؤقت لعينة SDS واغلي عند 95 درجة مئوية مع أغطية مفتوحة حتى يتبخر معظم السائل. ثم أعد تعليق الكريات في خليط من 50٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد في ماء مقطر مزدوج.
قم بإجراء SDS-PAGE عن طريق تحميل العينات المشتقة من الكريات المعاد تعليقها و supernatant في أزواج ، متبوعة بتحليل لطخة غربية. ومع ذلك ، قم بتشغيل المواد الهلامية عند 80 فولت لمدة ثلاث ساعات. قم بإعداد نظام FPLC باستخدام عمود التبادل الأنيوني أو الكاتيوني.
اغسل العمود بخمسة أحجام عمود من 20٪ إيثانول في ماء مقطر مزدوج ، متبوعا بخمسة أحجام عمود من الماء المقطر المزدوج. ضع العينة على العمود إما عن طريق الحقن أو باستخدام مضخة عينة وجمع التدفق من خلالها. اغسل العمود بحجم عمود واحد من المخزن المؤقت منخفض الملح.
قم بإعداد إزالة التدرج الخطي من مخزن مؤقت منخفض الملح بنسبة 100٪ إلى مخزن مؤقت عالي الملح بنسبة 100٪ ضمن ثلاثة أحجام أعمدة. جمع باستمرار واحد ملليلتر الكسور. بعد انتهاء التدرج ، استمر في التشغيل باستخدام مخزن مؤقت عالي الملح حتى لا يتم اكتشاف المزيد من القمم المرتبطة بالبروتين في الكروماتوجرام على نطاق حجم عمود واحد.
ضع ملليلتر واحد من 25٪ SDS المذاب في 0.5 هيدروكسيد الصوديوم المولي والماء المقطر المزدوج لتنظيف العمود. اغسل العمود على التوالي بثلاثة أحجام عمود من الماء المقطر المزدوج وثلاثة أحجام عمود من الإيثانول بنسبة 20٪ في الماء المقطر المزدوج. اجمع عينات SDS-PAGE لجميع كسور الذروة والتدفق.
قم بتجميد الأجزاء المجمعة في النيتروجين السائل وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد فحصها عن طريق اللطخة الغربية ، قم بإذابة وتجميع الكسور التي تحتوي على البروتينات ذات الأهمية وتجاهل الآخرين. لتنفيذ خطوة التنقية ، قلل من حجم محلول البروتين إلى ملليلترين باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة.
قم بتصفية المحلول بالتتابع باستخدام وحدات تصفية حقنة 0.45 ميكرومتر و 0.22 ميكرومتر لإزالة أي هطول مجهري. قم بموازنة عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع حجم عمود واحد من المخزن المؤقت الجاري الذي يحتوي على ثنائي ثيوثريتول مللي مولار واحد. قم بتحميل العينة على العمود وقم بتشغيل وحدة الكروماتوغرافيا حتى يتم التخلص من جميع البروتينات كما هو موضح سابقا.
قم بإعداد عينات 50 ميكرولتر ل SDS-PAGE وتحليل البقع الغربية الموصوفة سابقا. اغسل العمود على التوالي بحجم عمود واحد من الماء المقطر المزدوج وحجم عمود واحد من 20٪ من الإيثانول في الماء المقطر المزدوج. بعد إجراء تحليل اللطخة الغربية ، قم بتجميع جميع FAHD1 التي تحتوي على كسور.
قلل حجم محلول البروتين إلى ملليلترين باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي الفائقة. يظهر فحص اللطخة الغربية وجود الخنازير FAHD1 في supernatant مع شريط عند 25 كيلودالتون بينما يعمل التحكم الإيجابي الموسوم عند 34 كيلودالتون . تم تنقية الخنازير FAHD1 من lysate بواسطة كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني وتمت إزالة البروتينات الملزمة عن طريق الاستخلاص.
تم تحديد الكسور التي تحتوي على الخنازير FAHD1 من خلال تحليل اللطخة الغربية ، مجمعة ومركزة. تم تنقية عينات البروتين من قبل SEC وتم تحديدها من خلال تحليل اللطخة الغربية. كان محصول بروتين FAHD1 الخنازير حوالي ملليغرام واحد مع مستوى 80٪ من النقاء.
كشف تحليل اللطخة الغربية عن بروتين FAHD1 للفأر في التدفق جنبا إلى جنب مع البروتينات الأخرى. تم تطبيق التدفق من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. تم تجميع الكسور التي تحتوي على FAHD1 وتركيزها وتطبيقها على تحليل SDS-PAGE.
ومع ذلك ، فإن غلة البروتين لم تكن عالية جدا. يزداد النشاط الأنزيمي المحدد للخنازير FAHD1 مع مستوى النقاء عند زيادة الكمية النسبية ل FAHD1 لكل بروتين كلي. تركيزات أعلى من كبريتات الأمونيوم تسبب تأثير الابتسامة ، والتي يمكن حلها في الجهد المنخفض.
تم العثور على مزيد من البروتين في lysate و supernatant بتركيز 15٪. ومع ذلك ، عند تركيزات أعلى ، قد تترسب العينات ولا يمكن اكتشافها. يتطلب البروتوكول المعروض هنا أن يكون البروتين قابلا للحل.
يجب اختبار وتحديد الظروف المثلى لهطول الأمطار ودرجة الحموضة أو تعديل الحجم للكروماتوغرافيا. يتم دعم دراسة الوظيفة الأنزيمية ، والتحقيق في بنية البروتين وتطوير الأجسام المضادة بشكل كبير عند استخراج البروتين من الأنسجة بدلا من استخراجه من البكتيريا.
