يحدد هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار بدرجة كبيرة لتقييم إشارات Wnt غير المتعارف عليها وظيفيا وجزيئيا في أي مجموعة خلايا ذات أهمية. يتم إجراء التقييمات الوظيفية والجزيئية في نفس عدد الخلايا ويمكن تطبيقها لدراسة أي مكون من مكونات مسار Wnt / PCP. للبدء ، أعد تعليق خلية C2C12 التي تم تكبويرها سابقا في 10 ملليلتر من وسط C2C12.
لتخفيف الخلايا بنسبة 1:20 ، أضف 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية في أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على 9.5 ملليلتر من وسط C2C12 الطازج واخلطه برفق مع ماصة مصلية باستخدام ماصة P1000 ، أضف ملليلتر واحد من تعليق الخلية المخفف إلى كل بئر من بئر جديد من أربع غرف وضعه في الحاضنة. لطلاء إدراج خلية O9-1 ، أعد تعليق حبيبات الخلية O9-1 في 10 ملليلتر من وسط نمو O9-1. وعلى غرار تخفيف الخلايا C2C12 ، قم بتخفيف خلايا O9-1 بنسبة 1:20.
بعد ذلك ، ضع ملحقا واحدا قابلا للاختراق داخل كل بئر من بئر جديد من أربع غرف مملوء بملليلتر واحد من وسط نمو O9-1. أضف 300 ميكرولتر من معلق الخلية O9-1 المخفف إلى كل ملحق وتأكد من غمر الحشوة بالكامل. ثم احتضان البئر عند 37 درجة مئوية.
لأداء ضربة قاضية siRNA في خلايا O9-1 ، قم بتخفيف siRNA وكاشف النقل في وسط المصل المختزل وفقا لتوصيات الشركة المصنعة بالتركيزات المطلوبة. امزج بلطف siRNA المخفف وكاشف النقل واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق. بعد 18 إلى 24 ساعة من طلاء الخلية ، أضف مجمعات الدهون siRNA إلى إدخالات خلية O9-1 واحتضانها لمدة 34 إلى 48 ساعة تقريبا.
عندما تصل الخلايا إلى 70 إلى 80٪ التقاء ، قم بإزالة الوسط من غرفة C2C12 جيدا واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. بعد إزالة PBS ، ابدأ في خدش الخلايا عن طريق تمرير طرف ماصة P10 معقم بإحكام في اتجاه واحد ليمتد بطول أو عرض الخلية أحادية الطبقة بالكامل. بمجرد خدش الخلايا ، أضف بسرعة ملليلتر واحد من PBS.
بعد ذلك ، قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر. ضع شريحة الحجرة على المسرح وقم بتدوير قرص الهدف إلى تكبير 5X. افتح برنامج التصوير.
انقر فوق علامة تبويب الكاميرا ثم انقر فوق الزر Live لتصور الخلايا الموجودة في علامة التبويب AxioCam IC. تأكد من سحب مرشح الضوء بالكامل للسماح للضوء بالمرور إلى الكاميرا وشاشة الكمبيوتر ، وقم بتحريك أو تدوير شريحة الحجرة يدويا لوضع منطقة الجرح في وسط الصورة الحية على علامة التبويب AxioCam IC. لالتقاط الصور، انقر فوق محاذاة لفتح علامة تبويب جديدة بجوار علامة التبويب AxioCam IC التي تحتوي على الصورة.
لحفظ هذه الصورة الثابتة ، انقر فوق الملف ، وحدد حفظ باسم ، وحدد سطح المكتب على الشريط الموجود على اليسار لحفظ الملف على سطح المكتب ، وأدخل اسم الملف في مربع اسم الملف واحفظ الشكل بتنسيق ملف czi. لحفظ الصورة كمشاجرة، انقر فوق ملف، وحدد حفظ باسم، وأدخل اسم الملف في المربع اسم الملف. انقر فوق الزر حفظ كنوع وحدد tiff من القائمة المنسدلة.
قم بتغيير موضع شريحة الحجرة يدويا لالتقاط صورتين إلى ثلاث صور أخرى في نقاط أخرى من الجرح في نفس البئر. بعد التصوير ، قم بإزالة PBS من كل بئر وأضف ملليلتر واحد من وسط C2C12. قم بتجميع نظام الاستزراع المشترك لإدراج البئر عن طريق وضع الإدخالات التي تحتوي على خلايا O9-1 يدويا في كل بئر من بئر الغرفة.
ادفع الحشوات برفق لأسفل في البئر ، بحيث يقع الجزء السفلي من الملحق فوق خلايا C2C12 الأساسية مباشرة. أعد تركيبات إدخال البئر إلى الحاضنة واسمح للخلايا بالهجرة لمدة تسع إلى 12 ساعة. لتحديد وقت الترحيل الأمثل ، تحقق من الخلايا في ست ساعات بعد إنشاء الجرح ، ثم كل ساعتين إلى ثلاث ساعات بعد ذلك.
قم بإنهاء التجربة عندما تغطي الخلايا في ظروف التحكم الجرح بالكامل. ابدأ إنهاء فحص الترحيل وأدخل تفكيك النظام جيدا عن طريق إزالة إدخالات خلية O9-1 بعد تسع إلى 12 ساعة من فترة الترحيل. استنشاق بعناية وسط C2C12.
أضف 0.5 ملليلتر من PBS إلى آبار الغرفة والتقط صورا نهائية للخلايا بعد الهجرة. استنشاق بعناية جميع PBS مختلطة مع المتوسطة وإزالة الغرف البلاستيكية من آبار الغرفة باستخدام تعليمات عدة. ترك الشريحة الأساسية التي تحتوي على خلايا C2C12.
للتلطيخ المناعي ، احتضان الشريحة على الفور مع ألدهيد paraform 4 ٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإزالة بارافورمالدهيد واغسل الشريحة باستخدام 0.1٪ Triton X-100 الذي يحتوي على PBST لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد 15 دقيقة ، اسكب PBST واغسل الشريحة مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما.
ثم قم بإنشاء حدود كارهة للماء باستخدام قلم كاره للماء حول الشريحة لمنع انسكاب المحاليل من الشريحة لمنع تعطيل خلايا الالتصاق. بعد ذلك ، أضف ما يقرب من 0.5 ملليلتر من محلول حجب BSA بنسبة 1٪ إلى الشريحة داخل الحدود الكارهة للماء واحتضان الشريحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة منزلقة مرطبة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول الحجب وأضف الجسم المضاد phalloidin إلى هذه الشريحة داخل الحدود الكارهة للماء ، واحتضانها عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، ضع الشريحة في حامل منزلق محمي من التعرض للضوء. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة. أضف وسيط تركيب يحتوي على DAPI ، وقم بتركيب الشرائح بأغطية زجاجية والتقط الخلايا باستخدام مجهر مضان قياسي.
في هذه الدراسة ، أدت إضافة Wnt5a المؤتلف إلى آبار الاستزراع المشترك إلى تسريع هجرة الأرومة العضلية مع التعافي الكامل لبعض المناطق لمدة تسع ساعات. أظهرت الأرومات العضلية المهاجرة في جميع الحالات الثلاثة مورفولوجيا خلوية مهاجرة طبيعية ، بما في ذلك الفيلوبوديا جيدة التكوين والبارزة والصفيحيات والاستقطاب غير المتماثل لإسقاطات الأكتين الخلوية الهيكلية. تمت دراسة تأثير الباراكرين ل Wnt5a المشتق من NCC على هجرة الأرومة العضلية.
العلاج باستخدام 50 نانومولار سيرنا ضد Wnt5a قلل من التعبير الجيني Wnt5a بنسبة 64٪ مقارنة بالتحكم السلبي. أنقذت هجرة انفجارات C2C12 ميل مع انخفاض كبير بعد ضربة قاضية Wnt5a في NCCs وإضافة Wnt5a المؤتلف الخارجي هذا العجز المهاجر والعيب المورفولوجي في هذه الخلايا العضلية. من أجل فهم أفضل لآليات الخلايا المستقبلة للإشارة في نموذج paracrine ، تم هدم مستقبل ROR2 وتم تقليل التعبير الجيني بنسبة 54٪ ، مما يقلل من ضربة قاضية ROR2 في الأرومات العضلية من قدرتها على الهجرة على الرغم من وجود NCCs.
فشل Wnt5a المؤتلف الخارجي في إنقاذ هجرة الأرومة العضلية بعد ضربة قاضية ROR2 مما يشير إلى أن استنفاد ROR2 يعطل قدرة الخلايا العضلية على استقبال إشارات Wnt5a. الخلايا المستزرعة إلى خدش الكثافة الكافية مع طرف P10 مرة واحدة فقط تجميع وتفكيك نظام الاستزراع المشترك بعناية دون تعطيل الخلية الأساسية. تم استخدام هذه التقنية كدليل على المفهوم لدراسة محور إشارات جزيئية محدد داخل مسار Wnt / PCP المعقد مع أهمية لخلية القمة العصبية وبيولوجيا مجال القلب الثاني.
