وهذا البروتوكول هام لأنه يساعد في فهم المستحضرات الدوائية من الإيثانول في تطوير أجنة حمار وحشي وهذا سيساعد على توحيد أنظمة التعرض الإيثانول في دراسات حمار وحشي. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي أنها تسمح للباحثين بقياس مستويات الإيثانول بسرعة وتكاثر خلال النمو الجنيني ، خاصة في الأجنة التي لا تتوفر فيها إمدادات الدم. ويمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة على أنظمة نماذج أخرى، فضلا عن العوامل البيئية الأخرى بافتراض التقنية المناسبة وإعداد المعدات.
أتوقع من الأفراد الذين يؤدون هذا البروتوكول للمرة الأولى أن يكافحوا بالسرعة اللازمة لمنع تبخر الإيثانول أثناء معالجة الأجنة. تبدأ من خلال نقل 10 أجنة مع السوائل الجنينية اضافية في 1.5 ملليلتر microcentuge أنابيب ملحوظ مع خط في حجم 250 ميكرولترات. إضافة الماء إلى خط التعبئة.
إعداد أنابيب إضافية microcentrifuge لعينات مفكك. لإزالة المشيم، احتضان الأجنة في طبق بيتري 100 ملليمتر مع ملليغرامين لكل ملليلتر من كوكتيل البروتياز في وسائل الإعلام الجنين لمدة 10 دقائق. دوامة بلطف الطبق كل بضع دقائق لكسر المشيمة.
مرة واحدة كل الأجنة خالية من المشيمة، وإزالتها من كوكتيل البروتيز وغسلها مرتين مع وسائل الإعلام الطازجة. ثم نقل الأجنة إلى طبق جديد 100 ملليمتر. عندما تكون جميع العينات جاهزة لقياس الحجم، استخدم p200 micropipette مع أصغر طرف ممكن لإزالة جميع السوائل بعناية من جميع أنحاء الأجنة.
وزن الماء مع مقياس مع أقل من 0.1 مليغرام الدقة، ثم تحديد حجم الأجنة 10 عن طريق طرح وزن المياه إزالتها من 250 ميكرولترات. لتحديد حجم جنين واحد، قم بتقسيم الفرق على 10. جمع الأجنة من خزانات التزاوج ووضعها في طبق بيتري معيار 100 ملليمتر ثم احتضان الطبق في 28.5 درجة مئوية.
في ست ساعات بعد الإخصاب، نقل ما يصل إلى 100 جنين إلى طبق جديد مع وسائل الإعلام الجنين و 1٪ الإيثانول أو وسائل الإعلام وحدها. تغطية ولكن لا لختم أطباق بيتري ووضعها في حاضنة درجة 28.5 درجة مئوية لمدة 18 ساعة أو حتى تصل إلى 24 ساعة بعد الإخصاب. استخدام اثنين من micropipettes P200 تعيين إلى 50 ميكروليتر وpireate حل كوكتيل protease في واحد والماء في الثانية.
ثم ضع بسرعة 10 أجنة في أنبوب ميكروسنتروج 1.5 ملليلتر باستخدام ماصة زجاجية وإغلاق الغطاء. كرر هذه العملية لجميع العينات التي سيتم اختبارها، والضوابط والايثانول المعالجة الأجنة. العمل مع عينة واحدة في وقت واحد، وفتح بسرعة الغطاء وpirate جميع وسائل الإعلام الجنين المتبقية مع p200 micropipette تعيين إلى 200 ميكرولترات.
بسرعة ولكن بلطف إضافة وإزالة 50 ميكرولترers من الماء، ثم إضافة 50 ميكرولترers من كوكتيل البروتياز وإغلاق غطاء أنبوب. السماح للعينة الجلوس لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم إضافة بسرعة 450 ميكرولتردات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس وإغلاق غطاء أنبوب. التجانس العينة عن طريق دوامة لمدة 10 دقائق ونقل اثنين من ميكرولترات من عظمى إلى قارورة الكروماتوغرافيا الغاز.
ختم القارورة مع غطاء متعددtetrafluoroethylene. بعد إكمال أسلوب بدء التشغيل تحميل 436 الإيثانول SPME الحالي تشغيل RG 2 إلى خمس دقائق. الميث من القائمة أساليب في برنامج تحليل لكل عينة في قائمة العينة.
ملء قائمة العينة بدءا من الهواء والماء، وخمسة الصوديوم كلوريد الصوديوم الخلآيات كوكتيل. ثم أدخل في معايير الإيثانول في النظام من 0.3125 إلى 40 ملليمولار. اتبع المعايير مع الجولة الثانية من الفراغات.
أدخل جميع عينات الأجنة المتجانسة الفائقة ليتم اختبارها من أدنى إلى أعلى تركيز الإيثانول المتوقع والانتهاء من خلال إدخال جولة ثالثة من الفراغات. إضافة قوارير الكروماتوغرافيا الغاز إلى autosampler في الترتيب الذي تم إدخال العينات والسماح لهم لتدفئة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم بدء تشغيل نموذج باستخدام البرنامج.
بعد اكتمال كافة عمليات التشغيل، قم بتنشيط أسلوب إيقاف التشغيل عن طريق إضافة عينة نهائية في قائمة العينات وتشغيل standby.meth. النسخ احتياطي لكافة البيانات التي تم الحصول عليها أثناء تشغيل نموذج. بمجرد اكتمال طريقة إيقاف التشغيل، انقر فوق الكروماتوغرام المفتوحة وفتح المجلد مع النتائج.
يتم دمج العينات تلقائيا في هذا البرنامج. في النتائج، تأكد من أن القمم الصحيحة قد تم دمجها. بمجرد تأكيد جميع العينات، طباعة أو تصدير النتائج.
رسم ذروة ارتفاع معايير الإيثانول على الرسم البياني، ثم حساب قيم الميل، تقاطع y، و r تربيع القيم. الحصول على قيمة الإيثانول لكل عينة عن طريق طرح ذروة ارتفاع العينة من تقاطع y للمعايير وتقسيم هذه القيمة على ميل المعايير. لحساب تركيز الإيثانول في الأجنة، حساب عامل التخفيف لكل عينة وضرب قيمة الإيثانول العينة بواسطة عامل التخفيف هذا.
وأخيراً، حساب عينات مراجع الوسائط بضرب قيمة الإيثانول الإعلامي بعامل تخفيف قدره 10. لحساب تركيزات الإيثانول الجنينية بشكل صحيح، تم قياس كميات الأجنة في المشيمية الخاصة بها وإزالتها من الكورال الخاصة بها. في هذا التحليل، شكل الجنين 56٪ من الحجم الإجمالي داخل المشيمية.
واستناداً إلى العمل المنشور سابقاً، تم استخدام 73.6٪ كمحتوى مائي جنيني لجميع التحليلات المقدمة. وأدى ذلك إلى أن يكون الماء 0.82 ميكرولترات من 1.1 ميكرولترات من حجم الجنين. من إجمالي حجم المياه، 49٪ موجود في الجنين و 51٪ في السائل خارج الجسم.
وبالنسبة لتحليل الكروماتوغرافيا الغازية، تم تحليل مجموعتين من 15 عينة ووسائط الإعلام التي عولجت بها قياسها خمس مرات لكل مجموعة. وكانت مستويات الإيثانول الإعلامي 143.6 ملليمولار للمجموعة الأولى و133.6 ملليمولار للمجموعة الثانية. وبلغ متوسط تركيزات الإيثانول في الأجنة 63.5 ملليمولار و 53.1 ملليمولار للمجموعتين الأولى والأخرى على التوالي.
تم حساب نسبة تركيز الإيثانول الجنيني إلى مستويات الإيثانول في كل عينة من وسائل الإعلام. المجموعة الأولى كان لديها 44٪ من مستويات الإيثانول الإعلامي بينما كان لدى المجموعة 40٪ من مستويات الإيثانول الإعلامي. تم قياس الأجنة التحكم غير المعالجة في تركيز الإيثانول وسائل الإعلام صفر ميليمولر.
أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو أن معالجة الأجنة لتحليل GC بشكل صحيح أمر بالغ الأهمية لأن الإيثانول متطاير وسوف يتبخر بسرعة. يتم وصف أفضل طريقة لتنفيذ هذه الخطوة، ولكن يجب أن تمارس لتطوير الذاكرة العضلية المناسبة. وسيساعد هذا الإجراء على توحيد نظم معالجة الإيثانول في أسماك الحمار الوحشي والسماح للعمل في المستقبل بتشريح الآليات الوراثية والخلوية لتهيّر الإيثانول.
