طريقة معممة لتحديد تكوين حمض الفينوليك القابل للذوبان الحر والقدرة المضادة للأكسدة للحبوب والبقوليات. تشكل الحبوب الكاملة ، بما في ذلك الحبوب والبقوليات ، جزءا كبيرا من الوجبات الغذائية البشرية. منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأهميتها الغذائية للبشر.
ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن فوائدها الصحية الوقائية المضادة للأكسدة. تساهم الأحماض الفينولية الموجودة في طبقات الحبوب الخارجية للحبوب وطبقة بذور البقوليات في الخصائص المضادة للأكسدة للحبوب الكاملة. أنها تنقب عن الجذور الحرة التي تسبب أضرارا مؤكسدة للجزيئات الحيوية.
الفئتان من الأحماض الفينولية الموجودة في الحبوب الكاملة هما أحماض هيدروكسي بنزويك وأحماض هيدروكسي سيناميك. توفر هذه الدراسة طريقة بسيطة لاستخراج الأحماض الفينولية الكاملة للحبوب وتحديد قدرتها المضادة للأكسدة في المختبر. استخدم خمس عينات من الحبوب الكاملة لهذه الدراسة ، القمح القاسي ، الذرة الصفراء ، حبوب اللوبيا السوداء العين ، فول الصويا ، والفاصوليا الحمراء.
يزن بدقة 100 ملليغرام من عينة دقيق الحبوب الكاملة مباشرة في أنبوب طرد مركزي صغير بلون العنبر بسعة ملليلترين. يساعد اللون الداكن للأنبوب على منع تعرض الخليط للضوء. أضف ملليلتر واحد من الميثانول المائي بنسبة 80٪ إلى كل أنبوب من الأنابيب التي تحتوي على أمثلة.
دوامة لفترة وجيزة لخلط محلول الميثانول والعينة. سونيك العينات لمدة 60 دقيقة لاستخراج المركبات الفينولية القابلة للذوبان الحرة. ضع غطاء فوق العينات طوال مدة الصوتنة لمزيد من الحماية من الضوء.
بعد الصوتنة ، قم بالطرد المركزي للمخاليط عند 20،000 مرة G لمدة خمس دقائق لترسيب المخلفات الصلبة ، تاركا السوبرناتانت في الأعلى. ستكون المركبات الفينولية الحرة موجودة في supernatant بعد الطرد المركزي. يجب تصفية المادة الفائقة قبل حقنها في أداة HPLC.
لتصفية supernatant ، قم بإزالة مكبس حقنة 3 مل وإرفاق مرشح حقنة. يجب أن يكون حجم المسام للمرشح لا يزيد عن 0.22 ميكرومتر. ماصة حوالي 0.4 ملليلتر من supernatant في الجزء العلوي من حقنة.
أعد إدخال المكبس وادفع السائل عبر الفلتر إلى قارورة HPLC تحتوي على إدراج قارورة. بمجرد إعداد الأداة لتشغيل الطريقة الموضحة في المخطوطة لتحليل HPLC ، قم بتحميل القوارير في الدوار لتتوافق مع قائمة العينات. احصل على كروماتوجرامات HPLC عند 320 نانومتر و 280 نانومتر ، تظهر قمم متميزة تمثل مركبات فينولية مختلفة.
باستخدام منحنيات قياسية مناسبة ، قم بقياس أحماض الهيدروكسي سيناميك عند 320 نانومتر نظرا لأن لديها أقصى امتصاص عند هذا الطول الموجي. وفقا لنفس المبدأ ، حدد كمية أحماض هيدروكسي بنزويك عند 280 نانومتر. استخدم Trolox ، وهو نظير قابل للذوبان في الماء من فيتامين E ، كمعيار لتقدير قدرة مضادات الأكسدة في المختبر لمستخلصات الحبوب الكاملة.
يزن بدقة ملليغرام واحد من Trolox في أنبوب الصقر. تذوب مع أربعة ملليلترات من الميثانول المائي 50 ٪ لإعداد محلول مخزون من ملليمول واحد لكل لتر ، وهو نفس 1000 ميكرومول لكل لتر. قم بإعداد ستة تركيزات من Trolox هي 50 و 100 و 200 و 400 و 600 و 800 ميكرومول لكل لتر لرسم منحنيات قياسية لتقدير قدرة الكسح الجذري DPPH وقدرة مضادات الأكسدة المكافئة ل Trolox ، TEAC.
وبالمثل ، قم بإعداد تركيزات 6.25 و 12.5 و 25 و 50 ميكرومول لكل لتر Trolox لتقدير قدرة امتصاص الأكسجين الجذري ، ORAC. تشكل الحجم الإجمالي لكل تركيز إلى 500 ميكرولتر، كما هو موضح في الجدول الأول. تمييع مقتطفات العينة مع الميثانول قبل التحليل.
هنا ، تم تخفيف مستخلصات الذرة الصفراء واللوبيا مرتين. تم تخفيف مستخلصات القمح والفاصوليا خمس مرات ، في حين تم تخفيف مستخلص فول الصويا 10 مرات بالميثانول. يزن 8.23 ملليغرام من ABTS في أنبوب طرد مركزي كهرماني نظيف بسعة ملليلترين.
بعد ذلك ، يزن 1.62 ملليغرام من كبريتات البوتاسيوم في أنبوب طرد مركزي كهرماني صغير نظيف بسعة ملليلترين. قم بإذابة كل مادة كيميائية موزونة في ملليلتر واحد من الماء المقطر عن طريق الدوامة. ينتج عن ذلك محلول ABTS 16 ملليمولار ومحلول بيرسلفات البوتاسيوم ستة ملليمولار.
تحضير محلول مخزون ABTS عن طريق خلط محاليل ABTS وبيرسلفات البوتاسيوم بكميات متساوية. سوف يتغير الحل على الفور إلى لون داكن. اسمح لهذا الخليط بالاحتضان في الظلام لمدة 12 إلى 16 ساعة.
قم بتخفيف محلول مخزون ABTS 30 مرة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات 200 ملليمولار لتشكيل محلول عمل ABTS. للقيام بذلك ، أضف 58 ملليلتر من 200 ملليمول PBS إلى ملليلترين من حل عمل ABTS. سيحتوي محلول العمل على 0.27 ملليمولار ABTS و 0.1 ملليمولار بيرسلفات البوتاسيوم.
للتحليل ، ضع 10 ميكرولترات من كل مستخلص مخفف في 96 ميكروبليت بئر. أضف 190 ميكرولتر من محلول عمل ABTS إلى كل بئر واحتضنها لمدة 60 دقيقة. قياس امتصاص مخاليط التفاعل عند 750 نانومتر في قارئ الصفائح الدقيقة.
استخدم معايير Trolox بتركيزات تتراوح من 100 إلى 800 ميكرومول لكل لتر لرسم منحنى المعايرة. يتطلب فحص DPPH المضاد للأكسدة مركبا مولدا للجذور ، DPPH. قم بوزن 1.2 ملليغرام من DPPH في أنبوب طرد مركزي فارغ بسعة 15 ملليلتر.
يذوب DPPH في الميثانول لإعداد محلول ميكرومولاري 60. يختبر فحص DPPH قدرة مستخلصات العينة على مسح الجذور الحرة التي تنتجها DPPH. أضف خمسة ميكرولترات من مستخلص العينات إلى الآبار الصغيرة.
بعد ذلك ، أضف 195 ميكرولتر من محلول الميثانول DPPH 60 ميكرومولار واحتضانه لمدة 60 دقيقة. قياس الامتصاص عند 515 نانومتر. استخدم معايير Trolox لرسم منحنى المعايرة.
يوضح الشكل الأول بنية أحماض الهيدروكسي بنزويك الموجودة في الحبوب الكاملة. في هذه الدراسة الحالية ، كان حمض الفانيليك هو حمض الهيدروكسي بنزويك الوحيد الذي تم تحديده. يوضح الشكل الثاني بنية أحماض الهيدروكسي سيناميك الموجودة في الحبوب الكاملة.
في الدراسة الحالية ، تم تحديد أحماض p-coumaric و caffeic و ferulic في العينات. ويبين الجدول الثاني الأحماض الفينولية المحددة في العينات. كما ذكرنا سابقا ، كان حمض الفانيليك هو حمض الهيدروكسي بنزويك الوحيد الذي تم تحديده في العينات.
تم تحديده في مستخلص اللوبيا فقط. تم تحديد حمض الكافيين حمض الهيدروكسي سيناميك فقط في حبوب الكلى ، في حين تم تحديد حمض p-coumeric في الذرة الصفراء واللوبيا وفول الصويا. تم تحديد حمض الفيروليك في جميع العينات وكان حمض الفينوليك السائد في العينات.
كان التركيز الكلي للأحماض الفينولية بالترتيب من الأكبر إلى الأقل في ترتيب فول الصويا واللوبيا والذرة الصفراء والفاصوليا الكلوية أو ما يعادلها ، تليها القمح. ويبين الجدول الثالث إجمالي المحتوى الفينولي والقدرة المضادة للأكسدة للعينات. وشملت القدرة المضادة للأكسدة DPPH قدرة الكسح الجذري ، TEAC ، ORAC ، والقدرة المضادة للأكسدة الكلية للعينات.
إجمالي القدرة المضادة للأكسدة هو مجموع قيم DPPH و TEAC و ORAC. على غرار الجدول الثاني ، كان لفول الصويا أعلى قدرة مضادة للأكسدة. ومع ذلك ، بدلا من اللوبيا ، كانت الفاصوليا الكلوية هي التي لديها ثاني أعلى قدرة مضادة للأكسدة ، على الرغم من أن اللوبيا لديها ثاني أعلى محتوى إجمالي من حمض الفينول.
يرتبط هذا الشذوذ بهياكل الأحماض الفينولية الفردية والتأثير العدائي المحتمل لحمض الفانيليك حمض الهيدروكسي بنزويك على الآثار المضادة للأكسدة لأحماض الهيدروكسي سيناميك في اللوبيا. خلصت هذه الدراسة إلى أن الحبوب الكاملة تختلف في تركيبات حمض الفينول. من بين الحبوب الكاملة التي تمت دراستها ، يحتوي فول الصويا على أعلى كمية إجمالية من الأحماض الفينولية ، وفي المقابل ، أعلى قدرة مضادة للأكسدة.
